Nós apresentamos um protocolo pequeno detalhado da reparação da biblioteca do RNA com menos viés do que métodos padrão e uma sensibilidade aumentada para 2 '-O-methyl RNAs. Este protocolo pode ser seguido usando reagentes caseiros para economizar custos ou usar kits para conveniência.
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Artigo de método
Melhorando O RNA-Seq pequeno: menos polarização e melhor deteção de 2 '-O-methyl RNAs
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estudo de pequenas RNAs (sRNAs) por sequenciamento de próxima geração (NGS) é desafiado por problemas de viés durante a preparação da biblioteca. Diversos tipos de sRNA tais como microRNAs da planta (miRNAs) carregam uma modificação 2 '-O-methyl (2 '-OMe) em seus 3 ' nucleotide terminal. Esta modificação acrescenta outra dificuldade, pois inibe 3 ' ligadura do adaptador. Nós demonstramos previamente que as versões modificadas do protocolo de TruSeq (TS) têm menos polarização e uma deteção melhorada de 2 '-OMe RNAs. Aqui nós descrevemos no protocolo do detalhe ' TS5 ', que mostrou o melhor desempenho total. TS5 pode ser seguido usando reagentes caseiros ou reagentes do kit TS, com desempenho igual.
Introdução
Pequenas RNAs (sRNAs) estão envolvidas no controle de uma diversidade de processos biológicos1. Os sRNAs regulatórios eucarióticos são tipicamente entre 20 e 30 NT de tamanho; os três tipos principais são microRNAs (miRNA), Piwi-interagindo RNAs (piRNA) e RNAs de interferência pequenas (siRNA). Os níveis de expressão de miRNA aberrantes têm sido implicados em uma variedade de doenças2. Isso ressalta a importância do miRNAs na saúde e na doença e a exigência de ferramentas de pesquisa quantitativas e precisas para detectar sRNAs em geral.
O sequenciamento de próxima geração (NGS) é um método am....
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Protocolo
1. isolamento de pequenas RNAs
- Extraia o RNA total usando reagentes à base de fenóis ou qualquer outro método. Verifique se o RNA é de boa qualidade.
- Pré-executar um 15% TBE-ureia gel (ver tabela de materiais) para 15 min em 200 V.
- Quando o gel for pre-running, misture 5-20 μg do RNA total em um volume de 5-15 μl com um volume igual do corante da carga do formamida (veja a tabela de materiais; 95% formamida deionizada, 0, 25% azul do bromofenol, 0, 25% cyanol do xileno, 5 milímetros de pH do EDTA 8) em um tubo do PCR de 200 μl. Do mesmo modo, misture 10 μL (200 ng) da escada do pequeno-RNA (veja a....
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Resultados
As etapas críticas são o isolamento da pequena fração de RNA do material de RNA total inicial (Figura 3) e o produto da biblioteca final desejada (Figura 4). Ambas as etapas envolvem a purificação do gel do poliacrilamida; o RNA pequeno é isolado dos géis da ureia de 15% TBE, quando as bibliotecas finais forem isoladas de 6% géis nativos de TBE. O RNA pequeno isolado do gel pode ser analisado em uma microplaqueta capilar pequena da electroforese do RNA (.......
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Discussão
A preparação pequena da biblioteca do RNA permanece desafiante devido ao viés, introduzida principalmente durante etapas da ligadura do adaptador. RNAs com uma modificação de 2 '-ome em sua extremidade 3 ' tal como miRNAs da planta, Pirna nos insetos, nematóides e mamíferos, e RNAs de interferência pequenos (siRNA) nos insetos e nas plantas são particularmente difíceis de estudar porque a modificação 2 '-ome inibe 3 ' a ligadura do adaptador. Uma série de soluções foram propostas na literatura para melhorar os protocolos.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de pesquisa científica (CNRS), as energias alternativas francesas e a Comissão de energia atômica (CEA) e a Universidade Paris-Sud. Toda a preparação da biblioteca, o sequenciamento de Illumina e as análises de Bioinformática para este estudo foram realizadas na instalação de sequenciamento da próxima geração do I2BC (NGS). Os membros da instalação do I2BC NGS são reconhecidos para a leitura crítica do manuscrito e sugestões úteis.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Instrumento Bioanalisador 2100 | Agilent | G2939BA | |
| Ácido-Fenol:Clorofórmio, pH 4.5 (com IAA, 125:24:1) | ThermoFisher | AM9720 | |
| Adenosina 5'-Trifosfato (ATP) | Nex England Biolabs | P0756S | |
| Agencourt AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent | 5067-4626 | ||
| Kit de RNA pequeno Bioanalyzer | Agilent | 5067-1548 | |
| Corning Costar Spin-X filtros de tubo de centrífuga | Sigma Aldrich | CLS8162-96EA | |
| Transiluminador de | leitor escuro vários suprimentos | ||
| Kit de PCR HotStart, com dNTPs | Kapa Biosystems | KK2501 | |
| NEXTflex kit de RNA-seq V3 pequeno | BIOO Scientific | NOVA-5132-05 | Géis opcionais |
| Novex TBE 6% | ThermoFisher | EC6265BOX | |
| Novex TBE Géis de ureia 15% | ThermoFisher | EC6885BOX | |
| QIAquick Kit de Remoção de Nucleotídeos | Qiagen | 28304 | |
| Qubit 4 Kit Inicial de Quantificação | ThermoFisher | Q33227 | |
| Qubit ssDNA Assay Kit | ThermoFisher | Q10212 | |
| Tinta de Carregamento de Gel de RNA (2X) | ThermoFisher | R0641 | |
| Corante de Carga de Gel de RNA (2X) | Inibidor | ThermoFisher R0641 | |
| , Murino | Nex England Biolabs | M0314S | |
| SuperScript IV Transcriptase reversa | ThermoFisher | 18090200 | |
| SYBR Gold Ácido nucleico Gel Stain | ThermoFisher | S11494 | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | Nex England Biolabs | M0204S | |
| T4 RNA Ligase 2, truncado | Nex England Biolabs | M0242S | |
| TrackIt 50 bp DNA escada | ThermoFisher | 10488043 | |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit | Illumina | RS-200-0012/24/36/48 | opcional |
| UltraPure Glycogen | ThermoFisher | 10814010 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher | EI0001 | |
| ZR pequena escada de RNA | Zymo Research | R1090 | |
| os dois últimos números correspondem ao conjunto de índices |
Referências
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
- Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8
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Reimpressões e permissões
