Artigo de método

Melhorando a exatidão da avaliação cytometric do fluxo do potencial mitochondrial da membrana em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor através da inibição de bombas do Efflux

DOI:

10.3791/60057

⸱

30 de julho de 2019

 ,  , 
1Ruth L. and David S. Gottesman Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine Research, Albert Einstein College of Medicine, 2Departments of Cell Biology and Stem Cell Institute, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 4Albert Einstein Cancer Center and Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine

Neste artigo

Resumo

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As bombas do efluxo de xenobiotic são altamente ativas na haste e nas pilhas Hematopoietic do progenitor (hspcs) e causam a extrusão de tmrm, uma tintura fluorescente potencial da membrana mitochondrial. Aqui, nós apresentamos um protocolo para medir exatamente o potencial mitochondrial da membrana nos hspcs por tmrm na presença de Verapamil, um inibidor da bomba do efluxo.

Resumo

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Como o metabolismo celular é um regulador chave da autorenovação de células-tronco hematopoiéticas (HSC), os vários papéis desempenharam as mitocôndria na homeostase hematopoiética têm sido extensivamente estudados por pesquisadores do HSC. Os níveis de atividade mitocondrial são refletidos em seus potenciais de membrana (Δm), que podem ser medidos por corantes catiônicos celulares, como TMRM (tetrametilrodamina, éster metílico). A capacidade de bombas de efluxo para expulsar esses corantes de células pode limitar a sua utilidade, no entanto. O viés de mensuração resultante é particularmente crítico na avaliação de HSCs, uma vez que os transportadores xenobióticos exibem níveis mais elevados de expressão e atividade em HSCs do que em células diferenciadas. Aqui, nós descrevemos um protocolo que utiliza o verapamil, um inibidor da bomba de efluxo, para medir exatamente o Δ, em várias populações de medula óssea. A inibição resultante da atividade da bomba é mostrada para aumentar a intensidade de TMRM em pilhas hematopoietic da haste e do progenitor (HSPCs), ao deixá-la relativamente inalterada em frações maduras. Isto destaca a atenção estreita à atividade do tingimento-efflux que é exigida quando os corantes Δm-dependentes são usados, e como escrito e visualizado, este protocolo pode ser usado para comparar com precisão as populações diferentes dentro da medula óssea, ou a mesma população em diferentes modelos experimentais.

Introdução

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As células-tronco hematopoiéticas (hscs) são autorenováveis, multipotentes e capazes de dar origem a todas as células do sangue1,2. O metabolismo celular é um regulador chave da manutenção do HSC, juntamente com fatores transcricionais, sinais intrínsecos e o microambiente3,4,5. O controle adequado da função e qualidade mitocondrial é, portanto,crítico para a manutenção do HSC6,7.

O potencial de membrana mitocondrial (Δ, m) é um parâmetro chave na avaliação das mitocôndrias, pois reflete diretamente sua funcionalidade, que deriva do equilíbrio da atividade de bombeamento de prótons na cadeia de transporte de elétrons e o fluxo de prótons através de F 1/FO ATP Synthase. Ambos são necessários (dependendo da expressão gênica e da disponibilidade de substrato) para a fosforilação dependente do oxigênio da ADP para o ATP8,9. Aproveitando-se da eletronegatividade do compartimento mitocondrial, vários corantes potenciométricos foram desenvolvidos para medir Δm. Um deles é o perclorato de éster metílico de tetrametilrhodamina (TMRM), que tem sido amplamente utilizado para medir Δ, por citometria de fluxo em uma variedade de células10, incluindo tronco hematopoiético e células progenitoras11.

Corantes mitocondriais devem ser usados com algum cuidado em HSCs, no entanto, porque a alta atividade das bombas de efluxo xenobiótica dessas células pode resultar em extrusão de corante12. Na verdade, a extrusão de corantes mitocondriais, como a Rhodamina 123 permitiu que os pesquisadores isolem HSCs13 ou identifiquem HSC "populações laterais" explorando a extrusão diferencial dos corantes Hoechst Blue e Hoechst Red14, 15. também foi demonstrado que o Fumitremorgin C, um bloqueador específico do transportador da subfamília G do membro 2 (ABCG2) do cassette de ligação ATP, não afeta o padrão de coloração de MitoTracker em HSPCs16. Após a publicação destes resultados, vários estudos foram realizados utilizando corantes mitocondriais na ausência de inibidores da bomba de efluxo xenobióticos, levando à impressão generalizada de que os HSCs têm apenas um pequeno número de mitocôndrias com baixo Δm16 , 17 anos de , de 18 anos.

Recentemente, demonstrou-se, entretanto, que Verapamil, um inibidor largo do espectro de bombas do efluxo, modifica significativamente o teste padrão de mancha do corante mitochondrial MitoTracker verde19. Esta discrepância é provavelmente devido ao fato de que Fumitremorgin C é altamente seletivo para Abcg2, enquanto os HSCs também expressam outros transportadores, como Abcb1a (que é apenas fraca sensível a Fumitremorgin C)19. Nós igualmente relatado que outras tinturas mitochondrial, tais como tmrm, laranja do acridina do Nonyl, e laranja de MitoTracker (mto) exibem os mesmos testes padrões que o verde de MitoTracker. Mais importante, observou-se que os padrões citométricos de fluxo de HSPCs refletem seu Δm em adição à massa mitocondrial11.

A ingestão de corante TMRM depende estritamente da carga negativa das mitocôndrias, mas o acúmulo resultante de corante está em constante equilíbrio entre sua ingestão e folga por bombas de efluxo20. A diferença na expressão da bomba de efluxo xenobiótico entre HSCs e populações de células maduras afeta esse equilíbrio e pode levar a resultados tendenciosos. O uso de inibidores dedicados como o verapamil deve ser considerado na análise de Δm por corantes potenciométricos. Aqui nós descrevemos um protocolo modificado para a medida exata do δ, m pela citometria de fluxo tmrm-baseada que corrige para a atividade do transportador do xenobióticos com o uso de nervos inibidores dedicados.

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Protocolo

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Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da faculdade de medicina Albert Einstein.

1. preparação de soluções

  1. Tampão de coloração (soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) + 2% de soro bovino fetal (FBS)): adicionar 10 mL de FBS em 500 mL de uma solução de PBS estéril.
    Nota: Esta solução pode ser armazenada a 4 ° c durante pelo menos um mês em condições estéreis. Antes de iniciar os seguintes procedimentos, coloque uma alíquota desta solução (50 mL) no gelo.
  2. Tampão lisando do ACK (cloreto de amônio-potássio): coloc uma alíquota do amortecedor de lise do ACK (1 ml) no gelo antes de começar o procedimento.
    Nota: Para preparar o mesmo tampão não comercial, dissolva 8, 2 g de NH4CL, 1 g de KHCO3 e 37,2 mg de na2EDTA em 1 L de H2o. Ajuste o pH para 7.2-7.4. Armazene por até 6 meses na temperatura ambiente.
  3. Meio de cultura: Adicionar 50 ng/mL fator de células-tronco (SCF) e 50 ng/mL de Trombopoietina (TPO) para o meio livre de soro para a cultura e expansão de células hematopoiéticas (ver tabela de material para meio comercial recomendado).
  4. Solução de stock TMRM: Prepare a solução de TMRM (1 μM) dissolvendo 5 μg de pó de TMRM em 10 mL de etanol. Guarde esta solução a-20 ° c protegida da luz.
  5. Solução de Verapamil: Prepare a solução de Verapamil (50 mM) diluindo 24 mg de Verapamil em 1 mL de etanol. Guarde esta solução a-20 ° c.
  6. Solução de ações da FCCP: Prepare a solução de Carbonilcianeto p-triflourometoxifenilhidrazina (FCCP) (1 M) dissolvendo 254 mg em 1 mL de etanol. Guarde esta solução a-20 ° c protegida da luz.

2. isolamento da medula óssea

  1. Eutanizar o rato por CO2 inalação seguindo as diretrizes institucionais e pulverizar os camundongos com 70% etanol.
    Nota: Este passo impede a contaminação das células de interesse sem comprometer os resultados experimentais.
  2. Usando um par de fórceps e tesouras afiadas, faça um Snip pequeno na pele ventral do rato e estique a pele.
  3. Extraia o fêmur e a tíbia, tomando cuidado para não desalojar as cabeças do fêmur, pois elas contêm uma grande quantidade de células da medula óssea. Coloque os ossos removidos em uma placa de 6 poços preenchida com 1,5 mL de tampão de coloração.
    Nota: Este procedimento não exige a área estéril.
  4. Retire os músculos dos ossos e corte as extremidades dos ossos permitindo a saída da medula óssea (Figura 1a). Coloque os ossos limpos em novos poços com 1,5 mL de tampão de coloração.
    Nota: Os músculos e outros tecidos devem ser cuidadosamente removidos para evitar entupimento da seringa na próxima etapa.
  5. Lave a medula óssea utilizando uma seringa de 3 mL com uma agulha de 25 G.
    Nota: Continuar a esvaziar a medula óssea até que o osso se torne branco (Figura 1b).
  6. Colete todas as células em um tubo de 1,5 mL, centrifugue por 5 min a 180 x g e descarte o sobrenadante (Figura 1C).
  7. Ressuscite o pellet em 300 μL de gelo frio ACK lise tampão com muito cuidado, coloque no gelo por 1 min e lise imediatamente inativa, adicionando 1 ml de mancha tampão. Centrifugador por 5 min a 180 x g.
    Nota: O pellet células aparece branco (Figura 1D). O número total de células isoladas é de cerca de 2-4 x 107.
  8. Ressuscitação das pelotas em 1 mL de tampão de coloração e filtro usando uma tampa de peneira celular (12 x 75 mm2,5ml de capacidade) com uma malha de nylon de 35 μm incorporada para obter células mononucleares. Após o bloqueio, mantenha a amostra no gelo.

3. imunocoloração para detecção de HSC

  1. Prepare o cocktail Lineage (Lin). Em 400 μL de tampão de coloração, adicionar 4 μL dos seguintes anticorpos biotinilados contra CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, NK 1.1, IgM e Il7Ra para obter uma diluição final 1:100.
  2. Prepare os fluoróforos conjugados-anticorpos (ABS). Em 400 μL de tampão de coloração, adicionar 4 μL do seguinte ABS para obter uma diluição final 1:100. Streptavidin-Pacific Blue, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy 5.5 e CD34-FITC. Mantenha no gelo, protegido da luz.
  3. Centrifugue a amostra durante 5 min a 180 x ge, em seguida, elimine o sobrenadante.
  4. Adicionar 400 μL de solução de cocktail Lin ao pellet de células. Adicionar 4 μL de CD135-biotinilado AB. Vortex rapidamente para misturar e incubar por 30 min no gelo.
  5. Lave a amostra adicionando 3 mL de tampão de coloração, gire para baixo por 5 min a 180 x g e descarte o sobrenadante.
  6. Adicionar 400 μL de solução de ABS. Vortex rapidamente para misturar e incubar por 30 min no gelo.
  7. Lave as amostras com 3 mL de tampão de coloração, gire para baixo por 5 min a 180 x g e descarte o sobrenadante.

4. coloração TMRM

  1. Prepare a solução de coloração TMRM. Adicionar 2,2 μL de solução de stock de TMRM e 1,1 μL de Verapamil (2 nM e 50 μM como concentração final, respetivamente) em 1,1 mL de meio livre de soro para cultura e expansão de células hematopoiéticas (ver tabela de material para meio comercial recomendado) com TPO e SCF.
    Nota: Este é o passo mais importante do protocolo. A adição de Verapamil é necessária para bloquear as bombas de efluxo que são altamente expressas nos HSCs e podem expulsar TMRM.
  2. Ressuscitar a medula óssea em 1 mL de solução de coloração de TMRM, vórtice rapidamente e incubar por 1 h a 37 ° c.
    Nota: A coloração de TMRM não deve ser lavada. O controle de compensação PE-dedicado também é redobrado em 100 μL de solução de coloração de TMRM e submetido à incubação por 1 h a 37 ° c após o vórtice rápido.
  3. Filtre a amostra usando uma tampa de filtro de células (12 x 75 mm2,5ml de capacidade) com uma malha de nylon de 35 μm incorporada para evitar entupimento do citometro de fluxo.
    Nota: A coloração por TMRM aumenta a possibilidade de formação de entupimento na amostra. A filtração da amostra pouco antes dos ensaios de fluxo é recomendada.
  4. Adicionar 1 μL de 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para excluir células mortas por citometria de fluxo.

5. aquisição por Citometro de fluxo

  1. Executar amostra de medula óssea e adquirir pelo menos 1 x 106 eventos.
  2. Configurar a estratégia de gating para identificar as diferentes populações hematopoiéticas (Figura 2).
    1. Mostre pilhas mono-nucleares da medula óssea viva (BM-MNCs), DAPI-fração, no lote para o azul Pacífico para identificar CD135−Lin− (Lin−) e Lin+ frações.
    2. Plotar Lin− fração para APC/Cy7 (c-Kit) versus PE/Cy7 (SCA-1) para identificar a fração de progenitores MULTIPOTENTES (MPP), como c-kit+ e SCA-1+.
    3. Plotar a fração MPP para APC (CD48) versus PerCP/Cy 5.5 (CD150) para identificar a fração HSC, como CD150+ e CD48−.
    4. Mostre a fração HSC para FITC (CD34) para dividir CD34−-HSC e CD34+-HSC.
  3. Adquira a intensidade de TMRM (canal de PE) em cada população.
  4. Após a aquisição, acrescente à amostra 1 μL de FCCP para obter a concentração final de 1 mM e incubar a 37 ° c por 5 min, depois adquira 1 x 106 eventos.
    Nota: FCCP é um desengate mitocondrial que é usado para dissipar o Δm. Ele é usado como controle experimental para confirmar que a coloração TMRM funciona corretamente. Após a administração da FCCP, a intensidade do TMRM deve ser drasticamente diminuída (Figura 3a).
  5. Analisar dados normalizando a intensidade média de PE de cada população pela intensidade de PE de todas as BM-MNCs.

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Resultados

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O protocolo descrito acima permite o isolamento fácil de BM-MNCs a partir de um modelo de mouse. A Figura 1 resume as principais etapas do protocolo: isolamento ósseo, rubor da medula óssea, lise de glóbulos vermelhos e coloração de anticorpos seguida de coloração por TMRM para medir o potencial da membrana mitocondrial em uma população hematopoiética específica .

As BM-MNCs contêm várias populações de células, incluindo HSCs. Os coquetéis de anticorpos utilizados...

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Discussão

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A medida do potencial de membrana mitocondrial é uma pedra angular da análise e avaliação das mitocôndrias, que são críticas ao estado metabólico da célula. Aqui, nós descrevemos um protocolo para a análise de Δm pela mancha de TMRM. O TMRM é um corante fluorescente que se acumula nas mitocôndrias ativas devido a Δm, e seus respectivos níveis permanecem em equilíbrio entre os compartimentos extracelular, citoplasmático e mitocondrial10. Este protocolo pode ser adaptado para vários corantes, inclui...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a todos os membros do laboratório Ito, especialmente K Ito e H Sato, e o Einstein Stem Cell Institute para comentários e as instalações do núcleo de citometria de fluxo de Einstein e Imaging analítico (financiado pelo National Cancer Institute Grant p30 CA013330) para ajudar a realizar os experimentos. O K.I. é apoiado por doações dos institutos nacionais de saúde (R01DK98263, R01DK115577 e R01DK100689) e do departamento de saúde de Nova York como diretor principal da genômica/Epigenômica de célula única de Einstein (C029154). K.I. Ito é um estudioso de pesquisa da sociedade de leucemia e linfoma.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tampão de licitação ACKLife TechnologiesA1049201
B220-biotinaBD Bioscience553086
CD3e-biotinaLife Technologies13-0031-85
CD4-biotinaFischer ScientificBDB553782
CD8-biotinaLife Technologies13-0081-85
CD11b-biotinaBD Bioscience553309
CD19-biotinaBD Bioscience553784
CD34-FITCeBioscience11-0341-85
CD48-APCeBioscience17-0481-82
CD135-biotinaeBioscience13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5 Biolegend115922
c-kit-APC/Cy7Biolegend105826
Ciclosporina HMillipore SigmaSML1575-1MG
Solução DAPI (1 mg/mL)Life Technologies62248
Soro Fetal Bovino (FBS)DenvilleFB5001-H
FCCP Millipore SigmaC2920-10MG
Gr1-biotina Biolegend108404
IgM-biotinaLife Technologies13-5790-85
Il7Rα-biotinaeBioscience13-1271-85
Nk1.1-biotinaFischer ScientificBDB553163
Fosfato tamponado salino (PBS)Life Technologies10010023
Sca-1-PE/Cy7eBioscience25-5981-81
SCF murinoPEPROTECH250-03-10UG
StemSpan SFEM médioSTEMCELL technologies9605
Streptavidin-Pacific BlueeBioscience48-4317-82
Ter119-biotinaFischer ScientificBDB553672
TMRMMillipore SigmaT5428-25MG
TPOPEPROTECH315-14-10UG
Cloridrato de VerapamilMillipore SigmaV4629-1G

Referências

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  1. Weissman, I. L., Anderson, D. J., Gage, F. Stem and progenitor cells: origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 17, 387-403 (2001).
  2. Morrison, S. J., Shah, N. M., Anderson, D. J. Regulatory mechanisms in stem cell biology. Cell. 88 (3), 287-298 (1997).
  3. Wilson, A., et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
  4. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  5. Frenette, P. S., Pinho, S., Lucas, D., Scheiermann, C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annual Review of Immunology. 31, 285-316 (2013).
  6. Ito, K., Bonora, M., Ito, K. Metabolism as master of hematopoietic stem cell fate. International Journal of Hematology. 109 (1), 18-27 (2019).
  7. Ito, K., et al. Self-renewal of a purified Tie2+ hematopoietic stem cell population relies on mitochondrial clearance. Science. 354 (6316), 1156-1160 (2016).
  8. Bonora, M., et al. ATP synthesis and storage. Purinergic Signal. 8 (3), 343-357 (2012).
  9. Walker, J. E. The regulation of catalysis in ATP synthase. Current Opinion in Structural Biology. 4 (6), 912-918 (1994).
  10. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophysical Journal. 76, 469-477 (1999).
  11. Bonora, M., Ito, K., Morganti, C., Pinton, P., Ito, K. Membrane-potential compensation reveals mitochondrial volume expansion during HSC commitment. Experimental Hematology. 68, 30-37 (2018).
  12. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine. 3 (12), 1337-1345 (1997).
  13. Spangrude, G. J., Johnson, G. R. Resting and activated subsets of mouse multipotent hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (19), 7433-7437 (1990).
  14. Scharenberg, C. W., Harkey, M. A., Torok-Storb, B. The ABCG2 transporter is an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human hematopoietic progenitors. Blood. 99 (2), 507-512 (2002).
  15. Zhou, S., et al. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine. 7 (9), 1028-1034 (2001).
  16. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  17. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, 13125(2016).
  18. Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119 (21), 4898-4907 (2012).
  19. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  20. Hall, A. M., Rhodes, G. J., Sandoval, R. M., Corridon, P. R., Molitoris, B. A. In vivo multiphoton imaging of mitochondrial structure and function during acute kidney injury. Kidney International. 83 (1), 72-83 (2013).
  21. Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors. Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).
  22. Nicolli, A., Basso, E., Petronilli, V., Wenger, R. M., Bernardi, P. Interactions of cyclophilin with the mitochondrial inner membrane and regulation of the permeability transition pore, and cyclosporin A-sensitive channel. The Journal of Biological Chemistry. 271 (4), 2185-2192 (1996).
  23. Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).

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