Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV

Desenvolvemos um método rigoroso para isolar células do leite materno humano para estudar a faagocitose celular dependente de anticorpos, ou ADCP, por fagocitos de leite materno contra alvos do HIV. Esta técnica facilita o isolamento relativamente rápido e fácil das células de leite materno para avaliar a capacidade das populações de leucócitos de realizar a ADCP. Demonstrando o procedimento estará Alisa Fox, uma técnica do meu laboratório.

Depois de selecionar um antígeno alvo relevante, use um kit comercial para biotinular a proteína de interesse de acordo com o protocolo do fabricante. E deposite a amostra biotinilada na câmara superior de uma coluna giratória. Adicione PBS até 400 microliters e tampe a câmara antes de inserir a coluna em um tubo de coleta para centrifugação.

Depois de descartar o fluxo através, adicione PBS a 400 microliters para uma segunda centrifugação. Descarte o fluxo através, adicione PBS a 400 microliters, e meça a concentração de proteínas por um espectrofotômetro para conjugar a proteína biotinilada às microferas dos micrômetros. Incubar seis microgramas de proteína com 12 microliters de contas de estoque em 200 microliters de PBS por placa de contas conjugadas à temperatura ambiente por duas horas, com vórtice suave a cada 20 minutos.

No final da incubação, pelota as contas conjugadas de proteína por centrifugação e descarte o supernasce. Após o suave vórtice, resuspenja a proteína em 1200 microliters de 0,1% BSA em PBS, e lave o tubo por centrifugação mais duas vezes como apenas demonstrado. Após a última lavagem, resuspenja a pelota em 1200 microliters em PBS mais BSA.

Para configurar placas de ensaio ADCP, primeiro prepare 12 diluições de microliter de anticorpos, ou o soro imunológico de interesse, em 2%BSA em PBS em uma placa redonda inferior 96 bem. Adicione 10 microliters de contas conjugadas de proteínas por poço à placa para uma incubação de duas horas a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, adicione 200 microliters de PBS mais BSA.

Após a obtenção do leite materno humano de mulheres lactantes saudáveis expressando usando uma bomba, dentro de quatro horas de expressão separam o teor de leite por centrifugação e despejam cuidadosamente o leite e a gordura desnatados, deixando a pelota celular intacta. Limpe o interior do tubo com uma limpeza sem fiapos para remover toda a gordura da parede do tubo e adicione 10 mililitros de PBS mais HSA. Resuspengue a pelota com tubulação suave para evitar a ativação celular na apoptose, e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros para centrifugação.

Depois de uma segunda lavagem em PBS mais HSA como apenas demonstrado, resuspend suavemente as células em um a dois mililitros de PBS fresco mais HSA para contar. Para um ensaio ADCP, inverta rapidamente a placa ADCP preparada para decantar o supernante após a centrifugação final e adicionar cinco vezes 10 em uma quarta célula de leite materno recém-isolada em 200 microliters de PBS mais BSA para uma incubação de duas horas a 37 graus Celsius. No final da incubação, centrifugar as células e lavar as pelotas duas vezes em 200 microliters de PBS fresco, como demonstrado.

Após a última lavagem, manche as células com 0,5 microgramas por mililitro de mancha de viabilidade fixa 450 por poço em 50 microliters de PBS por 30 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz. No final da incubação, pelota as células para duas lavagens em PBS fresco como demonstrado, e mancha as células para os marcadores leucócitos de interesse por 30 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz. Ao final da incubação, colete as células centrifugação e lave as células duas vezes em 200 microliters de 1%BSA mais PBS por lavagem.

Após a última lavagem, fixe as pelotas em 200 microlitres de 0,5% de formaldeído por poço por 30 minutos em temperatura ambiente, protegidos da luz. Para análise citométrica de fluxo das amostras celulares, defina um citómetro de fluxo equipado com um leitor de placa de alto rendimento para retirar 175 microliters de amostra e coletar 5000 células por poço. Realize o gating inicial para eliminar dobras e detritos em uma dispersão para a frente versus gráfico de dispersão lateral.

Use uma dispersão lateral versus a viabilidade do gráfico de manchas para eliminar as células mortas. E use uma dispersão lateral versus o enredo CD45 para diferenciar as principais classes de leucócitos. Para todas as células positivas cd45, ou para cada subconjunto de interesse leucócito, meça a atividade de fagocitose celular dependente de anticorpos, gating com um marcador nas células positivas das contas em um histograma do canal fluoróforo apropriado para as contas conjugadas.

Em seguida, calcule os escores de fagocitose celular dependentes de anticorpos como a mediana da intensidade de fluorescência das células positivas das contas pelo percentual do CD45 total mais as células da população positiva. Aqui, a estratégia de gating para eliminar doublets, detritos e células mortas é mostrada. Entre um a 12% do total de células vivas são tipicamente leucócitos positivos CD45 com a maioria dos supostos lados dispersos baixos para mdados intermediários CD45 baixos aparentando ser precursores, ou para células imaturos, com base na dispersão lateral versus gating CD45.

Os supostos granulócitos são definidos como dispersão lateral alta, células intermediárias CD45. A medição da atividade ADCP de células de leite materno recém-isoladas usando um anticorpo monoclonal humano específico do HIV em um mês pós-parto revela que o tratamento com o inibidor de actina Cytochalasin D e ou receptor fc bloqueando anticorpos antes da incubação com contas de anticorpos ligados a antígenos resulta na atividade ADCP na ou abaixo do observado na presença de anticorpos de controle. A pontuação ADCP determinada para células positivas CD45 totais é comumente entre 25 a 35 vezes acima dos níveis de fundo, definida usando um controle negativo, anticorpo monoclonal anti-antraz.

Cada amostra de leite materno é única e algumas pelotas podem ser difíceis de ver. Além disso, as populações de leucócitos e, portanto, os escores de ADCP, podem variar imensamente de amostra para amostra.