Artigo de método

No método de modelagem silico para Toxicologia aquática computacional de Disruptores endócrinos: uma abordagem baseada em software usando o QSAR Toolbox

DOI:

10.3791/60054

⸱

28 de agosto de 2019

 ,  ,  , 
1KIST Europe Forschungsgesellschaft mbH

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A modelagem quantitativa da relação estrutura-atividade (QSAR) é um método representativo assistido por Bioinformática na triagem toxicológica. Este protocolo demonstra como avaliar computacionalmente os riscos de Disruptores endócrinos (EDs) em ambientes aquáticos. Utilizando a caixa de ferramentas da OCDE QSAR, o protocolo implementa um ensaio de silico para análise da toxicidade de EDs em peixes.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Análises computacionais de processos toxicológicos possibilitam a triagem de substâncias químicas de alto débito e previsão de seus Endpoints em sistemas biológicos. Em particular, os modelos quantitativos de relação estrutura-atividade (QSAR) têm sido cada vez mais aplicados para avaliar os efeitos ambientais de uma infinidade de materiais tóxicos. Nos últimos anos, alguns tipos mais destacados de tóxicos são os Disruptores endócrinos (EDs, que são produtos químicos que podem interferir com qualquer metabolismo hormonal-relacionado). Como os EDs podem afetar significativamente o desenvolvimento e a reprodução dos animais, é necessário prever rapidamente os efeitos adversos de EDs usando em técnicas de silico. Este estudo apresenta um método em silico para gerar dados de predição sobre os efeitos de EDs representativos em vertebrados aquáticos, particularmente espécies de peixes. O protocolo descreve um exemplo utilizando o fluxo de trabalho automatizado do software QSAR Toolbox desenvolvido pela organização para a cooperação e desenvolvimento econômico (OCDE) para permitir previsões de ecotoxicidade aguda de EDs. Como resultado, são determinados os seguintes: (1) cálculo das correlações numéricas entre a concentração para 50% de letalidade (LC50) e coeficiente de partição octanol-água (Kow), (2) performances de saída em que o LC50 os valores determinados em experimentos são comparados àqueles gerados por cálculos, e (3) a dependência da afinidade de ligação do receptor de estrogênio na relação entre Kow e LC50.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Novos desenvolvimentos em informática e tecnologia computacional capacitaram as ciências biológicas com metodologias quantitativas que oferecem alta precisão e confiabilidade1. Em particular, os algoritmos utilizados na taxonomia molecular e classificação de propriedade resultaram em modelos quantitativos de relação entre estrutura e atividade (QSAR)2. Estes modelos correlacionam automaticamente as estruturas químicas e as atividades biológicas de um dado banco de dados químico e implementam rápida na triagem silico de uma ampla gama de substratos químicos de acordo com suas ações medicinais ou toxicológicas3. As ferramentas QSAR podem produzir perfis de toxicidade preditiva como uma função de vetores de característica de descritores moleculares (ou seja, parâmetros físico-químicos) de produtos químicos de interesse para criar numericamente pontos de extremidade categóricos4. Normalmente, cada ponto de extremidade quantitativo é exibido como um gráfico de dispersão 2D versus alterações nos valores do descritor. Um modelo QSAR é então gerado usando análises de regressão linear (múltiplas). Depois que um conjunto de dados foi totalmente explorado para construir um modelo QSAR (chamado de conjunto de treinamento), o modelo é validado estatisticamente prevendo os pontos de extremidade de um grupo de produtos químicos não incluídos no conjunto de treinamento (chamado de conjunto de teste). O modelo pode então ser usado para prever as atividades biológicas de compostos não testados3.

Entre muitos produtos químicos prejudiciais, os Disruptores endócrinos (EDs) foram destacados como um grupo de tóxicos que podem interferir em metabolismos hormone-relacionados numerosos nos mamíferos, nos anfíbios, e nos peixes5,6. Os EDs são conhecidos por induzir uma variedade de efeitos adversos, como cânceres e malformações, bloqueando ou alterando vias hormonais normais ou ativando sinais anormais de síntese/degradação hormonal. Como consequência, estes hormônio-imitando produtos químicos podem perturbar sistemas endócrinos de tal forma que o desenvolvimento biológico e reprodução de animais selvagens populações são dificultados. Em particular, os efeitos ecotoxicológicos dos EDs têm sido extensivamente investigados em vertebrados aquáticos, que têm estruturas de receptores hormonais quase idênticas às dos mamíferos, incluindo os humanos. Porque todas as ações hormonais ocorrem em doses baixas in vivo, prevendo as toxicidades potenciais de candidatos de ED usando rápido na triagem de silico é fundamental para a saúde pública e ambiental.

Modelos QSAR baseados na toxicologia de EDs têm sido conduzidos utilizando ambos os descritores 2D e 3D (conhecidos como QSAR 2D e 3D, respectivamente), que revelam as afinidades de ligação de ligante ED de estrogênio, andrógeno e receptores de progesterona7. Apesar das vantagens de alta precisão do QSAR 3D, em que as interações conformacionais e eletrostáticas são consideradas, o QSAR 2D retém sua própria robustez em algoritmos matemáticos diretos, cálculos rápidos e cargas computacionais extremamente baixas. Além disso, os modelos 2D-QSAR são flexíveis para uso em uma ampla gama de aplicações, ao mesmo tempo que atingem um desempenho de predição relativamente preciso.

A caixa de ferramentas da OCDE QSAR é atualmente uma das ferramentas de software de computador mais utilizadas, fornecendo modelos QSAR disponíveis e pré-construídos8,9. Seu Profiler usa bancos de dados de descritor 2D. Desde o lançamento da primeira versão em 2008, o software tem sido aplicado nas áreas de indústrias químicas e biológicas, saúde pública e segurança ambiental para análise completa ou parcial dos riscos potenciais de compostos naturais e sintéticos, com interesses especiais em carcinogénese10,11,12, mutagenicidade13,14,15e toxicidade do desenvolvimento16. A aplicação à Toxicologia aquática também tem sido demonstrada, com foco na bioacumulação e biotransformação17.

A caixa de ferramentas QSAR foi comprovada útil na predição da toxicidade de curto prazo de uma ampla gama de produtos químicos17, bem como as afinidades de ligação do receptor de ESTROGÊNIO (er) de EDs18. No entanto, as ecotoxicidades agudas de EDs em vertebrados aquáticos não foram analisadas usando a caixa de ferramentas QSAR. Neste estudo, um protocolo típico e facile é apresentado para executar a modelagem de QSAR nos efeitos adversos agudos de EDs com um foco em espécies de peixes. O estudo mostra que o QSAR Toolbox é um software altamente acessível para calcular e prever a letalidade/mortalidade de vertebrados aquáticos para algumas EDs representativas. os métodos de tratamento estatístico para os conjuntos de dados derivados em silico são apresentados. Figura 1 mostra o esquema geral para a operação geral da caixa de ferramentas QSAR. O fluxo de trabalho mostrado na Figura 2 fornece instruções diretas sobre como operar o ensaio em silico para prever a ecotoxicidade aguda de substâncias-alvo, como produtos químicos de desregulação endócrina.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. equipamento

  1. Software: Use o OECD QSAR Toolbox 4,0 ou mais recente (download gratuito de < https://qsartoolbox.org/download/?) e software de análise de dados.
  2. Computador: para a caixa de ferramentas da OCDE QSAR, use: (i) tipo de sistema: 64 bit, Windows 7 ou mais recente; (II) processador: i5 a 2,4 GHz, ou um processador mais rápido ou CPU AMD equivalente; (III) memória instalada (RAM): 6 GB; (IV) unidade de disco rígido (HDD): 20 GB de espaço livre no disco rígido (OECD QSAR Toolbox 4,3 notas de lançamento: < https://qsartoolbox.org/file/2019/02/Toolbox-4.3-Release-Notes-1.pdf >).

2. procedimento

  1. Caixa de ferramentas da OCDE QSAR
    Nota: a caixa de ferramentas QSAR opera em seis módulos de fluxo consecutivos a partir de entrada e seguido de perfilamento, dados, definição de categoria, preenchimento de lacuna de dados, em seguida, report, localizado na parte superior do a interface do programa.
    1. Explore os seis estágios acima mencionados por meio de seis ícones da barra de ferramentas clicando com o botão esquerdo. Primeiro, olhe sobre os estágios de entrada, preenchimento de lacuna de dados e relatório que são necessários para executar o fluxo de trabalho automatizado "ponto de extremidade ecotoxicológico" e para documentar seus resultados.
    2. Dê uma olhada curta sobre estágios opcionais perfil e dados. O estágio de perfilamento fornece uma introspecção inicial no potencial da toxicidade da substância-alvo (eco) e nas características ambientais do Fate. O estágio de dados opcional permite pesquisar dados experimentais disponíveis relacionados à substância alvo.
  2. Entrada
    1. Ao iniciar a caixa de ferramentas do QSAR, o usuário começa no estágio da caixa de ferramentas de entrada por padrão. A caixa de ferramentas QSAR cria um arquivo de trabalho denominado "documento 1" automaticamente, que é exibido no painel de opções de estágio à esquerda da interface do programa. Renomeie o arquivo, se desejado, clicando com o botão direito do mouse no arquivo de trabalho.
    2. Clique no botão CAS # na barra de ferramentas ações, insira o número do serviço de resumo químico (CAS) da substância alvo no campo de texto disponível e clique em Pesquisar. A ferramenta procurará então a substância do alvo pelo número CAS.
    3. Se necessário, escolha outras opções de pesquisa disponíveis na barra de ferramentas de ação, como pesquisa por nome de substância ou código do sistema de entrada de linha molecular simplificado (SMILES). SMILES pode ser introduzido como 2D não estereo-químico ou 3D estereo-químico contendo formulários. Clique em nome ou estrutura, respectivamente. Use a ferramenta Structure para desenhar a substância alvo.
    4. A ferramenta de pesquisa exibe os resultados da pesquisa por meio de registros de banco de dados em uma janela pop-up. Escolha o registro que relata um "alto" relação CAS-SMILES (campo derelação de CS ) se vários registros são recuperados para a substância de destino, marcando a caixa à esquerda do registro. Clique em OK.
      Nota: prosseguir a partir deste ponto é possível apenas se o registo recuperado contiver um código SMILES, como o código SMILES (2D não estereo-químico contendo formulário) é a base para a computação.
    5. Modo de lote: para realizar o ensaio em silico para várias substâncias alvo, escreva uma lista de substância simples em um editor de texto no qual cada número CAS é listado em uma única linha (Figura complementar S3). Guarde o ficheiro de texto com um nome apropriado e extensão. txt no computador.
    6. Modo de lote: clique em dados. Em seguida, vá para bancos de dados no painel de opções de estágio à esquerda da interface do programa. Certifique-se de que os bancos de dados listados em informações ecotoxicológicas estejam verificados.
    7. Modo batch: clique em Input. Selecione consulta na barra de ferramentas ações. Aceite as configurações definidas na etapa 2.2.6 clicando em Sim na janela de diálogo.
    8. Modo batch: escolha a guia CAS . Carregue a lista de substâncias guardada como ficheiro de texto através da lista de carga do seu computador.
    9. Modo de lote: há dois Adicionar botões disponíveis; Clique no botão Adicionar na parte inferior do menu pop-up e, em seguida, clique em executar. A caixa de ferramentas QSAR exibirá uma mensagem sobre o número de substâncias que foram recuperadas para a pesquisa.
      Observação: algumas substâncias da lista carregada não podem ser encontradas pela ferramenta de pesquisa ou que várias entradas podem estar disponíveis para um número de CAS. Não é possível eliminar substâncias do conjunto recuperado de substâncias.
  3. Perfil
    Observação: a seção a seguir é opcional. Se isso não for necessário, pule para a seção 2,5.
    1. Clique no botão de caixa de ferramentas etapa profiling. Vá para métodos de criação de perfil no painel de opções de estágio à esquerda da interface do programa.
    2. Clique em desselecionar tudo. Verifique todos os geradores de perfis listados em predefinidos e os relacionados com a toxicidade aquática listado em ponto de extremidade específico , como "classificação de toxicidade aguda aquática por Verhaar (modificada)."
    3. Termine a seleção. Em seguida, clique no botão aplicar na barra de ferramentas ações.
      Nota: a caixa de ferramentas QSAR fornece recomendações sobre um conjunto de geradores de perfis. Estes são destacados em verde (adequado) e laranja (plausível) ao escolher opções ≫ cor por: ≫ ponto de extremidade selecionado na matriz de dados no canto superior esquerdo dos métodos de criação de perfil. Clique com o lado esquerdo no campo matriz de dados próximo ao ponto de extremidade de interesse. Os pontos de extremidade disponíveis são listados na árvore de ponto de extremidade ao lado do painel de opções de estágio. O tipo de substância do profiler indicará se a substância alvo é um "produto químico discreto". As informações são exibidas na árvore de ponto de extremidade expandida "perfil", "predefinido" e "tipo de substância". Somente se a substância alvo for um produto químico discreto, o fluxo de trabalho automatizado será executado com êxito. "A classificação de toxicidade aguda aquática por Verhaar (modificada)" fornece uma primeira estimativa do mecanismo agudo de toxicidade aquática da substância alvo19,20. As informações são exibidas na árvore de ponto de extremidade expandida "perfil", "ponto de extremidade específico" e "classificação de toxicidade aguda aquática por Verhaar (modificada)". Estão disponíveis cinco classes: (classe 1) substâncias químicas inertes (toxicidade basal); (classe 2) menos produtos químicos inertes; (classe 3) produtos químicos reativos; (classe 4) produtos químicos especificamente agindo; e (classe 5) para produtos químicos não é possível classificar.
    4. Clique com o botão direito do mouse no parâmetro na árvore de Endpoint para executar modelos integrados de QSAR 2D e 3D disponíveis na caixa de ferramentas QSAR, se desejado. Clique em calcular/extrair todos os parâmetros para todos os produtos químicos no menu pop-up.
    5. os modelos 2D e 3D QSAR compilados no parâmetro fornecem valores numéricos. Use "métodos de criação de perfil" para obter informações qualitativas (consulte a etapa 2.3.1).
  4. Dados
    Observação: Esta seção é opcional. Se não for necessário, pule para a seção 2,5.
    1. Clique nos dados do botão de estágio da caixa de ferramentas . Em seguida, clique em reunir na barra de ferramentas ações.
    2. Selecione todos os pontos de extremidade para coletar todos os dados experimentais e escolha coletar dados experimentais específicos do Endpoint. Por exemplo, se a toxicidade aquática for o foco do usuário, clique em escolher ≫ informações ecotoxicológicas ≫ toxicidade aquática > OK.
      Observação: escolhendo para coletar dados experimentais para todos os pontos de extremidade pode levar ao tempo de processamento estendido. O usuário pode adaptar a hierarquia da árvore de ponto de extremidade para a finalidade específica. Isso altera a maneira na qual os dados são exibidos.
    3. Se desejar, clique com o botão direito do mouse no ponto de extremidade de interesse na área da árvore de Endpoint. Escolha definir hierarquia de árvore no menu pop-up. Organize a árvore de ponto de extremidade da maneira preferida usando os termos e as setas disponíveis e clique em OK.
    4. Se desejar, exporte os dados reunidos como um arquivo do Excel. Clique com o botão direito do mouse no ponto de extremidade de interesse e escolha Exportar matriz de dados no menu pop-up.
    5. Um assistente de "exportação de matriz" abre e permite a adição de outros pontos de extremidade à lista de exportação. Conclua a seleção, clique em Exportar e salve o arquivo no computador.
      Nota: não é possível exportar dados de todos os bancos de dados. Por exemplo, os dados recuperados do banco de dados "ECHA CHEM" não podem ser salvos.
  5. Preenchimento de lacuna de dados
    1. Clique no botão da caixa de ferramentas estágio preenchimento de dados Gap. Em seguida, clique em automatizado na barra de ferramentas ações.
    2. Selecionar ponto de extremidade ecotoxicológico > peixes, CL50 (concentração letal, 50%) em 96 h para Pimephales vairão gordo (mortalidade). Clique em OK. Um "controlador de fluxo de trabalho" aparecerá e o processamento levará até vários minutos, especialmente no modo de lote.
      Nota: a caixa de ferramentas QSAR aplica automaticamente um conjunto definido de geradores de perfis ao procurar substâncias adequadas com dados experimentais disponíveis para a previsão. Os dados experimentais [por exemplo, concentrações do efeito 96 h LC50 (p. vairão gordo) ou 96 h EC50 (p. vairão gordo, mortalidade)] são usados para gerar a predição para a substância-alvo pela aproximação linear ou mais próxima método vizinho. Observe que os métodos de aproximação linear e vizinho mais próximo são referidos como análise de tendência (rotulado como "T") e Read-Across (rotulado como "R"), respectivamente.
    3. O usuário receberá uma mensagem se a previsão for executada com êxito. Clique em OK e feche o controlador de fluxo de trabalho indicando "fluxo de trabalho concluído" clicando em x no canto superior direito.
    4. Modo de lote: ao iniciar o fluxo de trabalho automatizado, o usuário será solicitado a especificar o intervalo de substâncias sobre as quais executar o fluxo de trabalho. Aceite a gama completa de substâncias seleccionadas por predefinição na janela de diálogo, clicando em OK.
    5. Modo de lote: o usuário não receberá uma mensagem indicando se uma previsão foi executada com êxito ou sem êxito. Feche o controlador de fluxo de trabalho que indica "fluxo de trabalho concluído" no final do processamento em lote clicando em x no canto superior direito.
  6. Relatório
    1. Se uma previsão foi executada com êxito, clique no relatório de botão do estágio da caixa de ferramentas .
      Observação: nenhum relatório pode ser gerado no modo de lote.
    2. Role para baixo e localize o valor de previsão no campo matriz localizado em uma linha destacada amarela ao lado do ponto de extremidade "96-h." O valor previsto é rotulado com "T" ou "R". Ative este campo de matriz de dados específico clicando com o botão esquerdo do mouse.
    3. Clique em previsão na barra de ferramentas ações. Personalize o conteúdo e a aparência do relatório no assistente de pop-up. Estão disponíveis três tipos de relatórios: (i) predição, (II) categoria e (III) matriz de dados.
    4. O assistente permite que o usuário preencha o nome do autor e os detalhes de contato. Escreva um breve resumo, forneça uma explicação detalhada da interpretação mecanicista ou forneça justificação para a adequação da previsão.
    5. Inclua informações adicionais relacionadas à previsão executada, se desejado. A extensão das informações adicionais depende do usuário.
    6. Percorra o assistente clicando em seguinte. Por fim, clique em criar relatório e salve os relatórios de previsão e categoria como arquivos PDF e a matriz de dados como uma planilha do Excel no computador.
    7. Encontre detalhes adicionais sobre as funcionalidades da caixa de ferramentas QSAR e fluxos de trabalho automatizados no manual do aplicativo para o OECD QSAR Toolbox v. 4 (F1 Ajuda no teclado). Detalhes sobre os algoritmos e raciocínio por trás do fluxo de trabalho automatizado são descritos por Dimitrov et al.8 e Yordanova et al.9.

3. aplicação

  1. Se utilizar a concentração do efeito previsto (i.e., 96-h LC50 de P. vairão gordo) na avaliação do risco ambiental, utilize o limite inferior do intervalo de confiança de 95%. Encontre os dados na primeira página do relatório de previsão salvo (PDF) em "Resumo de previsão", "valor previsto: < média > (de < lower_limit > para < upper_limit >)."
    Nota: as notas dadas aqui baseiam-se nos resultados da comparação entre os dados previstos e experimentais para um conjunto de substâncias alvo relatadas neste estudo. A seleção da extremidade inferior do intervalo de confiança de 95% aumentará a probabilidade de que a concentração do efeito previsto não subestime a toxicidade real da substância (veja os resultados representativos). A concentração efetiva prevista do limite inferior do intervalo de confiança de 95%, portanto, apresentará uma base mais segura para a avaliação de risco.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O exemplo descrito neste estudo foi implementado para a análise quantitativa e predição de toxicidades agudas de EDs selecionadas em peixes. Quando os pontos de dados previstos foram plotados versus pontos de dados experimentais como uma escala de log-log, uma correlação positiva entre ambos foi encontrada para todos os peixes e uma espécie representativa, a saber, Pimephales vairão gordo (Minnow do Fathead; Figura 3). Em ambos os casos, a inclinação da regressão linear pareceu ser comparável (previu LC50/experimental LC50 = 0,611 e 0,602 para todos os peixes e P. vairão gordo, respectivamente). Por causa da quantidade limitada de dados experimentais, o número de valores disponíveis da observação experimental era geralmente menor do que aquele da predição computacionais. A aplicação do fator de tolerância como 5 vezes para a capacidade computacional21 resultou em 94% (34/36) e 96% (26/27) da predição protetora para todos os peixes e P. vairão gordo, respectivamente. Baseado nesta predição, 3 ', 5, 7-trihydroxy-4 ', 6-dimethoxyisoflavone e 1,4-benzenediol pareceram expor valores calculados do LC50 maiores do que o limite de tolerância.

Para possibilitar a avaliação de segurança na maior confiabilidade, foi realizada uma análise computacional mais aprofundada, traçando o limite inferior previsto do intervalo de confiança de 95% do LC50 (em vez dos valores médios utilizados na Figura 3) versus o valores obtidos experimentalmente (Figura 4). Nesta avaliação com um limiar de segurança elevado, 92% (33/36) dos compostos de desreguladores endócrinos testados totais foram mostrados para cair na escala protetora quando comparados aos valores experimentalmente derivados à exceção de: 3 ', 5, 7-trihydroxy-4 ', 6- dimetoxiisoflavona; 1,4-benzenodiol; e 4-hexilfenol.

Com base nas avaliações de toda a espécie disponível a partir da base de dados, os valores para o previsto e experimental 96-h log10LC50 exibiu linearidade com o log10Kow valores no domínio entre-1 e 7, indicando um correlação hiperbólica entre LC50 e Kow. Uma tendência global existiu por meio de que o LC50 diminuiu para uns valores mais elevados de Kow de EDS para os dados obtidos das predições e dos experimentos computacionais, sugerindo o aumento da toxicidade aguda em espécies de peixes para EDs com maior hidrofobicidade (Figura complementar S1).

Pelo Profiler de ER baseado em regras incorporado na caixa de ferramentas da OCDE QSAR, as afinidades de ligação de ER das EDs foram categorizadas como ligantes não vinculantes, bem como fracas, moderadas, fortes e muito fortes, por ordem de aumentar a afinidade de ligação18. Assim, a distribuição estatística do log10Kow pode ser exibida como uma classificação qualitativa de afinidade de ligação de er (Figura complementar S2). Globalmente, as mudanças nos intervalos de distribuição Kow e seus níveis médios pareciam não ter uma tendência definida. Da mesma forma, as distribuições de LC previsto e experimental50 foram mostradas como a extensão da afinidade de ligação de er (Figura 5). Neste caso, os níveis médios de LC previsto50 para ligantes do er eram mais elevados do que aqueles de não-aglutinantes. Em contrapartida, para a LC experimental50, os níveis médios de ligantes não-e fracos foram superiores aos de ligantes er mais fortes.

figure-results-1
Figura 1: esquema básico do fluxo de trabalho geral da caixa de ferramentas da OCDE QSAR.
Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: fluxo de trabalho.
Mostra-se o fluxo de trabalho que conceitualiza os módulos e sequências aplicados para prever as toxicidades agudas dos Disruptores endócrinos (EDs) em peixes usando a caixa de ferramentas da OCDE QSAR. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: previsto vs. experimental 96-h LC50 de EDs na tabela 1 para todos os peixes (diamantes azuis, n = 36) e uma espécie selecionada P. vairão gordo (diamantes ciano, n = 27).
Para o50LC previsto, os valores médios ("ave") são exibidos. As linhas tracejadas representam regressões lineares para os dois grupos: para todos os peixes (azul claro), previsto LC50ave = 0,611 x (experimental lc50) + 0,277 (ajustado r2 = 0,408); e P. vairão gordo (ciano claro), previsto LC50ave = 0,602 x (LC experimental50) + 0,385 (ajustado r2 = 0,441). A linha diagonal sólida mostra a unidade na qual os valores previstos e experimentais são iguais a21. A linha cinzenta pontilhada mostra o limite de tolerância de 5 vezes da capacidade computacional19. Outliers: 3 ', 5, 7-trihydroxy-4 ', 6-dimethoxyisoflavone (*) e 1,4-benzenediol (* *). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: previsto (limite inferior de 95% de intervalo de confiança, "Low-95%") vs. experimental 96-h LC50 de EDs na tabela 1 para todos os peixes (n = 36).
A linha tracejada representa a regressão linear: previu LC50Low-95% = 0,470 x (experimental lc50)-0,312, onde ajustado r2 = 0,193. A linha diagonal sólida indica a unidade onde os valores previstos e experimentais são iguais entre si19. Outliers: 3 ', 5, 7-trihydroxy-4 ', 6-dimethoxyisoflavone (*), 1,4-benzenediol (* *), e 4-hexylphenol (* * *). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: distribuições do previsto (caixas sólidas, n = 8 – 20 para cada categoria) e experimentais (caixas tracejadas; n = 3 – 16 para cada categoria) 96-h LC50 dependendo da afinidade de ligação de er de EDs na tabela 1 para todos os peixes.
Um gráfico de caixa representa: (a) média (quadrado pequeno com uma barra horizontal arrojada), (B) 1 quartis deSt e 3RD (inferior e superior – extremidades da caixa, respectivamente), (C) mediana (segmento horizontal dentro da caixa), ( D) 5º e 95º percentil (barras de erro inferiores e superiores, respectivamente), (e) 1St e 99º percentil (inferior e superior x, respectivamente) e (F) mínimo e máximo (inferior e superior –, respectivamente). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Não.Número do registro CASNome da substânciaFórmula SMILES (formulário 2D não estereo-químico)Log KowAVE
previu 96-h CL50
(mg/L)		MENOR 95% CI
previu 96-h CL50
(mg/L)		Profiler-ligação do receptor de estrogênio
150-28-217-β estradiolCC12CCC3C (CCc4cc (O) ccc34) C1CCC2O4, 13,621,42Ligante muito forte, grupo OH
257-63-617-α Ethinyl-
Estradiol		CC12CCC3C (CCc4cc (O) ccc34) C1CCC2 (O) C # C3,673, 01,18Aglutinante forte, grupo OH
380-05-72, 2-bis (4-hydroxyphe-nyl) propano (bisfenol A)CC (C) c1ccc (O) c1ccc3,324,681,80Ligante muito forte, grupo OH
480-46-64-tert-PentilfenolCCC (C) (C) c1ccc (O) p. b.3,912,270,87Aglutinante fraco, grupo OH
5140-66-94-tert-OctylphenolCC (c) (c) CC (C) (c) c1ccc (O) p. b.5,280,380,14Aglutinante forte, grupo OH
6446-72-0Genistein [3 ', 5, 7-trihydroxy-4 ', 6-dimethoxyisoflavone]Oc1ccc (c) C1 = COc2cc (o) CC (O) c2C1 = O2,8432, 010, 3Ligante muito forte, grupo OH
710161-33-817β-trembolonaCC12C = CC3C (CCC4 = CC (= O) CCC = 34) C1CCC2O2,65124,7219,75Aglutinante forte, grupo OH
867747-09-5Prochloraz (fungicida de DMI)CCCN (CCOc1c (CL) CC (CL) cc1Cl) C (= O) n1ccnc14,15,191,74Não aglutinante, sem grupo OH ou n
984852-15-34-nonylphenolCC (C) CCCCCCc1ccc (O) b. b.5,920,210, 7Aglutinante forte, grupo OH
1069-72-7ácido salicílicoOC (= O) c1ccccc1O2,2624, 79,31Aglutinante fraco, grupo OH
1180-09-14, 4 '-dihydroxydiphenyl sulfona (Bisfenol S)Oc1ccc (S) (= o) (= o) c1ccc (O)1,6548,6710,67Ligante muito forte, grupo OH
1284-74-2ácido ftálico, éster de dibutiloCCCCOC (= O) c1ccccc1C (= O) OCCCC4,50,760, 6Não aglutinante, sem grupo OH ou n
1392-88-64, 4 ′-dihydroxybiphenylOc1ccc (s)-c1ccc (O) p. i.2,812, 54,20Aglutinante moderado, Oh grupo
1494-13-3ácido 4-hydroxybenzoic, éster do propilCCCOC (= O) c1ccc (O) CC3, 410,323,86Aglutinante moderado, Oh grupo
1598-54-44-tert-ButilfenolCC (C) (C) c1ccc (O) p. b.3,314,361,68Aglutinante fraco, grupo OH
1697-23-42, 2 ′-dihydroxy--5, 5 ′-dichlorodiphenyl-MethaneOc1ccc (CL) cc1Cc1cc (CL) ccc1O4,260,480,10Ligante muito forte, grupo OH
1797-53-0EugenolCOc1cc (CC = C) ccc1O2,2714,705,60Aglutinante fraco, grupo OH
1899-76-3ácido 4-hidroxibenzóico, éster metílicoCOC (= O) c1ccc (O) CC1,9638,2014, 1Aglutinante fraco, grupo OH
19103-90-2N-(4-hidroxifenil) acetamidaCC (= O) Nc1ccc (O) c 20,46338,9743,39Aglutinante fraco, grupo OH
20106-44-5p-cresolCc1ccc (O) p. s.1,9420,477,14Aglutinante fraco, grupo OH
21108-39-4m-cresolCc1cccc (O) C11,9623,459,17Aglutinante fraco, grupo OH
22108-45-21,3-feniletilenodiaminaNc1cccc (N) C1-0,3334,600, 0Aglutinante fraco, grupo de n.
23108-46-31,3-dihidroxibenzenoOc1cccc (O) C10,8123, 327, 6Aglutinante fraco, grupo OH
24108-91-8ciclohexilaminaNC1CCCCC11,4928, 81,40Aglutinante fraco, grupo de n.
25119-36-8ácido salicílico, éster metílicoCOC (= O) c1ccccc1O2,5516,165,68Aglutinante fraco, grupo OH
26120-47-8ácido 4-hidroxibenzóico, éster etílicoCCOC (= O) c1ccc (O) CC2,4719,937,40Aglutinante fraco, grupo OH
27120-80-91,2-dihidroxibenzenoOc1ccccc1O0,8811,140, 1Aglutinante fraco, grupo OH
28123-31-91,4-dihidroxibenzeno [1,4-benzenodiol]Oc1ccc (O) p. s.0,5990,7533,19Aglutinante fraco, grupo OH
29131-53-32, 2 ′-dihydroxy-4-methoxybenzophenoneCOc1ccc (C (= O) c2ccccc2O) c (O) C13,823,971,46Ligante muito forte, grupo OH
30131-56-62,4-dihidroxibenzofenonaOc1ccc (c (O) C1) C (= O) c1ccccc12,9612, 44,73Aglutinante forte, grupo OH
31131-57-72-hidroxi-4-metoxibenzofenonaCOc1ccc (C (= O) c2ccccc2) c (O) C13,795,962,27Aglutinante forte, grupo OH
32599-64-44-cumylphenolCC (C) (c1ccccc1) c1ccc (O) p. b.4,122,150,84Aglutinante forte, grupo OH
332855-13-21-amino-3-Aminometil-3, 5, 5-trimetil-ciclohexanoC) CC (N) CC (C) (CN) C11,930,651,53Aglutinante moderado, grupo de n.
346864-37-53, 3 ′-dimetil-4, 4 ′-diaminodicyclohexylmethaneCC1CC (CCC1N) CC1CCC (N) C (C) C14,11, 70, 5Aglutinante forte, grupo de n.
3525013-16-5tert-butyl-4-hydroxyanisoleCOc1ccc (O) c (C1) C (C) (C) C3,54,851,85Aglutinante moderado, Oh grupo
36147315-50-22-(4, 6-difenil-1, 3, 5-triazina-2-yl)-5-(hexyloxy) fenolCCCCCCOc1ccc (c (O) C1)-c1nc (NC (N1)-c1ccccc1)-c1ccccc16,240,170, 6Aglutinante forte, grupo OH
3788-68-62-aminobenzamidaNC (= O) c1ccccc1N0,35694, 084,30Aglutinante fraco, grupo de n.
38611-99-44, 4 ′-dihydroxybenzophenoneOc1ccc (C 2) (= O) c1ccc (O) b2,1937,7414,67Ligante muito forte, grupo OH
3927955-94-81, 1, 1-tris (4-hidroxifenol) etanoCC (c1ccc (O) c. p) (c1ccc (O) p. c1ccc4,382, 90,82Ligante muito forte, grupo OH
4087-18-3ácido salicílico, éster 4-terc-butilfenilCC (C) (C) c1ccc (OC (= O) c2ccccc2O) b. b.5,730,240, 9Aglutinante forte, grupo OH
4147465-97-43, 3-bis (3-metil-4-hidroxifenil) 2-indolinonaCc1cc (ccc1O) C1 (C (= O) Nc2ccccc12) c1ccc (O) c (C) C14,482, 70,77Ligante muito forte, grupo OH
4299-96-7ácido p-hidroxibenzóicoOC (= O) c1ccc (O) c 21,588,540, 0Aglutinante fraco, grupo OH
4380-07-91-cloro-4-(4-
clorofenil) sulfonilbenz		Clc1ccc (= o) S (= o) (= O) c1ccc (CL)3,93,920,85Não aglutinante, sem grupo OH ou n
4484-65-19,10-anthraquinoneO = C1c2ccccc2C (= O) c2ccccc123,397, 03,54Não aglutinante, sem grupo OH ou n
4585-44-92-benzofurano-1,3-dionaO = C1OC (= O) c2ccccc121,62,690, 0Não aglutinante, sem grupo OH ou n
4692-84-210H-fenotiazinaN1c2ccccc2Sc2ccccc124,151, 70, 8Não aglutinante, sem grupo OH ou n
472855-13-21-amino-3-Aminometil-3, 5, 5-trimetil-ciclohexanoC) CC (N) CC (C) (CN) C11,930,651,53Aglutinante moderado, grupo de n.
4850-27-1EstriolCC12CCC3C (CCc4cc (O) ccc34) C1CC (O) C2O2,4521,218,29Ligante muito forte, grupo OH
4950-50-0Beta-estradiol-3-benzoatoCC12CCC3C (CCc4cc (OC (= O) c5ccccc5) ccc34) C1CCC2O5,470,360, 2Aglutinante forte, grupo OH
5053-16-7EstronaCC12CCC3C (CCc4cc (O) ccc34) C1CCC2 = O3,137,783, 6Aglutinante forte, grupo OH
5192-52-4Biphenylc1ccc (c1ccccc1)4, 14,100,47Não aglutinante, sem grupo OH ou n
5292-69-3p-FenilfenolOc1ccc (c1ccccc1)3,25,991,82Aglutinante moderado, Oh grupo
5396-29-72-butanone oximaCCC (C) = NÃO0,6332,672,49Não aglutinante, estrutura não cíclica
54121-75-5MalathonCCOC (= O) CC (SP (= S) (OC) OC) C (= O) OCC2,3637,733,33Não aglutinante, estrutura não cíclica
55123-07-94-etilfenolCCc1ccc (O)2,5813,634,65Aglutinante fraco, grupo OH
56645-56-74-n-PropylpehnolCCCc1ccc (O)3,27,322,55Aglutinante fraco, grupo OH
571638-22-8p-butilo fenolCCCCc1ccc (O)3,654, 91,39Aglutinante fraco, grupo OH
581912-24-9AtrazinaCCNc1nc (CL) NC (NC (C) C) N12,6130,874,63Não aglutinante, sem grupo OH ou n
5940596-69-8MethopreneCOC (C) (C) CCCC (C) CC = CC (C) = CC (= O) OC (C) C5,50, 80, 0Não aglutinante, estrutura não cíclica
601987-50-44-heptylphenolCCCCCCCc1ccc (O)5, 10,660,22Aglutinante moderado, Oh grupo
6192-86-4p, p'-DibromobifeniloBrc1ccc (c1ccc)5,720,110, 2Não aglutinante, sem grupo OH ou n
62480-41-1NaringeninaOc1ccc (C1CC) (= O) C2C (O) CC (O) cc2O12,5227,8410,87Ligante muito forte, grupo OH
63486-66-8DaidzeínaOc1ccc (s) C1 = COc2cc (O) ccc2C1 = O2,5536,4711,71Ligante muito forte, grupo OH
64491-70-3LuteolinaOc1cc (O) c2C (= O) C = C (Oc2c1) c1ccc (O) c (O) C12,5343,7514,28Ligante muito forte, grupo OH
65491-80-5Biochanin ACOc1ccc (c) C1 = COc2cc (o) CC (O) c2C1 = O3,4115,873,70Aglutinante forte, grupo OH
66520-18-3KaempferolOc1ccc (C1Oc2cc) (o) CC (O) c2C (= O) C = 1O1,9670,988, 5Ligante muito forte, grupo OH
672051-60-72-Clorobifenilo (PCB 1)Clc1ccccc1-c1ccccc14,530,770,16Não aglutinante, sem grupo OH ou n
682051-61-83-Clorobifenilo (PCB 2)Clc1cccc (C1)-c1ccccc14,580,770,16Não aglutinante, sem grupo OH ou n
692051-62-94-cloro-1, 1 '-bifeniloClc1ccc (c1ccccc1)4,610,770,16Não aglutinante, sem grupo OH ou n
702446-69-7p-n-hexilfenol [4-hexilfenol]CCCCCCc1ccc (O)4,521,220,42Aglutinante moderado, Oh grupo
7114938-35-34-n-AmilfenolCCCCCc1ccc (O)4, 62,440,89Aglutinante fraco, grupo OH
7217924-92-4ZearalenonaCC1CCCC (= O) CCCC = Cc2cc (o) CC (O) c2C (= O) O13,587,222,66Aglutinante forte, grupo OH
731743-60-8Beta-estradiol 3-benzoato 17-nbutyrateCC (= O) OC1CCC2C3CCc4cc (O) ccc4C3CCC12C4,950,910,35Aglutinante forte, grupo OH
74479-13-0CoumestrolOc1ccc2c (OC (= O) c3c-2oc2cc (O) ccc32) C11,5752,1611,44Ligante muito forte, grupo OH

Tabela 1: lista de produtos químicos de desregulação endócrina avaliados. As concentrações efetivas média (ave) e menor de 95% de intervalo de confiança (IC) (95-h LC50, Pimephales vairão gordo) bem como o receptor de estrogênio Binding foram previstas com o QSAR Toolbox versão 4,3 Automated Workflow. Log10Kow foi recuperado via qsar Toolbox versão 4,3 de kowwin v 1.68, 2000, E.u. Agência de proteção ambiental. Log experimental10Kow valores foram preferidos sobre os valores previstos. A lista de substâncias-alvo foi compilada a partir de listas previamente relatadas de EDs22,23,24.

Informações complementares. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo. 

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A versatilidade da caixa de ferramentas QSAR da OCDE como software analítico para Ecotoxicologia é mostrada aqui com interesse específico nos efeitos adversos dos produtos químicos de desregulação endócrina em vertebrados aquáticos. Além, um protocolo simples e padrão foi demonstrado para prever a toxicidade aguda (96-h LC50) de 74 representante EDs (tabela 1) para espécies de peixes. Isso foi conseguido aplicando-se a construção de categorias, preenchimento de lacunas de dados e módulos de perfilamento de er incorporados na caixa de ferramentas QSAR (Figura 1, Figura 2).

A correlação linear entre o log10LC50 e o log10Kow com uma inclinação negativa (como mostrado na Figura complementar S1) tem sido conhecida como uma relação quantitativa padrão nas análises QSAR25, onde maior toxicidade é mostrada a mais hidrofóbica um dado químico é. Como pode ser visto a partir de um cálculo simples, a relação matemática geral que inclui a equação S1 e a equação S2 (informações complementares) é uma expressão convertida da seguinte função de poder26:

figure-discussion-1

figure-discussion-2

A partir da parcela de (equação 2), caracterizar um intervalo intermediário de Kow26 pode ser possível ajustando os parâmetros a e b, onde uma certa variação na hidrofobicidade (ou hidrofilicidade) não altera significativamente a desfecho de toxicidade aguda.

As análises comparativas entre as predições computacionais e as observações experimentais na LC50, como mostra a Figura 3 e a Figura 4, têm sido tipicamente relatadas em estudos de QSAR para vários tóxicos aquáticos, incluindo surfactantes técnicos não iônicos27, fungicidas triazol28e metabólitos do pesticida21. Este tipo de validação retrospectiva fornece informações sobre o quão longe uma determinada ferramenta QSAR pode chegar em termos de desempenho comparativo para resultados experimentais. Neste estudo de toxicidade aguda em peixes, a caixa de ferramentas QSAR foi comprovada para fornecer previsões protetoras para mais de 90% de EDs testadas em todos os peixes e em uma única espécie, Pimephales vairão gordo.

Além disso, identificar os três produtos químicos outlier na Figura 3 e na Figura 4, que mostraram maior previsto LC50 em média e no mínimo, respectivamente, é necessária. Primeiramente, o 3 ', 5, 7-trihydroxy-4 ', 6-dimethoxyisoflavone é um tipo de flavonóide (mais especificamente, um Isoflavone), que seja considerado para ser geralmente seguro e usado em produtos farmacêuticos ervais; no entanto, ele ainda tem preocupações relacionadas ao estrogênio29 e pode causar toxicidade aguda provavelmente através de fosforilação oxidativa desengate30. Em seguida, o 1,4-benzenediol, denominado hidroquinona, é um composto fenólico que pode desencadear uma resposta imune não-específica e citotóxica em peixes31. Finalmente, o 4-hexilfenol tem sido conhecido por apresentar uma atividade estrogênica positiva suficiente para ser classificado como um ED32. Tem sido bem estudado que a principal razão da toxicidade aguda da hidroquinona é a redução-oxidação (redox) ciclismo. A hidroquinona é oxidada à benzoquinona e reduzida de volta à semiquinona ou hidroquinona repetidamente, com cofatores de depletização e gerando espécies reativas de oxigênio33. Os outros dois produtos químicos podem exigir investigações mais profundas para revelar seus mecanismos de ação na ecotoxicidade aguda usando abordagens de encaixe molecular, como a usada por panche et al.34, que não podem ser cobertas pela caixa de ferramentas QSAR.

EDs interferir com o sistema endócrino, principalmente através de interações físico-químicas com receptores de esteroides, tais como os receptores de estrogênio e andrógeno, que são de interesse considerável em estudos de modelagem QSAR35. Considerando isso, o QSAR Toolbox é robusto em termos de classificação facile e rápida de afinidades de ligação de ER para um conjunto de produtos químicos baseados apenas nos descritores 2D de estruturas moleculares. Quando este sistema de perfilador de ER foi aplicado à nossa lista de EDs, nenhuma correlação clara foi encontrada entre a afinidade de ligação de ER e a hidrofobicidade (Figura complementar S2). Este resultado pode ser explicado pelo fato de que a formação de um complexo receptor de esteroides não é uma consequência direta de uma contribuição de ligação hidrofóbica, mas deve ser acompanhada por uma mudança conformacional na estrutura do receptor do local ativo36. A ligação do receptor pode ser também devido ao hidrogênio-ligação e π-empilhamento.

Adicionalmente, a posição de cada grupo químico na molécula pode afetar a ligação do receptor, mesmo que a hidrofobicidade e o número de aceitadores de ligação de hidrogênio-doadores permaneçam os mesmos. Em segundo lugar, o profiler de ER produziu tendências contrárias entre os níveis médios previstos e experimentais do LC50 com afinidade de ligação de er crescente (Figura 5). Isso pode ser porque a letalidade dos pais em um teste de toxicidade aguda não se deve à associação de ER, mas sim à narcose na maioria dos casos, ou ao ciclagem redox no caso da hidroquinona. Por exemplo, uma análise mais extensa, incluindo a toxicidade crônica, é necessária para um conjunto maior de EDs definir limitações preditivas da versão atual da caixa de ferramentas QSAR.

Esta pesquisa preliminar também pode ter implicações para a saúde pública porque esteroides (andrógenos, estrogênios, progestines e corticoides) e seus receptores exibem estruturas macromoleculares semelhantes ou mesmo idênticas em vertebrados5. Estes tipos de sistemas de sinalização endócrina análoga podem operar-se usando um mecanismo comum em eventos chaves de EDs5. No entanto, são necessárias metodologias adicionais e complementares para iluminar esse aspecto vasto e complexo [por exemplo, realizando modelagem computacional de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME), e/ou desfecho adverso via (AOP)]38. Além disso, porque a maioria das preocupações científicas e públicas levantadas sobre os efeitos adversos dos EDs estão relacionadas com suas toxicidades crônicas, melhorando as bases de dados e algoritmos na caixa de ferramentas QSAR e produzindo confiável Ecotoxicologia a longo prazo previsões para EDs são ambos necessários.

Este artigo demonstra a aplicação do QSAR Toolbox para comparar os valores de LC50 ecotoxicológicos para peixes com valores de log10Kow de EDs. ao longo do protocolo, ele resulta em relações fracas entre os dois parâmetros, como tem foi revelado por estudos prévios (por exemplo, Kim et al.39) que o log10Kow não é um bom preditor direto do LC aquático50. Apesar dessa limitação, este protocolo fornece uma revisão geral ou "vinheta" para descrever como usar o Dashboard para uma determinada finalidade, uma vez que é um aplicativo válido para usar a caixa de ferramentas QSAR para investigar correlações entre LC50 (ou er Binding afinidade) e log10Kow, ou como uma ferramenta para a triagem rápida de ecotoxicidade aguda. No entanto, deve-se notar que (1) iluminar a ligação entre o receptor de estrogênio obrigatório e toxicidade crônica, em vez de toxicidade aguda (letalidade), é mais relevante para que correlações mais claras podem ser encontradas, e (2) o receptor de andrógeno, juntos com o de estrogênio, também desempenha um papel crítico na toxicidade reprodutiva. Portanto, é necessário que a versão futura da caixa de ferramentas QSAR melhore as funções de previsão à luz desses dois pontos.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada pelo Conselho Nacional de pesquisa de ciência & tecnologia (NST) concessão pelo governo sul-coreano (MSIP) (não. CAP-17-01-KIST Europe) e projeto 11911.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
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de computador: Microsoft CorporationNAPropriedades recomendadas do sistema: (i) tipo de sistema: 64 bits, Microsoft Windows 7 ou mais recente, (ii) processador: I5 a 2,4 GHz ou processador mais rápido ou CPU AMD equivalente, (iii) Memória instalada (RAM): 6 GB de RAM, (iv) Unidade de disco rígido (HDD): 20 GB de espaço livre no disco rígido
Editor da MicrosoftMicrosoft CorporationNANecessário para carregar uma lista de substâncias de números CAS (modo de lote) para o QSAR Toolbox da OCDE como arquivo .txt (arquivo de texto)
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OCDE QSAR Toolbox versão 4.0 ou mais recenteOrganização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico
NANecessário para executar os Fluxos de Trabalho Automatizados do QSAR Toolbox da OCDE; download gratuito:
https://qsartoolbox.org/download/
OriginPro 9OriginLab CorporationNAPrograma opcional para análise de dados; ferramentas semelhantes possíveis
Sistema

Referências

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