Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV

Resumo

O leite materno transmite o vírus da imunodeficiência humana (HIV), embora apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV sejam infectados. Lactentes amamentados ingeriram ~ 10⁵− 10⁸ leucócitos maternos diários, embora essas células sejam subestudadas. Aqui nós descrevemos a isolação de leucócito do leite de peito e uma análise de sua capacidade fagocitária.

Resumo

Mesmo na ausência de medicamentos antirretrovirais, apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV tornam-se infectados, sugerindo um forte efeito protetor do leite materno (BM). A menos que o acesso à água potável e à fórmula infantil apropriada seja confiável, a OMS não recomenda a cessação do aleitamento materno para as mães infectadas pelo HIV. Inúmeros fatores provavelmente funcionam em conjunto para reduzir a transmissão da BM. Lactentes amamentados ingerir ~ 10⁵− 10⁸ leucócitos maternos diários, embora o que permanece em grande parte obscuro é a contribuição dessas células para as qualidades antivirais do BM. atualmente, objetivou-se isolar as células do BM humano para medir fagocitose celular anticorpo-dependente (ADCP), uma das respostas imunes inata as mais essenciais e as mais Pervasive, por fagócitos do BM de encontro aos alvos do HIV. As células foram isoladas de 5 amostras de BM humanas obtidas em vários estágios de lactação. A isolação foi realizada através da centrifugação delicada seguida pela remoção cuidadosa da gordura de leite e da lavagem repetida da pelota da pilha. Os grânulos fluorescentes revestidos com o epítopo do envelope do HIV (env) foram usados como alvos para a análise de ADCP. As pilhas foram manchadas com o marcador de superfície CD45 para identificar leucócito. Verificou-se que a atividade da ADCP foi significativa acima dos experimentos de controle e mensurável através de um anticorpo 830A específico para o HIV.

Introdução

O leite materno humano (BM) é constituído por células maternas que são > 90% viáveis¹. A composição celular é fortemente impactada pelo estágio de lactação, estado de saúde da mãe e do lactente, e variação individual, que permanece pouco compreendida^1,2,3,4. Dado que o BM contem ~ 10³− 10⁵ leucócito/ml, pode-se estimar que os infantes amamentados ingerem ~ 10⁵− 10⁸ leucócitos maternos diários⁵. Vários estudos in vivo demonstraram que os leucócitos mat....

Protocolo

Cada participante deste estudo foi recrutado e entrevistado de acordo com a aprovação do Conselho de ética e de revisão institucional (IRB) com a orientação e autorização do programa de proteção de sujeitos humanos (PPHS) do Monte Sinai, utilizando um protocolo para obtenção de amostras de leite materno.

1. target microsphere preparação

1. Selecione um antígeno de destino relevante.
   Nota: neste exemplo, a proteína recombinante V1V2-2f5k foi usada, que foi projetada imitar o vértice trimérico do envelope nativo³⁰do HIV.
2. Realize a biotinilação usando um kit comerci....

Resultados

O leite pode ser mantido à temperatura ambiente ou refrigerador (embora não congelado); no entanto, uma vez que observamos uma redução da viabilidade quando o leite foi mantido muito frio (dados não mostrados), e que é mais simples de recolher, armazenar brevemente, e transportar a temperaturas ambiente, recomenda-se que as amostras não são refrigeradas, a fim de reduzir variabilidade amostra-amostra. No leite obtido 7 − 183 dias após o parto, a concentração celular determinada pelo conta.......

Discussão

A técnica baseada em citometria de fluxo para medir a atividade da ADCP descrita neste documento foi descrita pela primeira vez em 2011³⁰ e desde então tem sido comprovada robusta e citada em mais de 80 estudos. O protocolo descrito aqui adapta esta técnica para uso com células BM primárias pela primeira vez. Estudos prévios sobre a funcionalidade mediada pelo FC por células BM têm sido largamente limitados à mensuração de rajadas oxidativas ou ensaios de fagocitose baseados em histologia usando c.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 µ m Microesferas marcadas com neutravidina FluoSpheres	Thermo Fisher	F8776
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD	560975
Soro bovino Albumina	MP Biomedicals	8810025
Corning Placa de 96 poços de poliestireno com fundo em V	Corning	3894
Citocalasina D	Sigma	22144-77-0
EZ-Link NHS-LC-LC-Kit de Biotina	Thermo Fisher	21338
Falcon 15 mL	Corning
Falcon 50 mL Tubos de Centrífuga Cônicos	Corning	352070
Mancha de Viabilidade Fixável 450	BD	562247
Solução de formaldeído	Sigma	252549
HBSS sem Cálcio, Magnésio ou Fenol Vermelho	Life Technologies	14175-095
Humano Fc Block	BD	564219
Albumina de Soro Humano	MP Biomedicals	2191349
Kimtech Science Kimwipes Limpeza de Tarefas Delicadas	Kimberly-Clark Professional	34120
PBS 1x pH 7.4	Thermo Fisher	10010023
Poliestireno 10 mL Pipetas Sorológicas	Corning	4488
Concentradores de Proteínas PES, 3K MWCO, 0,5 mL	Pierce	88512

Tubos de Centrífuga Cônicos 352196 BD