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Artigo de método

Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV

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DOI:

10.3791/60149

⸱

6 de setembro de 2019

 , 
1Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Neste artigo

Resumo

O leite materno transmite o vírus da imunodeficiência humana (HIV), embora apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV sejam infectados. Lactentes amamentados ingeriram ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora essas células sejam subestudadas. Aqui nós descrevemos a isolação de leucócito do leite de peito e uma análise de sua capacidade fagocitária.

Resumo

Mesmo na ausência de medicamentos antirretrovirais, apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV tornam-se infectados, sugerindo um forte efeito protetor do leite materno (BM). A menos que o acesso à água potável e à fórmula infantil apropriada seja confiável, a OMS não recomenda a cessação do aleitamento materno para as mães infectadas pelo HIV. Inúmeros fatores provavelmente funcionam em conjunto para reduzir a transmissão da BM. Lactentes amamentados ingerir ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora o que permanece em grande parte obscuro é a contribuição dessas células para as qualidades antivirais do BM. atualmente, objetivou-se isolar as células do BM humano para medir fagocitose celular anticorpo-dependente (ADCP), uma das respostas imunes inata as mais essenciais e as mais Pervasive, por fagócitos do BM de encontro aos alvos do HIV. As células foram isoladas de 5 amostras de BM humanas obtidas em vários estágios de lactação. A isolação foi realizada através da centrifugação delicada seguida pela remoção cuidadosa da gordura de leite e da lavagem repetida da pelota da pilha. Os grânulos fluorescentes revestidos com o epítopo do envelope do HIV (env) foram usados como alvos para a análise de ADCP. As pilhas foram manchadas com o marcador de superfície CD45 para identificar leucócito. Verificou-se que a atividade da ADCP foi significativa acima dos experimentos de controle e mensurável através de um anticorpo 830A específico para o HIV.

Introdução

O leite materno humano (BM) é constituído por células maternas que são > 90% viáveis1. A composição celular é fortemente impactada pelo estágio de lactação, estado de saúde da mãe e do lactente, e variação individual, que permanece pouco compreendida1,2,3,4. Dado que o BM contem ~ 103− 105 leucócito/ml, pode-se estimar que os infantes amamentados ingerem ~ 105− 108 leucócitos maternos diários5. Vários estudos in vivo demonstraram que os leucócitos maternos fornecem imunidade crítica ao lactente e são funcionais bem além desses sítios de ingestão inicial5,6,7,8 ,9,10,11. Todas as células derivadas da maternally ingeridas pelo lactente têm potencial para realizar funções imunes ao lado ou para compensar os leucócitos próprios do lactente12.

A transmissão materno-infantil (MTCT) do vírus da imunodeficiência humana (HIV) continua a ser uma crise em países com recursos limitados. Como as doenças diarreicas e respiratórias são responsáveis por taxas substanciais de mortalidade entre lactentes em países com recursos limitados, e essas doenças são significativamente reduzidas pelo aleitamento materno exclusivo, os benefícios para as mães infectadas pelo HIV a amamentação supera em muito os riscos13,14,15. A menos que o acesso à água potável e à fórmula infantil adequada seja confiável, a OMS não recomenda a cessação do aleitamento materno para mães infectadas pelo HIV16. Aproximadamente 100.000 MTCTs via BM ocorrem anualmente; no entanto, apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por suas mães infectadas pelo HIV tornam-se infectados, sugerindo um forte efeito protetor da BM17,18,19,20,21. Inúmeros fatores provavelmente funcionam em conjunto para evitar a transmissão. Importante, os anticorpos HIV-específicos (ABS) no BM foram correlacionados com o MTCT reduzido e/ou a morte infantil reduzida da infecção de HIV22,23. O que permanece em grande parte obscuro é a contribuição da fração celular da BM para suas qualidades antivirais.

Muitos ABS facilitam uma variedade de atividades antivirais mediadas pela região ' constante ' da molécula de imunoglobulina, o fragmento cristalizável (FC), através da interação com receptores FC (FcRs) encontrados em praticamente todas as células imunes inatas, praticamente todos os quais são encontrados em humanos BM24. O fagocitose celular anticorpo-dependente (ADCP) foi demonstrado como necessário para o afastamento de infecções virais e foi subestudado no caso da prevenção do MTCT do HIV25,26,27, 28 anos de , 29. dada a escassez de conhecimento sobre a potencial contribuição da atividade da ADCP pelos FAGOÓCITOS da BM para a prevenção da MTCT do HIV, objetivou-se desenvolver um método rigoroso para isolar as células da BM humana, a fim de realizar um estudo de ADCP mediado por células de BM Obtido em vários estágios de lactação.

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Protocolo

Cada participante deste estudo foi recrutado e entrevistado de acordo com a aprovação do Conselho de ética e de revisão institucional (IRB) com a orientação e autorização do programa de proteção de sujeitos humanos (PPHS) do Monte Sinai, utilizando um protocolo para obtenção de amostras de leite materno.

1. target microsphere preparação

  1. Selecione um antígeno de destino relevante.
    Nota: neste exemplo, a proteína recombinante V1V2-2f5k foi usada, que foi projetada imitar o vértice trimérico do envelope nativo30do HIV.
  2. Realize a biotinilação usando um kit comercial (tabela de materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
    1. Calcule o mmol do reagente da biotina para adicionar à reação para um excesso do molar de 5 dobras usando a fórmula: mmol biotina = ml proteína x (proteína do magnésio protein/mL) x (proteína da biotina/magnésio do mmol) x (proteína da biotina/mmol de 5 mmol)30,31. Em seguida, calcule μL do reagente de biotina para adicionar utilizando a fórmula: μL de biotina = mmol biotina x (1 milhão μL/L) x (L/10 mmol).
    2. Equilibram a biotina à temperatura ambiente antes da abertura. Dissolva a proteína em 0,5 − 2,0 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) de acordo com o cálculo feito acima.
    3. Prepare uma solução de 10 mM de reagente de biotina em dimetilsulfóxido (DMSO) e adicione o volume apropriado de 10 mM de reagente de biotina à solução proteica, e incubar reação no gelo por 2 h ou em temperatura ambiente por 30 min.
  3. Remover excesso de biotina usando concentradores de proteínas (polietersulfona [PES] membranas, 3 kDa peso molecular Cut-off [MWCO], 0,5 mL; Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Deposite a amostra na câmara superior da coluna de giro e adicione PBS até 400 μL. Cap, em seguida, insira esta câmara de amostra em um tubo de coleta. Centrifugador a 12.000 x g à temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Descarte o fluxo e adicione PBS a 400 μL. Repita a centrifugação. Descarte o fluxo e adicione PBS a 100 μL. Meça a concentração da proteína por um espectrofotômetro.
      Nota: a proteína pode ser aliquotada e congelada a-80 ° c até ser usada.

2. anticorpo-dependente de phagocytosis celular (ADCP) preparação placa de ensaio

  1. Conjugar proteínas biotiniladas a 1 μm de microesferas (' grânulos '; Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Por placa de grânulos conjugados, incubar 6 μg de proteína com 12 μL de grânulos de estoque em 200 μL de 0,1% de albumina sérica bovina (BSA)-PBS à temperatura ambiente por 1 h, vortexing suavemente a cada 20 min.
    2. Centrifugador a 13.000 x g durante 5 min. descarte o sobrenadante, vórtice suavemente e ressuscitará em 1200 μL de 0,1% de BSA-PBS. Repita a rotação e a etapa de lavagem 2x. Ressuscito em 1200 μL de 0,1% de BSA-PBS.
  2. Alíquota 10 μL de solução de cordão por poço em uma placa de fundo redondo 96-well. Prepare diluições de anticorpos ou soros imunes de interesse em 12 μL de HSA HBSS a 2%, tipicamente a partir de 50 μg/mL de anticorpo ou uma diluição sérica de 1/100.
    Nota: nos dados amostrais, utilizou-se o anticorpo monoclonal (mAb) 830A.
  3. Adicionar 10 μL de anticorpo titulado/soro à placa do talão e incubar durante 2 h a 37 ° c. Adicionar 200 μL de HSA HBSS de 2% a cada poço e placa de centrifugação a 2.000 x g durante 10 min.
  4. Remova com cuidado o sobrenadante por um rápido derrubamento e decantação do líquido dos poços da placa em um dissipador para evitar perturbar a pelota invisível do grânulo.

isolação da pilha do leite 3. Breast

  1. Obter leite materno humano de mulheres lactantes saudáveis, expressas usando bombas eletrônicas ou manuais duplas. Isolar células dentro de ~ 4 h de expressão, mantendo o leite à temperatura ambiente.
  2. Usando 50 mL de tubos, centrífuga 50 mL de leite em 800 x g por 15 min. cuidadosamente despeje o leite desnatado e gordura, deixando a pelota celular não perturbado. Limpe o interior do tubo com uma limpeza sem fiapos para remover toda a gordura da parede do tubo.
  3. Adicionar 10 mL de 2% de albúmen de soro humano na solução de sal equilibrado de Hank (2% HSA HBSS [sem CA2 + ou mg+]). Resuspend o pellet por pipetagem suave para evitar a ativação celular e apoptose. Transferir para um tubo de 15 mL e centrifugar a 450 x g durante 10 min.
  4. Despeje o sobrenadante e repita o passo 1,3. Em seguida, reressuscitando suavemente as células em 1 − 2 ml de 2% HSA HBSS dependendo do número de célula esperado, e contagem de células por um hemocitômetro ou um contador de células automatizado, observando também a viabilidade celular.

ensaio 4. ADCP

Nota: os métodos descritos aqui são adaptados de Ackerman et al.32.

  1. Adicionar 50.000 células BM recém-isoladas para cada placa de ensaio ADCP bem em 200 μL de 2% HSA-HBSS. Incubar por 2 h a 37 ° c.
    1. Para experimentos de controle, pré-incubar células a 37 ° c com 10 μg/mL de inibidor de actina (cytochalasin-D), 50 μg/mL de agente de bloqueio FcR (FcBlock), ou uma combinação de ambos antes de sua adição às placas.
  2. Placa centrífuga a 930 x g por 10 min. Adicione 200 μL de 2% de HSA HBSS e repita a centrifugação. Remova cuidadosamente o sobrenadante como na etapa 2,7 e repita a lavagem.
  3. Retire cuidadosamente as células sobrenadantes e de mancha para a viabilidade utilizando 0,5 μg/mL (concentração final) de viabilidade fixável mancha 450 por poço em 50 μL de 2% HSA HBSS. Incubar 20 min à temperatura ambiente no escuro. Placa do centrifugador em 930 x g por 10 minutos e remova o sobrenadante como na etapa 2,7. Adicionar 200 μL de 2% HSA HBSS e placa centrífuga novamente seguido por remoção de sobrenadante como no passo 2,7.
  4. Após a coloração da viabilidade, as pilhas da mancha para marcadores da leucócito do interesse, incluindo minimamente uma mancha CD45-specific tal como o CD45 do PE-rato anti-Human (clone HI30) em uma concentração aperfeiçoada (1 μg/μL em 50 μL de 1% BSA HBSS nos dados do exemplo).
    Nota: quaisquer marcadores específicos de linhagem de interesse podem ser incluídos.
  5. Incubar 20 min à temperatura ambiente no escuro. Placa do centrifugador em 930 x g por 10 minutos e remova o sobrenadante como na etapa 2,7. Adicionar 200 μL de 1% de BSA HBSS e repetir a centrifugação. Remover sobrenadante. Fixar células em 200 μL de 0,5% de formaldeído no escuro à temperatura ambiente durante 30 min ou durante a noite a 4 ° c. Refrigerate no escuro até a análise.

5. análise por citometria de fluxo

  1. Realize a gating inicial para eliminar doublets em um gráfico de dispersão (FSC) versus dispersão lateral (SSC) e detritos (material menor que o FSC = 5000) (veja a Figura 1). Use um SSC vs. viabilidade mancha (V450 neste caso) parcela para eliminar as células mortas (aqueles que são positivos para a mancha de viabilidade).
  2. Use um gráfico SSC vs. CD45 para diferenciar as principais classes de leucócitos (granulócitos, monócitos, linfócitos), conforme descrito extensivamente33,34.
    Nota: esta classificação é apenas sugestivo e marcadores específicos de linhagem são necessários para confirmar o tipo de célula.
  3. Para todas as células CD45 +, ou para cada subconjunto leucocitário de interesse, medir a atividade do ADCP por gating com um marcador nas células talão-positivas em um histograma do isotiocianato de fluoresceina (FITC) canal, onde os grânulos fluorescentes são detectados.
    Nota: os poços de controle negativo em que os grânulos não foram adicionados indicará onde as pilhas grânulo-positivas são aparentes no histograma e conseqüentemente onde coloc o marcador de gating.
  4. Calcule os escores de ADCP como (intensidade de fluorescência mediana [MFI] de células de cordão positivo) x (% do total de células CD45 + na população positiva). Use o software gráfico para plotar pontuações em cada concentração de AB/soro e para executar uma análise de área a curva (AUC).
    Nota: o ADCP é considerado positivo se a AUC for superior a 3x desvio-padrão da AUC da Pontuação do ADCP de um controlo negativo não específico mAb (neste caso, 3865).

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Resultados

O leite pode ser mantido à temperatura ambiente ou refrigerador (embora não congelado); no entanto, uma vez que observamos uma redução da viabilidade quando o leite foi mantido muito frio (dados não mostrados), e que é mais simples de recolher, armazenar brevemente, e transportar a temperaturas ambiente, recomenda-se que as amostras não são refrigeradas, a fim de reduzir variabilidade amostra-amostra. No leite obtido 7 − 183 dias após o parto, a concentração celular determinada pelo conta...

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Discussão

A técnica baseada em citometria de fluxo para medir a atividade da ADCP descrita neste documento foi descrita pela primeira vez em 201130 e desde então tem sido comprovada robusta e citada em mais de 80 estudos. O protocolo descrito aqui adapta esta técnica para uso com células BM primárias pela primeira vez. Estudos prévios sobre a funcionalidade mediada pelo FC por células BM têm sido largamente limitados à mensuração de rajadas oxidativas ou ensaios de fagocitose baseados em histologia usando c...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Susan Zolla-Pazner no departamento de medicina e departamento de Microbiologia da Icahn School of Medicine no Monte Sinai para revisão do manuscrito. O NIH/NICHD forneceu financiamento para este projeto o número de subvenção R21 HD095772-01A1. Além disso, R. Powell foi apoiado por fundos do departamento de medicina, divisão de doenças infecciosas, Icahn escola de medicina no Monte Sinai.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 µ m Microesferas marcadas com neutravidina FluoSpheres Thermo FisherF8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45BD560975
Soro bovino AlbuminaMP Biomedicals8810025
Corning Placa de 96 poços de poliestireno com fundo em V Corning 3894
Citocalasina DSigma22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Kit de Biotina Thermo Fisher21338
Falcon 15 mLCorning 
Falcon 50 mL Tubos de Centrífuga CônicosCorning 352070
Mancha de Viabilidade Fixável 450 BD562247
Solução de formaldeídoSigma252549 
HBSS sem Cálcio, Magnésio ou Fenol VermelhoLife Technologies14175-095
Humano Fc BlockBD564219
Albumina de Soro HumanoMP Biomedicals2191349
Kimtech Science Kimwipes Limpeza de Tarefas DelicadasKimberly-Clark Professional 34120
PBS 1x pH 7.4Thermo Fisher10010023
Poliestireno 10 mL Pipetas Sorológicas Corning 4488
Concentradores de Proteínas PES, 3K MWCO, 0,5 mLPierce88512
Tubos de Centrífuga Cônicos 352196 BD

Referências

  1. Hassiotou, F., Geddes, D. T., Hartmann, P. E. Cells in human milk: state of the science. Journal of Human Lactation. 29 (2), 171-182 (2013).
  2. Lonnerdal, B. Nutritional and physiologic significance of human milk proteins. The American Journal of Clinical Nutrition. 77 (6), 1537S-1543S (2003).
  3. Butte, N. F., Garza, C., Stuff, J. E., Smith, E. O., Nichols, B. L. Effect of maternal diet and body composition on lactational performance. The American Journal of Clinical Nutrition. 39 (2), 296-306 (1984).
  4. Dewey, K. G., Finley, D. A., Lonnerdal, B. Breast milk volume and composition during late lactation (7-20 months). Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 3 (5), 713-720 (1984).
  5. Hassiotou, F., Geddes, D. T. Immune cell-mediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding. Advances in Nutrition. 6 (3), 267-275 (2015).
  6. Hanson, L. A. The mother-offspring dyad and the immune system. Acta Paediatrica. 89 (3), 252-258 (2000).
  7. Wirt, D. P., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. Activated and memory T lymphocytes in human milk. Cytometry. 13 (3), 282-290 (1992).
  8. Jain, L., et al. In vivo distribution of human milk leucocytes after ingestion by newborn baboons. Archives of Disease in Childhood. 64 (7 Spec No), 930-933 (1989).
  9. Zhou, L., et al. Two independent pathways of maternal cell transmission to offspring: through placenta during pregnancy and by breast-feeding after birth. Immunology. 101 (4), 570-580 (2000).
  10. Tuboly, S., Bernath, S. Intestinal absorption of colostral lymphoid cells in newborn animals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 503, 107-114 (2002).
  11. Cabinian, A., et al. Transfer of Maternal Immune Cells by Breastfeeding: Maternal Cytotoxic T Lymphocytes Present in Breast Milk Localize in the Peyer's Patches of the Nursed Infant. PLoS ONE. 11 (6), e0156762(2016).
  12. Filias, A., et al. Phagocytic ability of neutrophils and monocytes in neonates. BMC Pediatrics. 11, 29(2011).
  13. Natchu, U. C., et al. Exclusive breastfeeding reduces risk of mortality in infants up to 6 mo of age born to HIV-positive Tanzanian women. The American Journal of Clinical Nutrition. 96 (5), 1071-1078 (2012).
  14. Dewey, K. G., Heinig, M. J., Nommsen-Rivers, L. A. Differences in morbidity between breast-fed and formula-fed infants. The Journal of Pediatrics. 126 (5 Pt 1), 696-702 (1995).
  15. WHO. Collaborative Study Team on the Role of Breastfeeding on the Prevention of Infant Mortality. Effect of breastfeeding on infant and child mortality due to infectious diseases in less developed countries: a pooled analysis. Lancet. 355 (9202), 451-455 (2000).
  16. World Health Organization. Updates on HIV and Infant Feeding: The Duration of Breastfeeding, and Support from Health Services to Improve Feeding Practices Among Mothers Living with HIVWHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2016).
  17. Nelson, C. S., et al. Combined HIV-1 Envelope Systemic and Mucosal Immunization of Lactating Rhesus Monkeys Induces a Robust Immunoglobulin A Isotype B Cell Response in Breast Milk. Journal of Virology. 90 (10), 4951-4965 (2016).
  18. Fowler, M. G., Lampe, M. A., Jamieson, D. J., Kourtis, A. P., Rogers, M. F. Reducing the risk of mother-to-child human immunodeficiency virus transmission: past successes, current progress and challenges, and future directions. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 197 (3 Suppl), S3-S9 (2007).
  19. Shen, R., et al. Mother-to-Child HIV-1 Transmission Events Are Differentially Impacted by Breast Milk and Its Components from HIV-1-Infected Women. PLoS ONE. 10 (12), e0145150(2015).
  20. Fouda, G. G., et al. HIV-specific functional antibody responses in breast milk mirror those in plasma and are primarily mediated by IgG antibodies. Journal of Virology. 85 (18), 9555-9567 (2011).
  21. Van de Perre, P., et al. HIV-1 reservoirs in breast milk and challenges to elimination of breast-feeding transmission of HIV-1. Science Translational Medicine. 4 (143), 143sr143(2012).
  22. Milligan, C., Richardson, B. A., John-Stewart, G., Nduati, R., Overbaugh, J. Passively acquired antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity in HIV-infected infants is associated with reduced mortality. Cell Host & Microbe. 17 (4), 500-506 (2015).
  23. Pollara, J., et al. Association of HIV-1 Envelope-Specific Breast Milk IgA Responses with Reduced Risk of Postnatal Mother-to-Child Transmission of HIV-1. Journal of Virology. 89 (19), 9952-9961 (2015).
  24. Ackerman, M., Nimmerjahn, F. Antibody Fc. , Academic Press. Cambridge, MA. (2014).
  25. Huber, V. C., Lynch, J. M., Bucher, D. J., Le, J., Metzger, D. W. Fc receptor-mediated phagocytosis makes a significant contribution to clearance of influenza virus infections. Journal of Immunology. 166 (12), 7381-7388 (2001).
  26. Fujisawa, H. Neutrophils play an essential role in cooperation with antibody in both protection against and recovery from pulmonary infection with influenza virus in mice. Journal of Virology. 82 (6), 2772-2783 (2008).
  27. Chung, K. M., Thompson, B. S., Fremont, D. H., Diamond, M. S. Antibody recognition of cell surface-associated NS1 triggers Fc-gamma receptor-mediated phagocytosis and clearance of West Nile Virus-infected cells. Journal of Virology. 81 (17), 9551-9555 (2007).
  28. Yasui, F., et al. Phagocytic cells contribute to the antibody-mediated elimination of pulmonary-infected SARS coronavirus. Virology. 454-455, 157-168 (2014).
  29. Quattrocchi, V., et al. Role of macrophages in early protective immune responses induced by two vaccines against foot and mouth disease. Antiviral Research. 92 (2), 262-270 (2011).
  30. Ackerman, M. E., et al. A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples. Journal of Immunological Methods. 366 (1-2), 8-19 (2011).
  31. Jiang, X., et al. Rationally Designed Immunogens Targeting HIV-1 gp120 V1V2 Induce Distinct Conformation-Specific Antibody Responses in Rabbits. Journal of Virology. 90 (24), 11007-11019 (2016).
  32. Sanders, R. W., et al. A next-generation cleaved, soluble HIV-1 Env trimer, BG505 SOSIP.664 gp140, expresses multiple epitopes for broadly neutralizing but not non-neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 9 (9), e1003618(2013).
  33. Im, M., et al. Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets. The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).
  34. Trend, S., et al. Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry. PLoS ONE. 10 (8), e0135580(2015).
  35. Buescher, E. S., McIlheran, S. M. Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).
  36. Franca, E. L., et al. Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).

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