Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

Resumo

Aqui, descrevemos um método de micro-aspiração de célula única para a separação de amebae infectada. A fim separar subpopulações virais no vermiformis de Vermamoeba contaminado por Faustoviruses e por vírus gigantes desconhecidos, nós desenvolvemos o protocolo detalhado abaixo e demonstramos sua habilidade de separar dois vírus gigantes novos low-abundance.

Resumo

Durante o processo de cocultura de ameba, mais de um vírus pode ser isolado em um único poço. Previamente resolvemos esse problema por diluição final e/ou fluorescência ativada de classificação celular (FACS) aplicada à população viral. No entanto, quando os vírus na mistura têm propriedades morfológicas semelhantes e um dos vírus se multiplica lentamente, a presença de dois vírus é descoberta na fase de montagem do genoma e os vírus não podem ser separados para maior caracterização. Para resolver este problema, desenvolvemos um procedimento de micro-aspiração de célula única que permite a separação e clonagem de vírus altamente semelhantes. No presente trabalho, apresentamos como essa estratégia alternativa nos permitiu separar as pequenas subpopulações virais de Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, vírus gigantes que crescem lentamente e não levam à lúse amebal em comparação com o lytic e o rápido crescimento Faustovírus. O controle da pureza foi avaliado pela amplificação específica do gene e os vírus foram produzidos para uma caracterização mais adicional.

Introdução

Os vírus nucleocitoplasmic do ADN grande (NCLDV) são extremamente diversos, definidos por quatro famílias que infectam eucariontes^1. Os primeiros vírus descritos com genomas acima de 300 kbp foram Phydcodnaviridae,incluindo paramecium bursaria chlorella vírus 1 PBCV1². O isolamento e a primeira descrição do Mimivirus mostraram que o tamanho dos vírus dobrou em termos do tamanho da partícula (450 nm) quanto do comprimento do genoma (1,2 Mb)³. Desde então, muitos vírus gigantes foram descritos, geralmente isolados usando um procedimento de cocultura de ameba. Vários vírus gigantes com diferentes morfologias e conteúdos genéticos podem ser isolados das células acanthamoeba sp., incluindo Marseilleviruses, Pandoraviruses, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus e recentemente Medusavirus^{4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17.} Paralelamente, o isolamento de Vermamoeba vermiformis permitiu o isolamento e descrição dos vírus gigantes Faustovirus, Kaumoebavirus e Orpheovirus^18,19,20. Outros vírus gigantes foram isolados com seus protistas hospedeiros, como cafeteria roenbergensis^21, Aureococcus anophagefferens²², Chrysochromulina ericina^23,e bodo saltans ^24. Todos esses isolamentos foram o resultado de um número crescente de equipes trabalhando no isolamento e na introdução de atualizações de estratégia de alta de supressão^25,26,27,28,como a melhoria do sistema de co-cultura com o uso de citometria de fluxo.

Em 2016, usamos uma estratégia associando cocultura e citometria de fluxo para isolar vírus gigantes^27. Esta estratégia foi desenvolvida para aumentar o número de amostras inoculadas, para diversificar os protistas usados como suportes celulares e detectar rapidamente a lise do suporte celular. O sistema foi atualizado adicionando um passo suplementar para evitar a identificação preliminar da biologia molecular e detecção rápida de uma população viral desconhecida como no caso do Pacmanvirus²⁹. Acoplamento citometria fluxo para classificação celular permitido para a separação de uma mistura de Mimivirus e Cedratvirus A11³⁰. No entanto, mais tarde encontramos as limitações da separação e detecção dessas subpopulações virais por citometria de fluxo. Após o sequenciamento, quando montamos os genomas do Faustovirus ST1²⁵ e Faustovirus LCD7 (dados inéditos), surpreendentemente encontramos em cada montagem dois genomas suplementares de dois novos vírus não identificados em bancos de dados do genoma público. No entanto, nem a citometria de fluxo nem a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) mostraram que as amebaes foram infectadas por dois vírus diferentes, Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7. Nós projetamos sistemas específicos de PCR para amplificar os marcadores faustovírus, usurpativírus e clandestinovírus, respectivamente, com base em seus genomas; nosso objetivo era ter sistemas baseados em PCR que permitissem a verificação da pureza dos vírus que estão sendo separados. No entanto, a diluição do ponto final e a citometria de fluxo não conseguiram separá-los. O isolamento dessa única população viral foi difícil porque nem a morfologia nem os elementos replicativos das populações de Clandestinovírus e Usurpativírus têm sido caracterizados. Detectamos apenas uma população viral por citometria de fluxo devido à sobreposição das duas populações (testadas após a separação efetiva). Tentamos separá-los usando uma única classificação de partículas em placas de 96 poços, mas não observamos quaisquer efeitos citopáticos, e não detectamos nem Clandestinovirus nem Usurpativirus por amplificação pcr. Finalmente, foi apenas a combinação de diluição do ponto final seguido por micro-aspiração única ameba que permitiu a separação desses dois vírus gigantes de baixa abundância de faustovírus. Este método de separação é o objeto deste artigo.

Protocolo

1. Cultura ameba

1. Use vermiformis de Vermamoeba (tensão CDC19) como uma sustentação da pilha.
2. Adicione 30 mL de protease-peptone-levedura extrato-glicose médio (PYG) (Tabela 1) e 3 mL da amebae em uma concentração de 1 x 10⁶ células / mL em um frasco de cultura de 75 cm² células.
3. Mantenha a cultura a 28 °C.
4. Após 48 h, quantificar a amebae usando lâminas de contagem.
5. Para enxaguar, colher as células a uma concentração de 1 x 10⁶ células/mL e pelota a amebae por centrífuga a 720 x g por 10 minutos. Retire o supernatant e resuspenda a pelota no volume apropriado de meio de fome para obter 1 x 10⁶ células/mL (Tabela 1).

2. Propagação do vírus de estoque na amebae

Nota: Antes da diluição, é importante a cultura da amostra de estoque para obter bastante cultura fresca, a seguir prossiga à filtragem.

1. Use 1 x 10⁶ da cultura da ameba no meio da inanição.
2. Inocular a mistura de vírus emitidos a partir da solução de estoque (Faustovirus / Usurpativirus LCD7 ou Faustovirus / Clandestinovirus ST1) após o processo de co-cultura sobre o suporte celular em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01.
   Nota: O MOI é importante para reduzir a abundância da população viral principal e o número de pilhas contaminadas.
3. Incubada a 30 °C até que os efeitos citopáticos (CPE) sejam induzidos, como arredondamento de amebal ou lyse, aproximadamente 10 a 14 h após a infecção.
4. Colete a mídia e filtrar através de um filtro de 5 μm para remover detritos celulares.

3. Diluição do ponto final

1. Realizar uma diluição em série (10^-1 a 10^-11)da amostra viral em meio de fome (Tabela 1).
2. Inoculate 2 mL de 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis contidos em cada placa de Petri com 100 μL do inoculum da mistura.
3. Coloque as placas de Petri em um saco plástico selado a 30 °C.
4. Comece a observar as placas de Petri com microscopia óptica invertida em 6 h pós-infecção e verifique a morfologia celular a cada 4 a 8 h.
5. No aparecimento do efeito citopático caracterizado por células de arredondamento, iniciar o processo de micro-aspiração de célula única.

4. Micro-aspiração unicelular

1. Prepare o anfitrião.
   NOTA: Esta preparação é feita para a liberação de células únicas infectadas para um suporte de células frescas.
   1. Trate a amebae na cultura com um agente antimicrobiano contendo 10 μg/mL de vancomycin, 10 μg/mL de imipenem, 20 μg/mL de ciprofloxacina, 20 μg/mL de doxiciclina e 20 μg/mL de voriconazole. Esta mistura é usada para evitar a contaminação bacteriana e fúngica.
      Nota: O procedimento ocorre em um banco fora da estação de segurança microbiológica. Adicione 2 mL de amebae concentrada em 1 x 10⁶ células/mL cada uma em 15 placas de Petri. Para a adesão à ameba, incubar a cultura a 30 °C por 30 min.
2. Selecione a placa de Petri usada para a micro-aspiração a partir da diluição limite de acordo com os seguintes critérios: 1) ausência de qualquer contaminação visível por agentes fúngicos e bacterianos, 2) evidência de efeito citopático de amebae devido aos vírus, e 3) prelíse e fase de arredondamento da amebae (para evitar a aspiração de partículas virais).
3. Configure uma estação de trabalho com os seguintes materiais (ver Figura 1A,B):
   Micromanipulador, que permite o posicionamento microcapilar;
   Dispositivo manual da pressão do controle, usado para aspirar e liberar as pilhas no microcapillary;
   Microscópio invertido;
   Conecte e jogue módulos motores;
   Câmera;
   Módulo de computador para visualizar a manipulação e tirar fotos.
4. Escolha um microcapilar (ver Figura 1C).
   Nota: O tamanho das células, a deformação e a adesão de suas membranas às superfícies, e a motilidade celular podem afetar o progresso suave da micro-aspiração. O diâmetro microcapilar pode ser escolhido e adaptado com precisão a tipos específicos de células, dependendo de seus tamanhos e métodos de aspiração. Um microcapilar de 20 μm de diâmetro interno foi usado para aspirar uma ameba de arredondamento (diâmetro ~10 μm). Isso permite a manutenção de uma posição interna e uma liberação fácil da célula.
5. Monte o sistema.
   1. Corrija o ângulo operacional do sistema de aperto no módulo motorizado a 45°.
   2. Realize uma instalação dupla, primeiro no sistema emocionante, e depois no microcapilar.
   3. Concentre-se nas células depois de executar algumas gotas de óleo através do microcapilar.
      Nota: O óleo mineral com compatibilidade biológica é fornecido pelo dispositivo.
   4. Complete a montagem seguindo as recomendações do fabricante.
6. Células clonadas (ver Figura 2A,B).
   NOTA: Este procedimento é semelhante ao descrito por Fröhlich e König³¹.
   1. Coloque a placa de Petri contendo 2 mL de amebae infectada o microscópio.
   2. Concentre-se primeiro nas células e, em seguida, no microcapilar imerso na cultura.
   3. Escolha uma única célula arredondada e aproxime o microcapilar do micromanipulador.
   4. Exerça a aspiração suave com controle manual de pressão sobre a célula, levando-o para dentro do microcapilar. Retire a única célula da primeira amostra e libere no suporte celular e, em seguida, incuba-a a 30 °C.
   5. Realizar observações diárias com um microscópio óptico invertido para observar o aparecimento das células e monitorar o surgimento do efeito citopático.

5. Triagem PCR

Nota: Após a etapa 4, uma triagem sistemática por PCR é crucial para confirmar a separação. Tanto no Usurpativirus/Faustovirus quanto no Clandestinovirus/Faustovirus, o projeto e a aplicação dos sistemas específicos de primer e sonda foram feitos usando primer-BLAST online³² (Tabela 2).

1. Extrato DNA de uma parte das amostras de cultura positiva (ou seja, onde um efeito citopático é observado), usando um sistema de extração automatizado de acordo com o protocolo do fabricante.
2. Use primers apropriadamente projetados.
   Nota: Aqui nós projetamos primers para amplificar genes do núcleo anotados como RpB2 (Faustovirus), proteína capsid principal lcd7 (usurpatvirus) e proteína capsid menor (Clandestinovirus)
3. Executar PCR padrão usando um termociclor.
   1. Realize 20 reações μL PCR com 50 μM de cada primer (Tabela 2),1x Master Mix e RNase água livre.
   2. Ative o DNA Taq polymerase por 5 min a 95 °C, em seguida, siga com 45 ciclos de desnaturação de 10 s a 95 °C, annealing das primers para 30 s em 58 °C, e extensão para 30 s em 72 °C.
4. Executar os produtos PCR em um gel agarose 1,5%, mancha com mancha de gel de DNA(Tabela de Materiais),e visualizar com UV.

6. Produção e purificação de vírus

1. Coloque o resto da cultura da placa de Petri de volta em um pequeno frasco.
2. Para a produção do vírus, prepare 15 frascos de 145 cm^2,contendo 40 mL de vermiformese Vermamoeba em meio de fome e 5 mL do vírus isolado já transferido da placa de Petri para pequenos frascos.
3. Trate com a mesma mistura antibiótica e antifúngica usada na etapa 4.1.
4. Incubar a 30 °C. Observe todos os dias com microscopia óptica invertida.
5. Após a infecção completa, piscina todos os frascos. Use um filtro de 0,45 μm para eliminar detritos.
6. Ultracentrifuge todas as supernatantes a 50.000 x g por 45 min.
7. Após a centrífugação, retire o supernatant de cada tubo por aspiração e resuspenda a pelota em 1 mL de soro fisiológico amortecida de fosfato (PBS).
8. Purificar o vírus produzido com 25% de sacarose (27,5 g de sacarose em 100 mL de PBS, esterilizado por filtragem).
9. Centrífuga 8 mL de sacarose e 2 mL da suspensão viral em 80.000 x g por 30 min. Resuspende a pelota viral em 1 mL de PBS. Guarde-o a -80 °C.

7. Microscopia eletrônica negativa da coloração e da transmissão

Nota: Bou Khalil et al. publicaram anteriormente este protocolo²⁷.

1. Deposite 5 μL da lysis supernatant na grade glow-discharged. Deixe por aproximadamente 20 min à temperatura ambiente.
   Nota: A descarga de brilho nos permite obter uma grade hidrofílica por aplicação de plasma.
2. Seque a grade com cuidado e deposite uma pequena queda de 1% de molybdate de amônio por 10 s. Deixe a grade para secar por 5 min.
3. Siga para observações de microscopia eletrônica a 200 keV.

8. Caracterização do Clandestinovirus ST1 e usurpativirus LCD7

1. Caracterizar populações puras de Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7 usando sequenciamento do genoma, montagem do genoma, análises de bioinformática e estudo de seu ciclo replicativo como fizemos para outros vírus^{10,20, 29.}

Resultados

A micro-aspiração de célulaúnica é um processo de micromanipulação otimizado neste manuscrito (Figura 1). Esta técnica permite a captura de uma ameba arredondada e infectada (Figura 2A)e seu lançamento em uma placa nova contendo amebae não infectada (Figura 2). É um protótipo funcional que se aplica ao sistema de co-cultura e isolou com sucesso vírus gigantes não líticos. Esta abordagem foi usada pela primeira vez n...

Discussão

A duração do manuseio de micro-aspiração de célula única e seu bom funcionamento é dependente do operador. As diferentes etapas do experimento requerem precisão. O uso dos componentes de micromanipulação da estação de trabalho deve estar controle constante observando o processo de micro-aspiração e a liberação da célula. O acompanhamento por observação microscópica é necessário para captura e transferência de uma célula. Um operador experiente pode levar de 1 a 2 h para isolar 10 células e retransferi-las uma a uma, depe...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose Standard	Euromedex	Unkown	Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix	Applied Biosystems	4398876	Standard PCR
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Controle as células durante o processo de microaspiração
Frascos de cultura de células Corning 150 cm2	Sigma-aldrich	CLS430825	Cultura
Frascos de cultura de células Corning 25 cm2	Sigma-aldrich	CLS430639	Cultura
Frascos de cultura de células Corning 75 cm2	Sigma-aldrich	CLS430641	Cultura
DFC 425C câmera	LEICA	Unkown	Observação/Monitoramento
Eclipse TE2000-S Microscópio Invertido	Nikon	Unkown	Observação/Monitoramento
EZ1 avançado XL	Quiagen	9001874	extração de DNA
Glasstic Slide 10 com Grades de Contagem	Kova International	87144E	Contagem de células
Mastercycler nexus	Eppendorf	6331000017	PCR padrão
Microcapilar 20 µ m	Eppendorf	5175 107.004	Microaspiração e liberação de células
Micromanipulador InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Posicionamento microcapilar
Água livre de nuclease	ThermoFischer	AM9920	PCR padrão
Optima XPN Ultracentrífuga	BECKMAN COULTER	A94469	Purificação de vírus
Placa de Petri 35 mm	Ibidi	81158	Cultura/observação
Filtros de seringa estéreis 5 µ m	Filtração	SLSV025LS	Sigma-aldrich
SYBR verde Tipo I	Invitrogen	desconhecido	Sondas moleculares fluorescentes/citometria de fluxo
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	PCR padrão; Coloração de gel de DNA
Tecnai G20	FEI		Desconhecido Microscopia eletrônica
Tipo 70 Ti Rotor de titânio de ângulo fixo	BECKMAN COULTER	337922	Tubo
ultra-transparente, 25 x 89 mm2	BECKMAN COULTER	344058	Purificação de vírus