Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.
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Artigo de método
Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma questão de saúde global. Com mais de 350 milhões pessoas afetadas em todo o mundo, a infecção pelo HBV continua sendo a principal causa de câncer hepático. Esta é uma grande preocupação, especialmente nos países em desenvolvimento. A falha do sistema imunitário para montar uma resposta eficaz de encontro ao HBV conduz à infecção crônica. Embora a vacina HBV está presente e novos medicamentos antivirais estão sendo criados, a erradicação das células de vírus-reservatório continua a ser um grande tema de saúde. Descrito aqui é um método para a geração de antígeno viral (AG)-linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos (CTLs) derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) (ou seja, IPSC-CTLs), que têm a capacidade de suprimir a replicação do HBV. A replicação de HBV é induzida eficientemente nos ratos através da injeção hidrodinâmico de um Plasmid da expressão de HBV, de paav/HBV 1.2, no fígado. Então, a superfície de HBV AG-específico iPSC-CTLs do rato é transferida adoptivamente, que suprime extremamente a replicação de HBV no fígado e no sangue assim como impede a expressão da superfície AG de HBV nos hepatocytes. Este método demonstra a replicação de HBV nos ratos após a injeção hidrodinâmico e que os CTLs AG-específicos virais derivado da pilha de haste podem suprimir a replicação de HBV. Este protocolo fornece um método útil para a imunoterapia de HBV.
Introdução
Após a infecção aguda, o sistema imunológico adaptativo (i.e., imunidade humoral e celular) controla a maior parte da hepatite aguda relacionada ao HBV. Ainda, um número de povos nas regiões HBV-endêmicas não pode eliminar os vírus e subseqüentemente converter como indivíduos crônicos. Mais de 25% dos pacientes crônicos (> 250 milhões de pessoas) em todo o mundo desenvolvem doença hepática progressiva, resultando em cirrose hepática e/ou carcinoma hepatocelular (HCC)1. Como resultado, a erradicação de células insistentemente infectadas permanece um problema geral de salubridade, embora haja uma vacina disponível2 e inúme....
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Protocolo
Todos os experimentos com animais são aprovados pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade do Texas a & M (IACUC; #2018-0006) e são conduzidos em conformidade com as diretrizes da Associação para a avaliação e acreditação de cuidados com animais de laboratório. Os camundongos são usados durante 6 – 9 semanas de idade.
1. geração de células de t CD8+ específicas virais AG de iPSCs (células t IPSC-CD8+ )
- Criação dos construtos retrovirais
Nota: os genes TCR α e β estão ligados à sequência de autoclivagem 2A. O vetor retroviral mscv-ires-dsred (MIDR) é dsred+ 23.
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Resultados
Como mostrado aqui, as células de T de iPSC-CD8+ específicas do HBV viral AG são geradas por um sistema de cultura in vitro. Após o ato destas pilhas AG-específicas virais de T IPSC-CD8+ suprimir substancialmente a replicação de HBV em um modelo murino (arquivo suplementar 1). Os IPSC do rato são transfomeados com a construção retroviral de MIDR que codifica um gene híbrido do HBV TCR do humano-rato (HBS183-191-specific, s183), a seguir os iPSCs gene-transvados são cocult.......
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Discussão
Este protocolo apresenta um método para gerar o IPSC-CTLs AG-específico viral para o uso como o ato para suprimir a replicação de HBV em um modelo murino. Na infecção crônica por HBV, o genoma viral forma um mini cromossomo estável, o DNA circular covalentemente fechado (cccDNA) que pode persistir ao longo da vida útil do hepatócito. Alvejar o afastamento do mini cromossoma viral pode conduzir a uma cura da infecção crônica de HBV. A terapia antiviral atual visa a transcriptase reversa do vírus, mas raramente estabelece .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem o Dr. Adam J Gehring do Instituto de pesquisa do hospital geral de Toronto para fornecer cDNA para HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-específico a2-restringiu genes TCR híbridos humanos-murine, e Dr. Pei-Jer Chen da Universidade Nacional de Formosa para fornecer construção de pAAV/HBV 1,2. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de saúde Grant R01AI121180, R01CA221867 e R21AI109239 para J. S.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos HHD | Institut Pasteur, Paris, França | Nocaute H-2 classe I, camundongos HLA-A2.1-transgênicos (HHD) | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmídeo | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (Hospital Universitário Nacional de Taiwan, Taiwan) | Construção de DNA do HBV | |
| HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) genes TCR específicos | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canadá) | Genes TCR híbridos humano-murinos restritos a A2 específicos de FLLTRILTI (V &alfa; 34 e Vβ 28) | |
| OVA257– Genes TCR específicos para 264 | Dr. Dario A. Vignali (Universidade de Pittsburgh, PA) | Genes TCR restritos a H-2Kb específicos do SIINFEKL | |
| Anticorpo anti-CD3 (17A2) | Biolegend | 100236 | |
| Anticorpo anti-CD44 (IM7) | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anticorpo anti-CD4 (GK1.5) | Biolegend | 100408 | |
| Anticorpo anti-CD8 (53-6.7) | Biolegend | ||
| Anti-IFN-&gama; (XMG1.2) anticorpo | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) anticorpo | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs Anticorpo | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Tampão de lise | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Classificador de células de fusão | BD | 656700 | |
| Gelatina | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentâmero | Proimune | F027-4A - 27 | |
| Anticorpo secundário anti-rato HRP | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldeído | MilliporeSigma | P6148-500G | Cuidado: Alergênico, carcenogênico, |
| tóxico Tampão de permeabilização | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Mountant Antifade Dourado com DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
Referências
- Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
- Osiowy, C. From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine....
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Reimpressões e permissões
Etiquetas
Células T Derivadas de Células-TroncoLinfócitos T Específicos para Antígenos ViraisSupressão da Replicação do HBVCélulas T CD8-Positivas Derivadas de iPSCEntrega Hidrodinâmica de Plasmídeo de HBVAnálise por Citometria de FluxoMarcação ImunofluorescenteTransferência Adotiva de CélulasTransdução do Receptor de Células TProdução de Interferon Gama
