A imunoglobulina G (IgG) N-glicano é caracterizada por meio de cromatografia de interação hidrofílica UPLC. Além disso, a estrutura do IgG N-glican é claramente separada. Apresentado aqui é uma introdução a este método experimental para que ele possa ser amplamente utilizado em ambientes de pesquisa.
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Artigo de método
Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Glycomics é uma nova subespecialidade em pesquisa do sistema de omics que oferece um potencial significativo na descoberta de biomarcadores de última geração para a suscetibilidade à doença, descoberta de alvos de medicamentos e medicina de precisão. Os glicanos alternativos de IgG Nforam relatados em diversas doenças crônicas comuns e sugeridos ter o grande potencial em aplicações clínicas (isto é, biomarcadores para o diagnóstico e a predição das doenças). Os igg n-glicanos são amplamente caracterizados usando o método de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho (UPLC). A UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e alta precisão quantitativa relativa. Além disso, a estrutura do IgG N-glicano é claramente separada, e a composição glicana e a abundância relativa no plasma são caracterizadas.
Introdução
N-glicosilação de proteínas humanas é uma modificação pós-translacional comum e essencial1 e pode ajudar a prever a ocorrência e o desenvolvimento de doenças com relativa precisão. Devido à complexidade de sua estrutura, espera-se que existam mais de 5.000 estruturas glicanas, proporcionando grande potencial como biomarcadores diagnósticos e preditivos para doenças2. N-glicanos ligados à imunoglobulina G (IgG) têm se mostrado essenciais para a função da IgG, e a IgG N-glicosilação participa do equilíbrio entre os sistemas pró e antiinflamatórios3. A glicosilação diferencial igg nestá envolvida no desenvolvimento e progressão da doença, representando tanto uma predisposição quanto um mecanismo funcional envolvido na patologia da doença. O papel inflamatório do IgG N-glicosilação tem sido associado ao envelhecimento, doenças inflamatórias, doenças autoimunes e câncer4.
Com o desenvolvimento da tecnologia de detecção, os seguintes métodos são mais amplamente utilizados em glifosas de alta produtividade: cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) cromatografia líquida de ultradesempenho com detecção de fluorescência (UPLC-FLR), eletroforese de gel capilar multiplex com fluores induzidos por laser detecção de cência (xCGE-LIF), desintoxicação/ionização assistida por matriz tipode espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS) e espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-ESI-MS) . Estes métodos superaram deficiências anteriores de baixo fluxo, resultados instáveis e baixa especificidade de sensibilidade5,6.
UPLC é amplamente utilizado para explorar a associação entre IgG N-glicosilação e certas doenças (ou seja, envelhecimento7, obesidade8, disslipidemia9, diabetes tipo II10, hipertensão11, acidente vascular cerebral isquêmico12, e doença de Parkinson13). Em comparação com os outros três métodos acima mencionados, uplc tem as seguintes vantagens5,14. Primeiro, ele fornece um método de análise quantitativa relativa, e a análise de dados que envolve a normalização total da área melhora a comparabilidade de cada amostra. Em segundo lugar, o custo do equipamento e a experiência necessária são relativamente baixos, o que facilita a implementação e transformação de biomarcadores de glicosilação em aplicações clínicas. Apresentado aqui é uma introdução ao UPLC para que ele possa ser mais amplamente utilizado.
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Protocolo
Todos os assuntos incluídos no protocolo foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Médica capital, Pequim, China12. O consentimento informado escrito foi obtido de cada sujeito no início do estudo.
1. Isolamento igg
- Prepare os produtos químicos, incluindo tampão de ligação (soisma tampão de fosfato, PBS): 1x PBS (pH = 7,4), neutralizando buffer: 10x PBS (pH = 6,6-6,8), eluente: 0,1 M ácido fórmico (pH = 2,5), neutralizando a solução para eluente: 1 M amônio bicarbonato, tampão armazenado: 20% etanol + 20 mM Tris + 0,1 M NaCl (pH = 7,4), solução de limpeza para proteína G: 0,1 M NaOH + 30% propan-2-ol.
NOTA: O nível de pH é fundamental neste protocolo. A lusão do IgG requer um pH muito baixo, e há um risco de perda de ácidos siálicos devido à hidlíse ácida. Portanto, a elução ocorre em segundos, e o pH é rapidamente restaurado à neutralidade, preservando a integridade do IgG e dos ácidos síalicos. - Prepare as amostras: descongele a amostra de plasma congelado e, em seguida, centrífuga a 80 x g por 10 min, e deixe a proteína G placa monolítica e os produtos químicos acima mencionados para 30 min à temperatura ambiente (RT).
- Transfira uma amostra de 100 μL (que pode ser usada para detectar 2x para evitar a primeira falha) em uma placa de coleta de 2 mL (aqui, um total de seis amostras padrão, uma amostra de controle [água ultra-pura], e 89 amostras de plasma foram projetadas para 96 placas de poço e aleatoriamente atribuídas para a placa).
- Diluir as amostras com 1x PBS por 1:7 (v/v).
- Limpe uma placa de filtro hidrofílico de polipropileno (GHP) de 0,45 μm com 200 μL de água ultra-pura (repita 2x).
- Transfira as amostras diluídas para a placa de filtro e filtre as amostras na placa de coleta usando uma bomba de vácuo (pressão de vácuo de controle em 266,6-399,9 Pa).
- Preparação das placas monolíticas g proteicas
- Descarte o tampão de armazenamento.
- Limpe as placas monolíticas com 2 mL de água ultra-pura, 2 mL de 1x PBS, 1 mL de 0,1 m de ácido fórmico, 2 mL de 10x PBS, 2 mL de 1x PBS (sequencialmente), e remover o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.
- Transfira as amostras filtradas para a placa monolítica G de proteína para a ligação e limpeza igg, em seguida, limpe as placas monolíticas com 2 mL de 1x PBS (repita a limpeza 2x).
- Elute IgG com 1 mL de 0,1 m de ácido fórmico e filtrar as amostras na placa de coleta por bomba de vácuo, em seguida, adicione 170 μL de 1 M bicarbonato de amônio na placa de coleta.
- Detectar a concentração de IgG usando um espectrômetro de absorção (comprimento de onda ideal = 280 nm).
- Abra o software e selecione o modo proteína-CY3.
- Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em branco no software para limpar a tela (repita 1x).
- Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em Sample no software para detectar a água ultra-pura.
- Desenhe 2 μL de amostra IgG e carregue-a na tela e clique na Amostra no software para detectar a amostra.
- Desenhe 2 μL de água ultra-pura e carregue-a na tela, em seguida, clique em branco no software para limpar a tela.
- Feche o software.
NOTA: A fórmula para calcular a concentração de IgG é a seguinte:
CIgG = absorvente x coeficiente de extinção (13,7) x 1.000 μg/mL
- Coloque o IgG extraído para secar em forno a 60 °C e preserve o IgG extraído (300 μL extraído IgG por 4 h).
- Remover 300 μL de IgG extraído se a concentração for superior a 1.000 μg/mL.
- Remover 350 μL de IgG extraído se a concentração estiver entre 500-1.000 μg/mL.
- Remover 400 μL de IgG extraído se a concentração estiver entre 200-500 μg/mL.
- Remover 600 μL de IgG extraído se a concentração for menor que 200 μg/mL.
NOTA: A concentração de IgG deve ser de preferência >200 μg/mL para detecção subsequente. A quantidade média de IgG deve ser de preferência >1,200 μg, que pode ser testado 2x no caso de o primeiro teste falhar.
- Limpeza da proteína G placa monolítica para reutilização
- Lave a placa com 2 mL de água ultra-pura, 1 mL de 0,1 M NaOH (para remover proteínas precipitadas), 4 mL de água ultra-pura e 4 mL de 1x PBS (sequencialmente), em seguida, retire o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.
- Lave a placa com 2 mL de água ultra-pura, 2 mL de 30% propan-2-ol (para remover proteínas hidrofóbicas encadernadas), 2 mL de água ultra-pura e 4 mL de 1x PBS (sequencialmente), em seguida, retire o líquido fluindo usando uma bomba de vácuo.
- Lave a placa com 1 mL de buffer (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) e adicione 1 mL de buffer (20% etanol + 20 Mm Tris + 0,1 M NaCl) para a placa, em seguida, deixe a placa em 4 °C.
2. Liberação de glicano
- Prepare o IgG seco e armazenar os produtos químicos, incluindo 1,33% SDS, 4% Igepal (loja longe da luz), e 5x PBS na RT.
- Prepare a enzima PNGase F diluindo a enzima 250 U com 250 μL de água ultra-pura.
- Desnaturação do IgG
- Adicione 30 μL de 1,33% SDS e misture vórtice, transfira a amostra para um forno de 65 °C por 10 min, em seguida, retire-o do forno e deixe descansar por 15 min.
- Adicione 10 μL de 4% igepal e coloque-o na incubadora tremer por 5 min.
- Remoção e liberação de glicanos
- Adicione 20 μL de 5x PBS e 30-35 μL de 0,1 mol/L NaOH para regular um pH de 8,0, e misture vórtice. Adicione 4 μL de enzima PNGase F e misture vórtice. Em seguida, incubar por 18-20 h em um banho de água 37 °C.
- Coloque os glicanos liberados para secar em um forno a 60 °C para 2,5-3,0 h.
- Salve os glicanos liberados a -80 °C até mais medições.
NOTA: Este passo é fundamental. A chave para a liberação de glicano é melhorar a atividade da enzima PNGase F para maximizar sua eficiência.
3. Rotulagem e purificação de glicanos
- Prepare o reagente de rotulagem 2-aminobenzamida (2-AB) com 0,70 mg de 2-AB, 10,50 μL de ácido acético, 6 mg de cianoboroborodiride de sódio (NaBH3CN) e 24,50 μL de dimetil sulfoxida (DMSO) (volume total = 35 μL). Em seguida, adicione o ácido acético, 2-AB, e NaBH3CN no DMSO em ordem.
- Rotular os glicanos usando 35 μL de reagente de rotulagem 2-AB, transfira os glicanos rotulados para o oscilador por 5 min, transfira para o forno por 3 h a 65 °C e, em seguida, transfira para a RT por 30 min.
NOTA: Toda a etapa de rotulagem de glicanos deve ser realizada enquanto protegida da luz. - Pré-trate uma placa de filtro GHP de 0,2 μm com 200 μL de 70% de etanol, 200 μL de água ultra-pura e 200 μL de 96% acetônio (4 °C), depois remova resíduos usando uma bomba de vácuo.
- Purificação de glicano rotulado de 2 AB
- Adicione 700 μL de 100% acetônio ao glicano rotulado de 2 AB e transfira para uma incubadora tremer por 5 min.
- Centrífuga a 134 x g por 5 min (4 °C).
- Transfira a amostra para uma placa de filtro GHP de 0,2 μm por 2 min e remova a filtragem (líquido corrente) usando uma bomba de vácuo.
- Lave glican rotulado 2-AB com 200 μL de 96% acetonitrile (4 °C) e retire o filtrado (líquido fluindo) usando uma bomba de vácuo 5x-6x.
- Glican rotulado como Elute 2-AB com 100 μL de água ultra-pura 3x.
- Transfira o glicano rotulado de 2 AB para um forno para secar a 60 °C por 3,5 h.
- Salve os n-glicanos rotulados em -80 °C até mais medição.
4. Cromatografia de interação hidrofílica e análise de glicanos
- Condicionamento de instrumentos UPLC e preparação de fases móveis
- Prepare fases móveis, incluindo solvente A: formato de amônio de 100 mM (pH = 4,4), solvente B: 100% acetônio, solvente C: 90% de água ultra-pura (10% metanol) e solvente D: 50% metanol (água ultra-pura).
- Abra o software para controlar as fases móveis.
- Lave instrumentos UPLC a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min (50% solvente B e 50% solvente C) equilibrando-se por 30 min, depois a uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min (25% solvente A e 75% solvente B) equilibrando-se por 20 min, em seguida, uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min equilíbrio.
- Dissolva os n-glicanos rotulados com 25 μL de uma mistura de 100% acetônio e água ultra-pura em uma proporção de 2:1 (v/v). Em seguida, centrífuga a 134 × g por 5 min (4 °C) e carregar 10 μL do N-glicans rotulados nos instrumentos UPLC.
- Separe os n-glicanos rotulados a uma taxa de fluxo de 0,4 mL/min com um gradiente linear de 75% a 62% acetônio por 25 min. Em seguida, realize uma coluna analítica de escada/glicopeptide em um UPLC a 60 °C (aqui, as amostras foram mantidas a 4 °C antes da injeção).
- Detecte n- fluorescência glicana na excitação e emissões comprimentos de onda de 330 nm e 420 nm, respectivamente.
- Integrar os glicanos com base no pico de posição e tempo de retenção.
- Calcule o valor relativo de cada Pico glicano (GP) / todos os picos de glicanos (GPs) (porcentagem, %) da seguinte forma: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, etc.
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Resultados
Como mostrado na Figura 1,IgG N-glicanos foram analisados em 24 picos iniciais de glicoglicemia IgG (GPs) com base no pico de posição e tempo de retenção. As estruturas N-glicanestão disponíveis através da detecção de espectrometria de massa de acordo com um estudo anterior ( Tabela1)15. Para garantir que os resultados fossem comparáveis, foi aplicada normalização total da área, na qual a quantidade d...
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Discussão
UPLC serve como um método de análise quantitativa relativa5,15. Os resultados indicam que o UPLC é uma tecnologia de detecção estável, com boa reprodutibilidade e precisão quantitativa relativa. A quantidade de glicanos em cada pico é expressa como uma porcentagem da área integrada total usando UPLC, que é o valor relativo. A quantificação relativa melhora a comparabilidade das amostras de teste. Além disso, 96 placas G de proteína bem são usadas para purificar o...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por doações da National Natural Science Foundation of China (81673247 & 81872682) e da Australian-China Collaborative Grant (NH & MRC - APP1112767 -NSFC 81561128020).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 2-aminobenzamida, 2-AB | Sigma, China | ||
| Placa de coleta de 96 poços | AXYGEN | ||
| Placa filtrante de 96 poços | Pol | 0,45 um GHP | |
| Placa monolítica de 96 poços | BIA Separações | ||
| Eppendorf Co., Ltd, Alemanha | T_1087461900 | ||
| Ácido acético | Sigma, China | ||
| Acetonitrila | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Bicarbonato de amônio | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Formato de amônio | Beijing Minruida Technology Co., Ltd. | ||
| Incubadora de agitação constante / balancim | Zhicheng instrumento analítico manufacturing co., Ltd, China | ZWY-10313 | |
| Escada de calibração de dextrano / coluna de glicopeptídeo | Watts technology Co., Ltd, China | Coluna | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma, China | ||
| Fosfato dissódico | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Fornos elétricos | Tester instruments Co., Ltd | 202-2AB | |
| Empower 3.0 | Waters technology Co., Ltd, America | ||
| Ethanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Ácido fórmico | Sigma, China | ||
| GlycoProfile 2-AB Kit de rotulagem | Sigma, China | ||
| HCl | Junrui Biotechnology Co., Ltd, China | ||
| Centrífuga de alta velocidade | Eppendorf Co., Ltd, Alemanha | 5430 | |
| Igepal | Sigma, China | ||
| Centrífuga de baixa temperatura | Eppendorf Co., Ltd, Alemanha | ||
| Refrigerador de baixa temperatura | Qingdao Haier Co., Ltd | ||
| Manifold 96 poços | placa Watts tecnologia Co., Ltd, China | 186001831 | |
| Metanol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| Medidor de água pura | Millipore Co., Ltd, América | Vantagem A10 | |
| NaOH | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Testador de PH | Sartorius Co., Ltd, Alemanha | PB-10 | |
| Solução salina tamponada com fosfato, PBS | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Pipeta | Eppendorf Co., Ltd, Alemanha | 4672100, 0.5-10μ l & 10-100μ l & 20-200μ l & 1000μ l | |
| PNGase F enzima | Sigma, China | ||
| Di-hidrogenofosfato de potássio | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Propan-2-ol | Huihai Keyi Technology Co., Ltd, China | ||
| SDS | Sigma, China | ||
| Cloreto de sódio | Shenggong Biological Engineering Co., Ltd, China | ||
| Cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN) | Sigma, China | ||
| Espectrofotômetro | Shanghai Yuanxi instrument Co., Ltd | B-500 | |
| Pistola de transferência de líquido | Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, China | 4672100 | |
| Tris | Amresco, América | ||
| Refrigerador de temperatura ultrabaixa | Thermo Co., Ltd, América | MLT-1386-3-V; MDF-382E | |
| Cromatografia líquida de ultra-desempenho | Watts technology Co., Ltd, China | Acquity MLtraPerformance LC | |
| Bomba de | vácuo Watts technology Co., Ltd, China | 725000604 | |
| Máquina de volatilização / secador | Eppendorf Co., Ltd, Alemanha | T_1087461900 | |
| Vortex | Changzhou Enpei instrument Co., Ltd, China | NP-30S | |
| Instrumentos Co. do verificador | do banho-maria | DK-98-IIA | |
| Balança de pesagem | Shanghai Jingke Scientific Instrument Co., Ltd. | MP200B |
Referências
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Reimpressões e permissões
