Método de Electroporation para in vivo entrega de DNA plasmídeo no adulto zebrafish Telencephalon

Resumo

É apresentado aqui um método do Electroporation para a entrega do ADN do plasmídeo e a rotulagem da pilha ependymoglial no telencephalon adulto do zebrafish. Este protocolo é um método rápido e eficiente para visualizar e traçar células ependymogliais individuais e abre novas possibilidades para aplicar a eletroporação a uma ampla gama de manipulações genéticas.

Resumo

O electroporation é um método do transfection em que um campo elétrico é aplicado às pilhas para criar pores temporários em uma membrana de pilha e para aumentar sua permeabilidade, desse modo permitindo que as moléculas diferentes sejam introduzidas à pilha. Neste papel, o electroporation é usado para introduzir plasmídeos às pilhas ependymoglial, que alinham a zona ventricular do telencephalon adulto do zebrafish. Uma fração dessas células mostra Propriedades de células-tronco e gera novos neurônios no cérebro zebrafish; Portanto, estudar seu comportamento é essencial para determinar seus papéis na neurogênese e regeneração. A introdução de plasmídeos através do Electroporation permite a rotulagem e o seguimento a longo prazo de uma única pilha ependymoglial. Além disso, os plasmímids tais como o recombinase do CRE ou o Cas9 podem ser entregados às únicas pilhas ependymoglial, que permite a recombinação do gene ou a edição do gene e fornece uma oportunidade original de avaliar a função autônoma do gene da pilha em um controlado, natural Ambiente. Finalmente, este protocolo detalhado, passo a passo do Electroporation é usado para obter a introdução bem sucedida de plasmídeos em um grande número de únicas pilhas ependymoglial.

Introdução

Zebrafish são excelentes modelos animais para examinar a regeneração cerebral após uma ferida de ferimento de facada. Em comparação com os mamíferos, na escada evolutiva, espécies menos evoluídas como o zebrafish geralmente apresentam taxas mais elevadas de neurogênese constitutiva e áreas mais amplas de residência neural adulta de células-tronco, levando à geração constante de novos neurônios ao longo a maioria das áreas cerebrais na vida adulta. Esta característica parece correlacionar com significativamente maior capacidade regenerativa de zebrafish em comparação com os mamíferos¹, como zebrafish têm notável potencial para gerar eficientemen....

Protocolo

Todos os animais utilizados neste protocolo foram mantidos condições de manejo padrão, e experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos de manuseio da UE e do governo da Alta Baviera (AZ 55.2-1-54-2532-0916).

1. preparação da mistura plasmídeo para electroporação

1. Diluir o plasmídeo de interesse em água estéril e adicionar solução de estoque de mancha verde rápido [1 mg/mL]. Certifique-se de que a concentração final do plasmídeo é ~ 1 μg/μL. Adicione a mancha em uma concentração de não mais de 3%, porque seu único objetivo é colorir a solução e visualizar a injeção ventricular.
2. Uma vez preparado,....

Resultados

O método de eletroporação descrito permite a entrega do DNA plasmídeo em células ependimogliais, localizadas superficialmente no telencédigo zebrafish e logo abaixo da camada de células ependímicas dorsais (Figura 1a).

Se o resultado da eletroporação for positivo, rotulados células ependymogliais únicas (células vermelhas na Figura 2a, b) podem ser observadas entre outras células ep.......

Discussão

Este protocolo do Electroporation é um método in vivo de confiança de etiquetar pilhas ependymoglial individuais. O protocolo pode precisar de uma adaptação adicional para rotular outros tipos de células, como neurônios ou oligodendrócitos. Para conseguir a rotulagem bem sucedida, os plasmídeos que contêm promotores diferentes podem ser usados. O promotor da galinha-beta actina, o eF1alpha, o CMV e o promotor do ubiquitin foram usados previamente para conduzir a expressão de transgenes diferentes no ependymoglia e em seu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente/Material
Verde Rápido	Sigma-Aldrich	F7258-25G	Para colorir a solução de plasmídeo
MS222	Sigma-Aldrich	A5040-25G	MS222 deve ser armazenado em RT (até duas semanas) e protegido da luz Gel de
ultrassom	SignaGel, Parker laboratories INC.	15-60	Eletrodo Gel
Equipamento
Bomba de ar	TetraTec APS 50, 10l-60l		Pode ser comprado nas lojas de animais
BTX Tweezertrodes Eletrodos	Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus	45-0486
Dispositivo de eletroporação	BTX ECM830 Sistema de eletroporação de onda quadrada, BTX Harvard Apparatus	45-0662
Dispositivo de injeção	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013
Parede Padrão Borosillicate Glass Capillary	Warner Instruments	64-0766	Modelo nº: G100-4
Pontas de microcarregador	Eppendorf	5242956003
Micro-faca	Fine Science Tools	10056-12
Micromanipulador	de joystickNarishige Japan	MN - 151
Porta-agulhas	FemtoJet 4i, Eppendorf	5252000013	O porta-agulhas vem junto com o dispositivo de injeção
Dispositivo de puxar agulhas	Narishige Japão	Modelo nº: PC-10	O PC-10 foi descontinuado pela Narishige em 2017 e substituído pelo PC-100
Placas de Petri	Greiner Bio-One International	633161

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