Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro

O transplante de células-tronco hematopoiéticas alogênicas (TMO) é uma terapia eficaz para tratar malignidades hematológicas^1,2 através do efeito enxerto-versus-leucemia (GVL)³. No entanto, os linfócitos doadores sempre montam ataques imunológicos indesejados contra tecidos receptores, um processo chamado doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD)⁴.

Os modelos murine de GVHD são uma ferramenta eficaz para estudar a biologia do GVHD e a resposta GVL⁵. Camundongos são um modelo animal de pesquisa econômico. São pequenos e eficientemente dosados com moléculas e biológicas nas fases iniciais do desenvolvimento⁶. Camundongos são animais de pesquisa ideais para estudos de manipulação genética por serem geneticamente bem definidos, o que é ideal para estudar caminhos biológicos e mecanismos⁶. Vários modelos de complexo de histocompatibilidade maior estrito do mouse (MHC) MHC-incompatíveis de GVHD foram bem estabelecidos, tais como C57BL/6 (H2^b) para BALB/c (H2^d) e FVB (H2^q)→C57BL/6 (H2^b)^5,7. Estes são modelos particularmente valiosos para determinar o papel de tipos de células individuais, genes e fatores que afetam o GVHD. Transplante de C57/BL/6 (H2^b) doadores parentais para receptores com mutações no MHC I (B6.C-H2^bm1) e/ou MHC II (B6.C-H2b^m12) revelaram que uma incompatibilidade tanto na classe MHC I quanto na classe II é um requisito importante para o desenvolvimento do GVHD agudo. Isso sugere que tanto as células CD4⁺ quanto CD8⁺ T são necessárias para o desenvolvimento da doença^7,8. GVHD também está envolvido em uma cascata inflamatória conhecida como a "tempestade de citocinas pró-inflamatórias"⁹. O método de condicionamento mais comum em modelos de murina é a irradiação corporal total (TBI) por raio-X ou ¹³⁷Cs. Isso leva à ablação da medula óssea do receptor, permitindo assim o enxerto de células-tronco do doador e prevenindo a rejeição do enxerto. Isso é feito limitando a proliferação de células T receptoras em resposta às células doadoras. Além disso, as disparidades genéticas desempenham um papel importante na indução da doença, que também depende da menor incompatibilidade^{mhc-incompatível 10}. Portanto, a dose mieloablativa de irradiação varia em diferentes cepas de camundongos (por exemplo, BALB/c→C57BL/6).

A ativação de células T doadoras por células apresentadoras de antígenos hospedeiros (APCs) é essencial para o desenvolvimento do GVHD. Entre os APCs, as células dendríticas (DCs) são as mais potentes. Eles são herdavelmente capazes de induzir GVHD devido à sua captação superior de antígenos, expressão de moléculas co-estimuladoras de células T e produção de citocinas pró-inflamatórias que polarizam as células T em subconjuntos patogênicos. Os DCs receptores são fundamentais para facilitar a escorva de células T e a indução de GVHD após o transplante^11,12. Assim, os DCs tornaram-se alvos interessantes no tratamento do GVHD¹².

O TCE é necessário para melhorar o enxerto celular do doador. Devido ao efeito TBI, os DCs receptores são ativados e sobrevivem por um curto período de tempo após o transplante¹². Apesar dos grandes avanços no uso da bioluminescência ou fluorescência, estabelecer um modelo eficaz para estudar o papel dos DCs receptores no GVHD ainda é desafiador.

Como as células T doadoras são a força motriz para a atividade da GVL, estratégias de tratamento usando drogas imunossupressoras, como esteróides, para suprimir a aloreatividade das células T, muitas vezes causam recaída ou infecção^{tumoral 13}. Portanto, direcionar os DCs receptores pode fornecer uma abordagem alternativa para tratar o GVHD, preservando o efeito GVL e evitando a infecção.

Em resumo, o presente estudo fornece uma plataforma para entender como diferentes tipos de sinalização em DCs receptoras regulam o desenvolvimento de GVHD e o efeito GVL após o TMO.

Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais da Universidade da Flórida Central.

1. Indução GVHD

NOTA: O transplante de células de medula óssea alogênica (BM) (etapa 1.2) é realizado dentro de 24h após a irradiação. Todos os procedimentos descritos abaixo são realizados em ambiente estéril. Realize o procedimento em uma capa de cultura de tecido e use reagentes filtrados.

1. Dia 0: Prepare os ratos receptores.
   1. Use camundongos do tipo selvagem feminino (WT) em um fundo BALB/c (CD45.2⁺ H2k^d+), 10-12 semanas de idade como destinatários.
   2. Tag ear e pesar os receptores antes do TBI. Em seguida, coloque até 11 ratos na câmara de irradiação e mantenha-os no irradiador. Irradie em uma dose única de 700 cGy por 10-15 min.
   3. Devolva animais irradiados para as gaiolas e os abriga em instalações livres de patógenos antes do transplante.
      NOTA: O peso corporal mínimo dos receptores deve ser de cerca de 20 g. Use este peso como referência para calcular a perda de peso corporal durante o período experimental.
2. Dia 1: Preparar medula óssea empobrecida com células T (TCD-BM) dos camundongos doadores.
   1. Eutanásia CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 camundongos por asfixia de CO₂ e aguardem por 2-3 min até ficarem inconscientes. Realizar a luxação cervical como uma eutanásia secundária, se necessário.
   2. Coloque cada rato em uma tábua de trabalho limpa. Higienize a pele e a pele com 70% de isopropanol.
   3. Recolher a tíbia e o fêmur de ambas as pernas usando fórceps e tesouras. Coloque-os em RPMI frio contendo 1% de FCS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina e 2 mM L-glutamina (1% RPMI) em tubos cônicos de 50 mL. Limpe bem o fêmur e os ossos da tíbia removendo todos os tecidos musculares usando fórceps e tesouras. Transfira o fêmur e a tíbia dos tubos cônicos de 50 mL para uma placa de Petri de 92 mm de diâmetro contendo 1% de RPMI.
   4. Com uma tesoura, corte as pontas do fêmur ou da tíbia. Encha um tubo de 50 mL com 25 mL de 1% de meio RPMI 1640. Use isso para encher uma seringa de 3 mL presa a uma agulha de 26 G com 3 mL de 1% de RPMI. Insira esta seringa no osso e empurre o êmbolo para tirar a medula óssea (BM) da cavidade para dentro do tubo de coleta com 1% de RPMI (~3 mL/osso).
   5. Repita o passo 1.2.4 para todos os ossos restantes da tíbia e do fêmur de outros camundongos doadores. Mantenha todos os tubos de coleta no gelo.
   6. Faça a suspensão de uma única célula lavando os pedaços de medula óssea através de um filtro de células de malha de 75 μm. Recolher a suspensão unicelular em um tubo de 50 mL.
   7. Tubos de centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Aspire e descarte o sobrenadante. Resuspender a pelota no tampão PBS contendo 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) a 20 x 10⁶ células/mL. Guarde uma alíquota de 2 x 10⁶ células para coloração de pureza.
   8. Adicione o anticorpo Thy 1 a 0,05 μg/10⁶ células¹⁴ e incubar por 30 min a 4 °C. Lave uma vez com 25 mL de PBS gelada. Resuspender a 20 x 10⁶/mL em 0,5% BSA/10% de complemento de coelho jovem/2% DNase (10.000 U/mL em H₂O estéril). Incubar por 45 min a 37 °C e lavar 2x como antes.
      NOTA: As células T são esgotadas usando um mAb específico para Thy1, uma proteína expressa por todas as células T, mas não por outros leucócitos.
   9. Resuspender as células em 20 mL de tampão PBS contendo 0,5% de BSA. Conte as células de medula óssea em 1% de ácido acético usando um hemocytometro. Mantenha uma alíquota de 2 x 10⁶ células para uma verificação de pureza por citometria de fluxo após a purificação celular.
      NOTA: Um rato doador normalmente gera cerca de 25 x 10⁶ TCD-BM.
   10. Use citometria de fluxo para confirmar um esgotamento bem sucedido da célula T. Mancha 1 x 10⁶ células, preservadas das etapas 1.2.7 (antes do esgotamento da célula T) e 1.2.9 (TCD-BM após esgotamento da célula T) com os seguintes anticorpos: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6.7).
3. Dia 1: Prepare células T dos ratos doadores
   1. Use cd45.2⁺ H2k^b+ C57BL/6 camundongos do tipo selvagem (WT) como doadores para células T.
   2. Eutanie camundongos C57BL/6 por asfixia por dióxido de carbono (CO₂) conforme descrito em 1.2.1.
   3. Limpe bem a pele e a pele do rato com 70% de etanol. Excise baços e linfonodos e separe-os em uma única suspensão celular de esplenocites usando um êmbolo de seringa e filtros de malha de 40 μm. Lave o filtro e o êmbolo de seringa com 1% de RPMI (1% FBS contendo mídia RPMI) para coletar todos os esplenocitos.
   4. Centrifugar a suspensão celular a 800 x g por 5 min a 4 °C. Adicionar 5 mL de tampão de revestimento ACK (1 mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7.2) depois de descartar o sobrenadante. Incubar a suspensão celular por 5 min em temperatura ambiente.
      NOTA: O tampão de lyse ACK é usado para a repressão de glóbulos vermelhos.
   5. Adicione 5 mL de 1% rpmi para parar a lésia. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
   6. Prepare o tampão de classificação celular ativado por gelo (MACS) (0,5% BSA, 2 mM EDTA em PBS, pH 7.2). Degas o buffer antes de usar. Resuspenda as pelotas de célulaem 5 mL de tampão MACS.
   7. Conte os esplenocites e verifique as células vivas e mortas usando um hemocytometer e 1% de trippan azul. Guarde uma alíquota de 2 x 10⁶ células para avaliar o rendimento de purificação com análise de citometria de fluxo.
   8. Resuspender os esplenocites na concentração de 200 x 10⁶/mL no tampão MACS. Adicionar 0,03 μL de biotina anti-mouse-Ter-119, 0,03 μL de biotina anti-rato-CD11b, 0,03 μL de biotina anti-mouse-CD45R e 0,03 μL de biotina anti-mouse-DX5 por 10⁶ células. Incubar por 15 min a 4 °C.
      NOTA: Biotina anti-mouse-Ter-119, biotina anti-mouse-CD11b, biotina anti-rato-CD45R e biotina anti-mouse-DX5 foram usadas para reagir com células eritróidas, granulócitos, células B e NK, respectivamente. Portanto, esses subconjuntos celulares estão esgotados na etapa^{seguinte 15}.
   9. Adicione 10 mL de tampão MACS gelado à suspensão celular. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
   10. Resuspender as pelotas celulares no tampão MACS a uma concentração de 100 x 10⁶/mL. Adicione microesferas anti-biotina (0,22 μL/10⁶ células) à suspensão do esplenocite. Misture bem e incubar por mais 15 min a 4 °C. Lave a suspensão celular uma vez com 10 mL de tampão MACS gelado. Centrifugação a 800 x g por 5 min a 4 °C e descarte o sobrenadante.
   11. Coloque uma coluna de separação magnética no campo magnético. Enxágüe a coluna com 3 mL de tampão MACS. Deixe a suspensão da célula na coluna. Coletar o fluxo constituído por células T não encadernadas e enriquecidas, em um novo tubo cônico de 15 mL. Lave a coluna MS com 3 mL de tampão MACS gelado.
       NOTA: Certifique-se de que a coluna está vazia antes de executar as etapas de lavagem.
   12. Centrifugar a suspensão celular a 800 x g por 5 min a 4 °C. Resuspenda a pelota celular em 5 mL de tampão MACS.
   13. Conte as células em azul trippan de 1% usando um hemocytometro. Guarde uma alíquota de 2 x 10⁶ células para uma verificação de pureza por citometria de fluxo.
       NOTA: O rendimento médio das células T esplênicas isoladas por este método é de ~20-25 x 10⁶ células por rato.
   14. Confirme o rendimento do enriquecimento da célula T por citometria de fluxo. Mancha 1 x 10⁶ células, preservadas das etapas 1.3.7 (antes do esgotamento da célula T) e 1.3.13 (TCD-BM após o esgotamento da célula T), com os seguintes anticorpos: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6.7).
4. Dia 1: Injete camundongos irradiados com células T doadoras e TCD-BM.
   1. Lave as células TCD-BM e T 2x com PBS (800 x g para 5 min a 4 °C). Resuspenda as células em PBS frio para injeção. Ajuste a concentração celular para 20 x 10⁶/mL para TCD BM e 4 x 10⁶/mL para células T.
   2. Aqueça o animal usando uma lâmpada de aquecimento para aumentar a visibilidade das veias traseiras bilaterais. Se necessário, coloque o rato em uma contenção.
   3. Limpe a superfície da cauda usando 70% de isópropanol. Injetar TCD-BM (5 x 10⁶ células/mouse) com ou sem células T (0,75 x 10⁶ células/mouse). Tenha cuidado para não introduzir ar na seringa.
   4. Remova a agulha e aplique um cotonete anti-séptico diretamente no local da injeção 5-10 s para parar qualquer sangramento.
5. Avalie o GVHD nos dias 2-80.
   1. Acompanhe a sobrevivência dos animais. Monitore os sinais clínicos de GVHD adaptados do sistema de pontuação estabelecido anteriormente por Cook et al.¹⁶ e o peso corporal dos camundongos receptores 2x por semana. Use o peso corporal determinado antes do TCE para calcular a perda de peso corporal.
   2. Pesar cada rato individualmente. Escore a perda de peso da seguinte forma: grau 0 = menos de 10%; grau 1 = 10%-20%; grau 2 = mais de 20%.
   3. Pontuação o sinal de postura dos beneficiários: grau 0 = sem palpite; grau 0,5 = leve palpite, mas endireita-se ao caminhar; grau 1 = animal permanece curvado ao caminhar; grau 1,5 = animal não se endireita; grau 2.0 = pé animal nos dedos traseiros.
   4. Pontuação o sinal de mobilidade dos beneficiários: grau 0 = muito ativo; grau 0,5 = mais lento que camundongos ingênuos; grau 1,0 = movimentos somente quando cutucados; grau 1,5 = movimentos ligeiramente quando cutucados; grau 2.0 = não se move quando cutucado.
   5. Pontuação da pele dos receptores: grau 0 = sem escoriações, lesões ou escala; grau 0,5 = vermelhidão em uma área específica; grau 1 = abrasão em uma área ou abrasão leve em duas áreas; grau 1,5 = escoriações graves em duas ou mais áreas; grau 2.0 = escoriações graves, pele rachada, sangue seco.
   6. Pontuação da pele dos receptores: grau 0 = sem sinais anormais; grau 0,5 = ridicularização na lateral da barriga ou nuca do pescoço, grau 1,0 = desviamento através ou do lado da barriga e pescoço; grau 1,5 = pele emaranhada e babada; grau 2.0 = pele mal emaranhada na barriga e nas costas.
   7. Pontuação da diarreia dos beneficiários: grau 0 = sem diarreia; grau 0,5 = fezes leves e macias; grau 1,0 = leve (fezes amarelas); grau 1,5 = moderado (fezes amarelas com um pouco de sangue); grau 2 = grave (fezes amarelas e ensanguentadas, "fezes de bolo seco" aparecem na área anal).

2. Modelo de Cotransplante

1. Gerar células dendríticas derivadas da medula óssea (BM-DCs).
   1. Isole a medula óssea dos fêmures e tíbias de TW ou fator B (fB)^-/- camundongos no fundo B6 conforme descrito nos passos 1.2.3-1.2.4. Gire as células a 800 x g por 5 min.
   2. Ressuspensão da pelota em 5 mL de tampão de latrização ACK para lésis de glóbulos vermelhos. Incubar a suspensão celular por 5 min no gelo. Adicione 10 mL de 1% rpmi à suspensão celular para parar a lésia e centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
   3. Resuspender as pelotas celulares em 10 mL de mídia de cultura (RPMI 1460 contendo 10% FBS, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2 mM l-glutamina e 50 mM β-mercaptoetanol) e ajustar o volume para atender à concentração final de 2 x 10⁶ células/mL.
   4. Adicione o fator estimulante da colônia de granulocyte-macrófago de 20 ng/mL (GM-CSF) à suspensão celular. Cultura as células de medula óssea em placas de Petri de 100 x 15 mm a 37 °C em 5% de CO₂ por 6 dias.
   5. Substitua metade da mídia de cultura em curso (cerca de 5 mL) por mídias frescas contendo 40 ng/mL GM-CSF no dia 3.
   6. Pré-aqueça a mídia cultural em um banho de água a 37 °C. Colete cerca de 5 mL da mídia dos pratos de cultura de medula óssea. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Resuspender a pelota de célula em meios de cultura de 5 mL contendo 40 ng/mL GM-CSF.
   7. Adicione 25 μg/mL de lipopolissacarídeo (LPS) à mídia no dia 6 da cultura para amadurecer os BM-DCs. Salve uma alíquota de 2 x 10⁶ células para determinar a eficácia da diferenciação dc por citometria de fluxo.
   8. Coletar BM-DCs maduros: Use elevadores de célulapara raspar suavemente DCs das placas de Petri. Recolher todas as suspensões celulares em tubos cônicos de 50 mL. Centrífuga a 800 x g,por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Lave as pelotas de célula3x com 50 mL de PBS gelado. Economize cerca de 2 x 10⁶ BM-DCs para análise de fenótipo imunológico por citometria de fluxo.
2. Realizar co-transplante de células dendríticas de TMO (TMO COTRANSPLANTE DC-cotransplante).
   NOTA: Use camundongos FVB (H2k^q) como doadores para células T e células BM. Irradiar B6 Ly5.1 camundongos receptores em uma dose de 1.100 cGy (2 doses, intervalo de 3 h). Veja detalhes na etapa 1.1.
   1. Isolar bm de fêmures e tíbias dos camundongos doadores do FVB. Veja detalhes nas etapas 1.2.3-1.2.10.
      NOTA: Use medula óssea total isolada em vez de TCD-BM neste modelo.
   2. Purificar células T dos baços e linfonodos dos camundongos doadores do FVB. Veja detalhes nas etapas 1.3.1-1.3.13.
   3. Injete BM (5 x 10⁶/mouse), Células T (0,5 x 10⁶/mouse) com BM-DCs (2 x 10⁶/mouse) no dia 0 do curso experimental.
   4. No 3º dia após o transplante, examine a reconstituição do doador DC por citometria de fluxo.
      1. Coletar sangue dos olhos dos receptores.
      2. Anestesiar os camundongos CD45.1/Ly5.1 B6 por inalação isoflurana de 3%. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta a um pinça do dedo do dedo.
      3. Coloque um tubo de pipeta de vidro estéril no canto medial do olho direcionado caudally a um ângulo de 30-45° do plano do nariz. Aplique pressão enquanto gira suavemente o tubo.
      4. Jogue o sangue em tubos de microcentrífuge estéreis de 1,5 mL contendo heparina. Transfira 50 μL de sangue para tubos de fluxo de vidro de 5 mL.
      5. Adicione 2 mL de buffer de lysing ACK. Incubar a 37 °C em banho-maria por 45 min. Adicione 2 mL de tampão de coloração FACS. Centrífuga a 800 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
      6. Resuspender as pelotas celulares com 200 μL de tampão FACS contendo anticorpos de coloração de fluxo apropriados (amarelo vivo/morte, α-H-2K^b,α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c e α-MHCII). Incubar por 15 min a 4 °C no escuro. Lave 2x com tampão FACS de 1 mL. Resuspender as pelotas celulares em 200 μL de tampão FACS e realizar a análise por citometria de fluxo.

3. Modelos GVHD/GVL de BMT

1. Realize a indução GVHD/GVL.
   1. Cultura a luciferase transduziu linfoma de células A20 B em meios de cultura RPMI.
   2. Irradiar fundo BALB/c WT ou receptor Ly5.1 a 700 cGy (dose única). Veja detalhes na etapa 1.1.
   3. Isolar TCD-BM dos fêmures e tíbias de B6. Ly5.1 ratos doadores. Veja detalhes nas etapas 1.2.1-1.2.10.
   4. Purificar células T de baços e linfonodos dos camundongos doadores C57BL/6. Veja detalhes nas etapas 1.3.1-1.3.15.
   5. Lave o linfoma A20 2x com 25 mL de PBS. Resuspenda as pelotas celulares em 10 mL de PBS gelado. Pegue uma alíquota de suspensão celular (10 μL) e conte as células usando 1% de trippan azul e um hemocytometer. Ajuste a concentração celular para 20.000 células/mL.
   6. Injetar TCD-BM (5 x 10⁶/mouse) com ou sem células T (0,75 x 10⁶/mouse) e linfoma A20 (5.000 células/mouse).
   7. Acompanhamento sobre a sobrevivência do receptor, sinais clínicos GVHD e perda de peso corporal durante o curso experimental. Veja detalhes na etapa 1.5.
2. Faça imagens bioluminescentes.
   1. Monitore o crescimento do tumor no receptor transplantado injetando os camundongos receptores com 4 mg de D-luciferina. Incubar por 5 min para garantir que a luciferina reaja com luciferase.
   2. Anestesiar o mouse usando 3% de isoflurano na câmara de um imager de bioluminescência e imagem dos receptores por 5 min no campo D e o tempo de exposição de 1 min.
   3. Analisar dados usando software de análise de imagens. Altere a escala das imagens pseudo coloridas para obter melhores resultados.
      NOTA: Todas as imagens devem estar na mesma escala entre os experimentos.
   4. Use o software de análise de imagem para determinar as regiões de interesse e quantificar a densidade do sinal calculando o fluxo (fótons/s) emitido de cada região de interesse.

O principal modelo B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd)correspondeu de perto ao desenvolvimento do GVHD após o transplante(Figura 2). Todos os seis sinais clínicos gvhd estabelecidos anteriormente por Cooke et al.16 ocorreram nos receptores transplantados com células T WT-B6, mas não nos receptores transplantados apenas com BM (etapa 1,5), que representavam o grupo GVHD-negativo. Existem duas fases no desenvolvimento do GVHD neste modelo. Primeiro, o pico de gravidade é de aproximadamente 11 dias após o transplante, seguido de redução nos escores clínicos e recuperação do peso corporal até 16 dias. Nesta fase, diversos mecanismos como a inflamação induzida por irradiação e síndrome do enxerto impulsionam a patogenicidade da doença e o GVHD. Os receptores sucumbem uniformemente ao GVHD cerca de 30 a 40 dias após o transplante.

Pelo menos 85% da BM diferenciada em DCs (Figura 3A). Curiosamente, o transplante com fB-/- DCs melhorou a sobrevida do receptor e o escore clínico gvhd(Figura 3B,C). Dado que fB-/- Os DCs têm menos capacidade de apresentação de antígeno demonstrada pela menor expressão do MHCII e redução da expressão do receptor de co-estimulação17, o protocolo de co-transplante pode ser suficiente para examinar várias sinalizações ou metas em DCs receptores no desenvolvimento de GVHD após a TMO.

A pureza das células T foi de 90% após o enriquecimento(Figura 4A). Linfoma de células A20 B transduzido pela luciferase permite monitorar o crescimento do tumor em animais vivos (Figura 4B). Neste modelo, se os receptores morreram sem qualquer sinal e um alto escore clínico gvhd, concluiu-se que eles morreram de GVHD. Todos os receptores WT BALB/c que receberam BM sozinhos mais A20 morreram de recaída tumoral (Figura 3B). Em contraste, se o animal morreu de maior densidade de sinal, concluiu-se que eles morreram de recaída tumoral. Conforme demonstrado na Figura 3B, WT BALB/c os receptores transplantados com células BM e T de doadores ACC1fl/fl B6 (ACC1+/+ T-cells) morreram de GVHD. Se os animais morreram com sinais de doença, concluiu-se que eles morreram de GVHD e recaída tumoral. Os animais que receberam células BM e T do doador ACC1fl/fl x CD4 cre B6 (ACC1-/- Células T) morreram tanto de GVHD quanto de recaída tumoral(Figura 3B). Os animais podem ser colocados de volta na gaiola para serem recapturados em um ponto de tempo posterior ou eutanizados para imagens ex-vivo. Usando o software, a massa tumoral no animal também pode ser analisada individualmente (Figura 3B).

Figura 1: Representação esquemmática do procedimento tmo. (A) Esquema para o modelo BMT B6→BALB/c incompatível com o MHC. (B) Esquema para co-transplantação do modelo FVB→B6. (C) Esquema para o modelo B6→BALB/c GVHD/GVL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Modelo B6→BALB/c GVHD de MHC maior. Os camundongos BALB/C foram letalmente irradiados e transplantados com 5 x 106 BM sozinhos ou com 0,75 x 106 células T. ( A) Dados de sobrevida,(B) perda de peso corporal e(C) dados de escore clínico dos receptores de BM sozinhos ou com células T. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Modelo de HCT co-transplantado DC. A BM foi isolada dos camundongos WT e fB-/- B6 e diferenciada em DCs por culminação com GM-CSF. ( A) A pureza dos DCs foi examinada por citometria de fluxo por coloração com CD11c e MHCII. Os receptores B6 letalmente irradiados foram transplantados com BM (3 x 106/mouse) mais células T purificadas (1 x 106/mouse) dos doadores fvb. Os receptores também receberam 2 x 106 WT ou fB-/- Células BM-DCs B6 no dia do transplante. A sobrevida(B)e o escore clínico(C)são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Modelo B6→BALB/c GVHD/GVL. Os receptores WT BALB/c foram transplantados apenas com TCD-BM (5 x 106/mouse) ou com células T ACC1+/+ ou ACC1+/+ Células T (1 x 106/mouse) isoladas de ratos doadores de fundo B6. Além disso, os receptores receberam 2 x 103 A20-luc no momento do transplante. A pureza das células T foi examinada pela citometria de fluxo através da coloração com anticorpos de fluxo live/death, CD3, CD4 e CD8(A). Os receptores foram monitorados para o crescimento do tumor determinado por imagens de bioluminescência de todo o corpo (BLI)(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm conflitos de interesse.