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Artigo de método

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

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DOI:

10.3791/60043

⸱

25 de setembro de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Resumo

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma questão de saúde global. Com mais de 350 milhões pessoas afetadas em todo o mundo, a infecção pelo HBV continua sendo a principal causa de câncer hepático. Esta é uma grande preocupação, especialmente nos países em desenvolvimento. A falha do sistema imunitário para montar uma resposta eficaz de encontro ao HBV conduz à infecção crônica. Embora a vacina HBV está presente e novos medicamentos antivirais estão sendo criados, a erradicação das células de vírus-reservatório continua a ser um grande tema de saúde. Descrito aqui é um método para a geração de antígeno viral (AG)-linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos (CTLs) derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) (ou seja, IPSC-CTLs), que têm a capacidade de suprimir a replicação do HBV. A replicação de HBV é induzida eficientemente nos ratos através da injeção hidrodinâmico de um Plasmid da expressão de HBV, de paav/HBV 1.2, no fígado. Então, a superfície de HBV AG-específico iPSC-CTLs do rato é transferida adoptivamente, que suprime extremamente a replicação de HBV no fígado e no sangue assim como impede a expressão da superfície AG de HBV nos hepatocytes. Este método demonstra a replicação de HBV nos ratos após a injeção hidrodinâmico e que os CTLs AG-específicos virais derivado da pilha de haste podem suprimir a replicação de HBV. Este protocolo fornece um método útil para a imunoterapia de HBV.

Introdução

Após a infecção aguda, o sistema imunológico adaptativo (i.e., imunidade humoral e celular) controla a maior parte da hepatite aguda relacionada ao HBV. Ainda, um número de povos nas regiões HBV-endêmicas não pode eliminar os vírus e subseqüentemente converter como indivíduos crônicos. Mais de 25% dos pacientes crônicos (> 250 milhões de pessoas) em todo o mundo desenvolvem doença hepática progressiva, resultando em cirrose hepática e/ou carcinoma hepatocelular (HCC)1. Como resultado, a erradicação de células insistentemente infectadas permanece um problema geral de salubridade, embora haja uma vacina disponível2 e inúmeros medicamentos antivirais estão em desenvolvimento. O tratamento padrão para a infecção pelo HBV inclui análogos de IFN-α, nucleósidos e nucleotídeo. Estes agentes têm a atividade antiviral direta e capacidades modulatórias imunes. No entanto, a soroconversão do antígeno de HBe (AG)+ portadores com anticorpo anti-HBe (AB) e a perda de ácido deoxirribonucleico do HBV SÉRICO (DNA) aparecem individualmente em aproximadamente 20% dos pacientes tratados, e o controle imunológico total do vírus verificada pela privação do HBsAg não é superior a 5%3. Além disso, a resposta ao tratamento muitas vezes não é durável. A vacinação profiláctica com HBs recombinante AG é altamente eficaz em impedir a infecção, mas a vacinação terapêutica de HBs Ag não é eficaz. Claramente, as respostas imunes mediadas por células T desempenham um papel crítico no controle da infecção pelo HBV e comprometimento hepático; no entanto, em pacientes com hepatite crônica, as células T HBV-reativas são freqüentemente excluídas, disfuncionais ou convertem exaustos4,5,6. Consequentemente, em indivíduos com infecção persistente por HBV, nenhuma tentativa de restabelecer a imunidade específica do HBV (i.e., imunidade à base de células T) por meio de remédio antiviral, citocinas imuno-modulatórias ou imunização curativa alcançaram sucesso.

A transferência celular adotiva (Act) de células T específicas do HBV AG é um tratamento eficiente direcionado para eventualmente erradicar os hepatócitos remanescentes wih HBV7,8. O ato de CTLs HBV-específicos em ratos HBV-contaminados foi mostrado para causar a hepatite transiente, suave, e uma gota dramática em transcritos do ácido ribonucleico de HBV (RNA) nos hepatocytes. Nesses estudos, a CTLs não inibiu a transcrição dos genes do HBV, mas melhorou a degradação das transcrições do HBV9. As CTLs específicas do HBV são importantes para prevenir a infecção viral e mediar a depuração do HBV10,11. Para remédios baseados em ato, a expansão in vitro de células T específicas do HBV com alta reatividade para a reinstalação in vivo tem sido sugerida como um método ideal12,13,14; no entanto, as abordagens atuais são restritas em relação às suas habilidades para gerar, separar e cultivar quantidades e qualidades apropriadas de células T específicas do HBV de pacientes para as terapias potenciais.

Embora os ensaios clínicos apresentem segurança, praticidade e atividade terapêutica prospectiva de tratamentos à base de células por meio de células T projetadas que são específicas para hepatócitos infectados pelo vírus HBV, há preocupações sobre os efeitos desfavoráveis ocorrendo das respostas auto-imunes por causa do cross-Reactivity doreceptor de célulaT de misemparelhamento (TCR)15,16, reconhecimentodo AG do fora-alvo pelo TCR17 não específico e em-alvo fora-toxicidade por um receptor quimérico de AG (carro) 18 anos de , 19 com tecidos saudáveis. Atualmente, as células T geneticamente modificadas, que só têm persistência a curto prazo in vivo, são geralmente células T intermediárias ou posteriores. Até o momento, as células-tronco pluripotentes (PSCs) são a única fonte disponível para gerar alto número de células T ingênuas de tipo único AG-específico20,21,22,23. Os PSCs induzidos (iPSCs) são convertidos simplesmente das pilhas somáticas de um paciente com o uso da transdução do gene de diversos fatores da transcrição. Como resultado, os iPSCs apresentam características semelhantes às das células-tronco embrionárias (ESCs)24. Devido à flexibilidade e possibilidade para a capacidade infinita de autorenovar, além da reposição tecidual, tratamentos baseados em iPSC podem ser amplamente aplicados na medicina regenerativa. Além disso, os regimentos subjacentes iPSCs podem substancialmente melhorar terapias Cell-Based atuais.

O objetivo geral deste método é gerar uma grande quantidade de CTLs específicos do HBV de iPSCs (ou seja, iPSC-CTLs) para imunoterapia baseada em ACT. As vantagens sobre técnicas alternativas são que iPSC-CTLs específico do HBV têm um único-tipo TCR e phenotype ingênuo, que conduz a mais desenvolvimento da pilha de T da memória após o ato. É demonstrado que o ACT de iPSC-CTLs específicos do HBV aumenta a migração de células T CD8+ funcionais no fígado e reduz a replicação do HBV em ambos os fígados e sangue de camundongos administrados. Este método revela um uso potencial de iPSC-CTLs AG-específicos virais para a imunoterapia de HBV e pode ser adaptado para gerar outras pilhas AG-específicas virais de iPSC-T para a imunoterapia viral.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade do Texas a & M (IACUC; #2018-0006) e são conduzidos em conformidade com as diretrizes da Associação para a avaliação e acreditação de cuidados com animais de laboratório. Os camundongos são usados durante 6 – 9 semanas de idade.

1. geração de células de t CD8+ específicas virais AG de iPSCs (células t IPSC-CD8+ )

  1. Criação dos construtos retrovirais
    Nota: os genes TCR α e β estão ligados à sequência de autoclivagem 2A. O vetor retroviral mscv-ires-dsred (MIDR) é dsred+ 23.
    1. Subclone HBs183-191 (flltrilti)-específico a2-restrito humano-murine híbrido TCR (s183 TCR) genes (vα 34 e Vβ28) no MIDR para criar a construção de MIDR S183 (Figura 1a)25.
  2. Transdução anti-retroviral
    Nota: as células Platinum-E (Plat-E) são utilizadas para a embalagem de retrovírus (portadores de genes TCR s183), que serão utilizados para a transdução anti-retroviral. As pilhas de plat-E são as pilhas de empacotamento eficazes do retrovírus que são subjacentes às pilhas 293T, que foram desenvolvidas por meio das construções de empacotamento originais através do promotor EF1α para expressar a proteína retroviral da estrutura, incluindo a mordaça, o pol, e o env ecotropic.
    1. Em um prato da cultura de 100 milímetros, sementes 3 x 106 Plat-E pilhas em 8 ml do meio de cultura de DMEM que contem o soro fetal da vitela de 10% (FCS) em uma incubadora em 37 ° c com 5% co2, 1 dia antes do transfection.
    2. No dia 0, transfecção a construção de s183 MIDR nas pilhas de plat-E usando um reagente25do transfection do ADN.
    3. No dia 1, semente 1 x 106 iPSCs (GFP+) em uma placa de cultura pré-revestida de gelatina.
    4. Nos dias 2 – 3, colete o sobrenadante contendo retrovírus da cultura de células Plat-E para transduce iPSCs com o s183 TCR na presença de solução de 1,6-dibromohexano25.
    5. No dia 4, Trypsinize o s183 TCR gene-transfoiado iPSCs, centrifugador em 400 x g para 5 minutos e semente 3 × 105 iPSCs em um prato da cultura de 100 milímetros pré-revestido com 3 x 106 pilhas de alimentador SNL76/7 (irSNL76/7) irradiados25.
    6. No dia 5 ou 6 de confluência, Trypsinize as células, centrífuga em 400 x g por 5 min e processo de triagem celular. Gating em pilhas vivos, classifica GFP e DsRED pilhas dobro-positivas (os iPSCs gene-transduados de s183 TCR) usando um classificador de alta velocidade da pilha. Similar à etapa 1.2.5, coculture as pilhas classificadas em irSNL76/7 pilhas do alimentador para o uso futuro25.
  3. Diferenciação de células T iPSC-CD8+ específicas do HBV
    Nota: as pilhas stromal OP9-DL1/DL4 sobre-expressão ambos os ligantes do entalhe DL1 e DL4, e cocultivando iPSCs com os iPSCs podem promover a diferenciação sinalização-negociada entalhe da pilha de T26.
    1. Cultivar s183 TCR (s183/iPSCs) em monocamada de células OP9-DL1-DL4 em meio médio essencial (MEM) contendo 20% de soro bovino fetal (FBS)27. Inclua murino Flt3 ligante (mflt-3L; concentração final = 5 ng/ml) na cultura.
    2. No dia 0, semente 0,5 – 1,0 x 105 S183/iPSCs em um prato de cultura de 10 cm previamente cultivado com células OP9-DL1-DL4. Valide que as células OP9-DL1-DL4 estão em uma condição de confluência de 80% – 90%.
    3. No dia 5, enxágüe os iPSCs com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS), Aspire o PBS, acrescente-o a 4 mL de 0,25% de tripsina e incubar em uma incubadora de 37 ° c por 10 min. depois, adicione um adicional de 8 mL de mídia iPSC para acabar com a digestão de tripsina. Acumule todas as soluções digestivas contendo as células e Centrifugue a 400 x g por 5 min a 15 – 30 ° c.
    4. Aspirar o sobrenadante e suspender as células em 10 mL de meios de comunicação iPSC. Transfira a suspensão celular para uma nova placa de Petri de 10 cm e incubar em uma incubadora por 30 min a 37 ° c.
    5. Após 30 min, colete a mídia iPSC contendo as células flutuantes. Passe a suspensão da célula através de um filtro de células de 70 μm e calcule o número da célula.
    6. Sementes 5 x 105 células no prato de cultura previamente cultivadas OP9-DL1-DL4 células com uma condição de 80% – 90% confluente como descrito na etapa 1.3.1.
      Nota: para diferenciação de células T, cada 2 – 3 dias, as células derivadas de iPSC precisam re-SEED com uma camada fresca das células OP9-DL1-DL4.
  4. Avaliação
    1. Alterações morfológicas de diferenciando iPSCs
      1. Observe as células um microscópio em vários dias.
        Nota: no dia 5, as colônias têm características mesoderma-like, exibindo uma morfologia clássica da eixo-forma que assemelha-se aos fibroblasto dérmicos humanos e ao crescimento sustentado in vitro. No dia 8, pequenos aglomerados redondos de células começam a aparecer.
    2. Análise de diferenciando iPSCs por citometria de fluxo
      1. Em vários dias de cocultura, analisar células derivadas de iPSC como descrito anteriormente25 (Figura 1B, C).
    3. Análise funcional de diferenciando iPSCs
      1. No dia 28 da cocultura, colete células T iPSC-CD8+ de culturas através da colheita das células flutuantes, Trypsinize as células remanescentes com 0,25% tripsina, re-suspender em 8 ml de mídia IPSC, centrifugar por 5 min em 400 x g em 15-30 ° c, retire a mídia, em seguida, ressuscite as células em 10 mL de mídia.
      2. Mantenha as pilhas re-suspendidas em um prato fresco de 10 cm em uma incubadora de 37 ° c por 30 minutos e monte as pilhas de flutuação. Em seguida, lave as células um vezes com um PBS frio.
      3. Incubar 3 x 106 T células-empobrecido esplenócitos (CD4-CD8-) de baços de H-2 classe I knockout, HLA-a 2.1-transgenic (HHD) camundongos com 5 μm s183 peptídeo (flltrilti) em 200 μL de mídia a 4 ° c por 30 min.
      4. Produza uma mistura de células t de IPSC-CD8+ com esplócito pulsado com peptídeo s183 (células t: esplenócitos = 1:4; Use 0,75 x 106 células t). Incubar a mistura de células a 37 ° c em uma incubadora de CO2 para 40 h. Durante os últimos 7 h, adicione 4 μL de brefeldin A diluído na cultura (concentração final de 1.000 x, que será diluída em meios de cultura 1x) para bloquear os processos de transporte durante a ativação celular.
      5. Manchar as células e realizar a análise citométrica do fluxo de IFN-γ intracelular como descrito anteriormente (Figura 2).

2. indução da replicação do HBV através da entrega hidrodinâmica de plasmídeo VHB

Nota: a construção de pAAV/HBV 1.2 foi gerada como descrita previamente9. O DNA completo do HBV 1,2 é incorporado no vetor pAAV.

  1. Entregas hidrodinâmicas de plasmídeo VHB através da veia cauda
    1. Aqueça camundongos HHD usando uma lâmpada de calor por 5 min na gaiola, a fim de dilatar a veia cauda.
    2. Deter o animal por meio de um refreador, e as caudas limpas do rato com 70% de spray de etanol.
    3. Entrega de plasmídeo no fígado.
    4. Meça o peso corporal do mouse usando uma escala de medição.
    5. Diluir 10 μg de plasmídeo VHB no equivalente a 8% de PBS em massa corporal (por exemplo, 1,6 mL para um rato de 20 g). Carregue o plasmídeo diluído numa seringa de 3 mL com uma agulha hipodérmica de 26 G × 1⁄2"(0,45 × 12 mm).
    6. Localize uma das duas veias da cauda lateral no terço médio da cauda e posicione a agulha em qualquer veia lateral. Administrar a injeção contendo plasmídeo VHB através da veia cauda dentro de 3-5 s.
  2. Quantificação da viremia do soro sanguíneo de camundongos infectados
    Nota: a replicação do HBV ocorre a partir do dia 3 – 35 no soro do rato. Os picos de replicação de DNA no dia 7 e reduz gradualmente. O DNA do HBV não é liberado do soro até o dia 35.
    1. Coleção do soro de sangue dos ratos contaminados
      1. Colete aproximadamente 0,1 mL de sangue em um tubo de microcentrífuga de cada mouse em 3, 5, 7 e 10 dias após a infecção por sangramento retroorbital em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, em seguida, incubar à temperatura ambiente (RT) por 20 min.
      2. Centrifugue a amostra a 6.000 x g durante 15 min a 4 ° c e colete o sobrenadante sérico após a centrifugação.
    2. Purify o ADN do soro de sangue usando um jogo comercialmente disponível da extração do ADN que segue as recomendações do fabricante. Resumidamente, lyse as células em uma coluna à base de sílica, executar as lavas, e extrair o DNA, acrescentando 100% etanol para a coluna de eluição e centrifugação em 6000 x g por 1 min. elute o dna em 50 μL de água RNase-livre.
    3. Use 100 ng de DNA de HBV da eluição para a análise do PCR do tempo real. Use os seguintes primers e sondas: forward 5 ' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3 '; Reverse 5 ' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3 '; sonda 5 ' TCACCTCTGCCTAATC 3 '.
      1. Use o genoma do HBV contendo plasmídeo (pAAV/HBV 1.2) para a curva padrão e realize PCR em tempo real em um volume total de 10 μL (Figura 3).
    4. Configure a reação de PCR em um volume total de 10 μL, conforme mostrado na tabela 1.
    5. Configurar o programa do PCR no termociclador como mostrado na tabela 2. A taxa de transição programada da temperatura é 20 ° c/s para a desnaturação/recozimento e 5 ° c/s para a extensão. Meça a fluorescência na extremidade da fase de recozimento para cada ciclo para a monitoração do PCR do tempo real.

3. redução da replicação do HBV por ACT de células T de iPSC-CD8+ específicas virais AG

  1. Transferência de células adoptivas (ACT)
    1. Diferenciar s183/iPSCs (1.3.7) sobre as células OP9-DL1-DL4 estromal na presença de mFlt-3L e mIL-7 por 8 dias, conforme descrito na seção 1,3.
    2. No dia 22, colete células T iPSC-CD8+ da placa de 10 cm com tripsina, em seguida, lave e ressuscite cada placa de 10 cm em 10 ml de mídia fresca. Adicione as pilhas a uma placa fresca de 10 cm e retorne à incubadora por 30 minutos como feito na seção 1,3. Após 30 min, colete células flutuantes.
    3. Use um filtro de nylon de 70 μm para passar as células para eliminar clusters de células e contar o número da célula. Adapte as células a uma concentração de 1,5 x 107 células/ml em solução de PBS a frio e use um filtro de nylon de 70 μm para passar as células para eliminar clusters de células novamente, se necessário. Mantenha as células no gelo até o ACT.
    4. Injete 200 μL de suspensão celular (3 x 106 células) em camundongos HHD de 4 – 6 semanas de idade através da veia cauda.
  2. Indução da replicação do HBV
    1. No dia 14 após a transferência celular, realize a entrega hidrodinâmica do plasmídeo VHB através da veia cauda, conforme descrito na seção 2,1.
  3. Detecção de proteínas de vírus do fígado infectado
    1. Sacrifique camundongos nos dias 3, 5, 7, 14 e 21 pós-infecção. Para a eutanásia, em cada gaiola, use 1 – 2 L de dióxido de carbono (CO2) na primeira etapa. Quando o animal desenvolve a perda de consciência, ganhe a taxa de fluxo de CO2 em torno de 4 – 5 L/min. Realize a eutanásia do rato usando a inalação do co2 .
    2. Separe o fígado cortando a pele da superfície do peritônio que utiliza tesouras e fórceps e arrastando ligeiramente o fígado para trás para descobrir a pele interna que alinha a cavidade peritoneal. Colete e corte amostras de fígado (comprimento x largura x altura = 0,5 cm x 0,5 cm X 0,3 cm) dos camundongos infectados para caber facilmente na gaveta de incorporação e bloco em formalina tampão neutro de 10% para 4 – 24 h.
    3. Descalcificar o fígado samplesusing 2,5 M ácido fórmico; Enxaguar em xileno por 3 min, enxaguar 2x em 100% etanol, enxaguar 2x em 95% etanol, enxaguar 2x em água deionizada (DI) por 2 min, em seguida, descalcificar as amostras de fígado em 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) correspondentemente. Manusear a uma temperatura de sub-ebulição (90 ° c) durante 20 min.
    4. Resfrie os tecidos fixos do fígado por 30 min. Enxague os tecidos com 1X PBS por 4 min e incorpore os tecidos em parafina. Desidratar os tecidos em uma série de concentrações crescentes de etanol para substituir a água, e depois mergulhar na imersão de xileno. Incorporar os tecidos infiltrados em blocos de cera. Faça o corte uniformemente vertical e horizontal para manchar. Prepare secções de 4 μm com um micrótomo deslizante.
    5. Passar as seções através da desparaffinização e reidratação usando xileno e etanol, em seguida, executar a coloração imunofluorescente das seções.
    6. Manchar as secções com 200 μL de anticorpos específicos para a superfície do HBV (1:100 diluição na solução de bloqueio). Incubar as seções com o anticorpo para 2 h em RT em uma câmara umidificada de 75% – 100%, e lave 5x em 1X PBS por 5 min.
    7. Use um reagente anti-fade contendo 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para coloração nuclear para neutralizar as lâminas. Adicione a lamínula com cerca de 300 μL da solução de coloração DAPI diluída (300 nM em 1X PBS) e valide toda a cobertura coberta. Mantenha os slides no escuro a 4 ° c até a inspeção um microscópio fluorescente.
  4. Infiltração de células inflamatórias em camundongos infectados
    1. Sacrifique camundongos como descrito na etapa 3.3.1. Colete o fígado e faça seções conforme descrito na etapa 3.3.4.
    2. Manchar a seção com hematoxilina e eosina (H & E) para avaliar a infiltração de células inflamatórias no fígado.
    3. Armazene corrediças no escuro em 4 ° c até uma análise mais adicional um microscópio fluorescente.
    4. Visualize slides um microscópio de fluorescência para detectar a infiltração de células inflamatórias no fígado (Figura 4).
  5. Deteção do ADN de HBV do fígado contaminado
    1. Isolamento do DNA viral.
    2. Eutanizar camundongos e recolher as amostras de fígado de acordo com a seção 3,3.
    3. Lyse os tecidos hepáticos no tampão de Lise Nonindet P-40 (NP-40) (50 mM TRIS-HCL, 1 mM EDTA, 1% NP-40) contendo um cocktail inibidor da protease.
    4. Centrifugue momentaneamente em 16.000 x g para remover os núcleos e os restos da pilha.
    5. Incubar o lisado citoplasmático com nuclease micrococcal (nuclease S7; 150 unidades/mL) e CaCl2 (5 mm) a 37 ° c por 90 min para degradar o ácido nucleico fora dos nucleocapsídeos (NCS).
    6. Inative a nuclease S7 pela adição de 10 mM de EDTA.
    7. Precipeie os nucleocapsídeos com polietileno glicol (PEG), interrompa por 0,5% Dodecil sulfato de sódio (SDS), e digerir com 0,6 mg/ml proteinase K (PK) a 37 ° c por 1 h.
    8. Recupere os ácidos nucleicos virais pela extração de clorofórmio fenol e precipitação de etanol.
    9. Resolva o DNA viral extraído em um gel de agarose de 1,2% e detecte pela análise padrão do Southern blot usando uma sonda de DNA HBV com rótulo de32 P.

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Resultados

Como mostrado aqui, as células de T de iPSC-CD8+ específicas do HBV viral AG são geradas por um sistema de cultura in vitro. Após o ato destas pilhas AG-específicas virais de T IPSC-CD8+ suprimir substancialmente a replicação de HBV em um modelo murino (arquivo suplementar 1). Os IPSC do rato são transfomeados com a construção retroviral de MIDR que codifica um gene híbrido do HBV TCR do humano-rato (HBS183-191-specific, s183), a seguir os iPSCs gene-transvados são cocult...

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Discussão

Este protocolo apresenta um método para gerar o IPSC-CTLs AG-específico viral para o uso como o ato para suprimir a replicação de HBV em um modelo murino. Na infecção crônica por HBV, o genoma viral forma um mini cromossomo estável, o DNA circular covalentemente fechado (cccDNA) que pode persistir ao longo da vida útil do hepatócito. Alvejar o afastamento do mini cromossoma viral pode conduzir a uma cura da infecção crônica de HBV. A terapia antiviral atual visa a transcriptase reversa do vírus, mas raramente estabelece ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores agradecem o Dr. Adam J Gehring do Instituto de pesquisa do hospital geral de Toronto para fornecer cDNA para HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-específico a2-restringiu genes TCR híbridos humanos-murine, e Dr. Pei-Jer Chen da Universidade Nacional de Formosa para fornecer construção de pAAV/HBV 1,2. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de saúde Grant R01AI121180, R01CA221867 e R21AI109239 para J. S.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos HHDInstitut Pasteur, Paris, FrançaNocaute H-2 classe I, camundongos HLA-A2.1-transgênicos (HHD)
iPS-MEF-Ng-20D-17RIKEN Cell BankAPS0001
SNL76/7ATCCSCRC-1049
OP9ATCCCRL-2749
pAAV/HBV1.2 plasmídeoDr. Dr. Pei-Jer Chen (Hospital Universitário Nacional de Taiwan, Taiwan)Construção de DNA do HBV
HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) genes TCR específicosDr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canadá)Genes TCR híbridos humano-murinos restritos a A2 específicos de FLLTRILTI (V &alfa; 34 e Vβ 28)
OVA257– Genes TCR específicos para 264Dr. Dario A. Vignali (Universidade de Pittsburgh, PA)Genes TCR restritos a H-2Kb específicos do SIINFEKL
Anticorpo anti-CD3 (17A2)Biolegend100236
Anticorpo anti-CD44 (IM7)BD Pharmingen103012
Anticorpo anti-CD4 (GK1.5)Biolegend100408
Anticorpo anti-CD8 (53-6.7)Biolegend
Anti-IFN-&gama; (XMG1.2) anticorpoBiolegend505810
Anti-TNF-a (MP6-XT22) anticorpoBiolegend506306
α-MEMInvitrogenA10490-01
Anti-HBs AnticorpoThermo FisherMA5-13059
ACK Tampão de liseLonza10-548E
Brefeldin ASigmaB7651
DMEMInvitrogenABCD1234
FBSHycloneSH3007.01
FACSAria Classificador de células de fusãoBD656700
GelatinaMilliporeSigmaG9391
GeneJammerAgilent204130
HLA-A201-HBs183-91-PE pentâmeroProimuneF027-4A - 27
Anticorpo secundário anti-rato HRPInvitrogenA27025
mFlt-3LPeprotech250-31L
mIL-7Peprotech217-17
Nuclease S7Roche10107921001
ParaformaldeídoMilliporeSigmaP6148-500GCuidado: Alergênico, carcenogênico,
tóxico Tampão de permeabilizaçãoBiolegend421002
PolybreneMilliporeSigma107689
ProLong™ Mountant Antifade Dourado com DAPIInvitrogenP36931
QIAamp MinElute Virus Spin KitQiagen57704
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