Name: Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a isolar leucócitos do leite materno humano para avaliar a fagocitose celular dependente de anticorpos contra alvos de HIV. Este método permite estudar a resposta imune e a transmissão do vírus em lactentes.

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Agradecemos ao Dr. Susan Zolla-Pazner no departamento de medicina e departamento de Microbiologia da Icahn School of Medicine no Monte Sinai para revisão do manuscrito. O NIH/NICHD forneceu financiamento para este projeto o número de subvenção R21 HD095772-01A1. Além disso, R. Powell foi apoiado por fundos do departamento de medicina, divisão de doenças infecciosas, Icahn escola de medicina no Monte Sinai.

Cada participante deste estudo foi recrutado e entrevistado de acordo com a aprovação do Conselho de ética e de revisão institucional (IRB) com a orientação e autorização do programa de proteção de sujeitos humanos (PPHS) do Monte Sinai, utilizando um protocolo para obtenção de amostras de leite materno.
1. target microsphere preparação
<ol><li>Selecione um antígeno de destino relevante. Nota: neste exemplo, a proteína recombinante V1V2-2f5k foi usada, que foi projetada imitar o vértice trimérico do envelope nativo30do HIV.</li>
	<li>Realize a biotinilação usando um kit comercial (tabela de materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.<ol>
<li>Calcule o mmol do reagente da biotina para adicionar à reação para um excesso do molar de 5 dobras usando a fórmula: mmol biotina = ml proteína x (proteína do magnésio protein/mL) x (proteína da biotina/magnésio do mmol) x (proteína da biotina/mmol de 5 mmol)30,31. Em seguida, calcule μL do reagente de biotina para adicionar utilizando a fórmula: μL de biotina = mmol biotina x (1 milhão μL/L) x (L/10 mmol).</li>
		<li>Equilibram a biotina à temperatura ambiente antes da abertura. Dissolva a proteína em 0,5 − 2,0 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) de acordo com o cálculo feito acima.</li>
		<li>Prepare uma solução de 10 mM de reagente de biotina em dimetilsulfóxido (DMSO) e adicione o volume apropriado de 10 mM de reagente de biotina à solução proteica, e incubar reação no gelo por 2 h ou em temperatura ambiente por 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remover excesso de biotina usando concentradores de proteínas (polietersulfona [PES] membranas, 3 kDa peso molecular Cut-off [MWCO], 0,5 mL; Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.<ol>
<li>Deposite a amostra na câmara superior da coluna de giro e adicione PBS até 400 μL. Cap, em seguida, insira esta câmara de amostra em um tubo de coleta. Centrifugador a 12.000 x g à temperatura ambiente durante 30 min.</li>
		<li>Descarte o fluxo e adicione PBS a 400 μL. Repita a centrifugação. Descarte o fluxo e adicione PBS a 100 μL. Meça a concentração da proteína por um espectrofotômetro. Nota: a proteína pode ser aliquotada e congelada a-80 ° c até ser usada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. anticorpo-dependente de phagocytosis celular (ADCP) preparação placa de ensaio
<ol><li>Conjugar proteínas biotiniladas a 1 μm de microesferas (' grânulos '; Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.<ol>
<li>Por placa de grânulos conjugados, incubar 6 μg de proteína com 12 μL de grânulos de estoque em 200 μL de 0,1% de albumina sérica bovina (BSA)-PBS à temperatura ambiente por 1 h, vortexing suavemente a cada 20 min.</li>
		<li>Centrifugador a 13.000 x g durante 5 min. descarte o sobrenadante, vórtice suavemente e ressuscitará em 1200 μL de 0,1% de BSA-PBS. Repita a rotação e a etapa de lavagem 2x. Ressuscito em 1200 μL de 0,1% de BSA-PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alíquota 10 μL de solução de cordão por poço em uma placa de fundo redondo 96-well. Prepare diluições de anticorpos ou soros imunes de interesse em 12 μL de HSA HBSS a 2%, tipicamente a partir de 50 μg/mL de anticorpo ou uma diluição sérica de 1/100. Nota: nos dados amostrais, utilizou-se o anticorpo monoclonal (mAb) 830A.</li>
	<li>Adicionar 10 μL de anticorpo titulado/soro à placa do talão e incubar durante 2 h a 37 ° c. Adicionar 200 μL de HSA HBSS de 2% a cada poço e placa de centrifugação a 2.000 x g durante 10 min.</li>
	<li>Remova com cuidado o sobrenadante por um rápido derrubamento e decantação do líquido dos poços da placa em um dissipador para evitar perturbar a pelota invisível do grânulo.</li>
</ol>isolação da pilha do leite 3. Breast
<ol><li>Obter leite materno humano de mulheres lactantes saudáveis, expressas usando bombas eletrônicas ou manuais duplas. Isolar células dentro de ~ 4 h de expressão, mantendo o leite à temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando 50 mL de tubos, centrífuga 50 mL de leite em 800 x g por 15 min. cuidadosamente despeje o leite desnatado e gordura, deixando a pelota celular não perturbado. Limpe o interior do tubo com uma limpeza sem fiapos para remover toda a gordura da parede do tubo.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de 2% de albúmen de soro humano na solução de sal equilibrado de Hank (2% HSA HBSS [sem CA2 + ou mg+]). Resuspend o pellet por pipetagem suave para evitar a ativação celular e apoptose. Transferir para um tubo de 15 mL e centrifugar a 450 x g durante 10 min.</li>
	<li>Despeje o sobrenadante e repita o passo 1,3. Em seguida, reressuscitando suavemente as células em 1 − 2 ml de 2% HSA HBSS dependendo do número de célula esperado, e contagem de células por um hemocitômetro ou um contador de células automatizado, observando também a viabilidade celular.</li>
</ol>ensaio 4. ADCP
Nota: os métodos descritos aqui são adaptados de Ackerman et al.32.
<ol><li>Adicionar 50.000 células BM recém-isoladas para cada placa de ensaio ADCP bem em 200 μL de 2% HSA-HBSS. Incubar por 2 h a 37 ° c.<ol>
<li>Para experimentos de controle, pré-incubar células a 37 ° c com 10 μg/mL de inibidor de actina (cytochalasin-D), 50 μg/mL de agente de bloqueio FcR (FcBlock), ou uma combinação de ambos antes de sua adição às placas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placa centrífuga a 930 x g por 10 min. Adicione 200 μL de 2% de HSA HBSS e repita a centrifugação. Remova cuidadosamente o sobrenadante como na etapa 2,7 e repita a lavagem.</li>
	<li>Retire cuidadosamente as células sobrenadantes e de mancha para a viabilidade utilizando 0,5 μg/mL (concentração final) de viabilidade fixável mancha 450 por poço em 50 μL de 2% HSA HBSS. Incubar 20 min à temperatura ambiente no escuro. Placa do centrifugador em 930 x g por 10 minutos e remova o sobrenadante como na etapa 2,7. Adicionar 200 μL de 2% HSA HBSS e placa centrífuga novamente seguido por remoção de sobrenadante como no passo 2,7.</li>
	<li>Após a coloração da viabilidade, as pilhas da mancha para marcadores da leucócito do interesse, incluindo minimamente uma mancha CD45-specific tal como o CD45 do PE-rato anti-Human (clone HI30) em uma concentração aperfeiçoada (1 μg/μL em 50 μL de 1% BSA HBSS nos dados do exemplo). Nota: quaisquer marcadores específicos de linhagem de interesse podem ser incluídos.</li>
	<li>Incubar 20 min à temperatura ambiente no escuro. Placa do centrifugador em 930 x g por 10 minutos e remova o sobrenadante como na etapa 2,7. Adicionar 200 μL de 1% de BSA HBSS e repetir a centrifugação. Remover sobrenadante. Fixar células em 200 μL de 0,5% de formaldeído no escuro à temperatura ambiente durante 30 min ou durante a noite a 4 ° c. Refrigerate no escuro até a análise.</li>
</ol>5. análise por citometria de fluxo
<ol><li>Realize a gating inicial para eliminar doublets em um gráfico de dispersão (FSC) versus dispersão lateral (SSC) e detritos (material menor que o FSC = 5000) (veja a Figura 1). Use um SSC vs. viabilidade mancha (V450 neste caso) parcela para eliminar as células mortas (aqueles que são positivos para a mancha de viabilidade).</li>
	<li>Use um gráfico SSC vs. CD45 para diferenciar as principais classes de leucócitos (granulócitos, monócitos, linfócitos), conforme descrito extensivamente33,34. Nota: esta classificação é apenas sugestivo e marcadores específicos de linhagem são necessários para confirmar o tipo de célula.</li>
	<li>Para todas as células CD45 +, ou para cada subconjunto leucocitário de interesse, medir a atividade do ADCP por gating com um marcador nas células talão-positivas em um histograma do isotiocianato de fluoresceina (FITC) canal, onde os grânulos fluorescentes são detectados. Nota: os poços de controle negativo em que os grânulos não foram adicionados indicará onde as pilhas grânulo-positivas são aparentes no histograma e conseqüentemente onde coloc o marcador de gating.</li>
	<li>Calcule os escores de ADCP como (intensidade de fluorescência mediana [MFI] de células de cordão positivo) x (% do total de células CD45 + na população positiva). Use o software gráfico para plotar pontuações em cada concentração de AB/soro e para executar uma análise de área a curva (AUC). Nota: o ADCP é considerado positivo se a AUC for superior a 3x desvio-padrão da AUC da Pontuação do ADCP de um controlo negativo não específico mAb (neste caso, 3865).</li>
</ol>

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<li>Im, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+quantitative+analysis+of+cluster+of+differentiation+45+antigen+expression+on+lymphocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Korean+Journal+of+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative quantitative analysis of cluster of differentiation 45 antigen expression on lymphocyte subsets.</a> The Korean Journal of Laboratory Medicine. 31 (3), 148-153 (2011).</li>
<li>Trend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+Populations+in+Human+Preterm+and+Term+Breast+Milk+Identified+by+Multicolour+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Leukocyte Populations in Human Preterm and Term Breast Milk Identified by Multicolour Flow Cytometry.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135580(2015).</li>
<li>Buescher, E. S., McIlheran, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+leukocytes+and+human+colostrum%3A+effects+of+in+vivo+and+in+vitro+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear leukocytes and human colostrum: effects of in vivo and in vitro exposure.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 17 (4), 424-433 (1993).</li>
<li>Franca, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colostral+phagocytes+eliminate+enterotoxigenic+Escherichia+coli+opsonized+by+colostrum+supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%2C+Immunology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Human colostral phagocytes eliminate enterotoxigenic Escherichia coli opsonized by colostrum supernatant.</a> Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 44 (1), 1-7 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A técnica baseada em citometria de fluxo para medir a atividade da ADCP descrita neste documento foi descrita pela primeira vez em 201130 e desde então tem sido comprovada robusta e citada em mais de 80 estudos. O protocolo descrito aqui adapta esta técnica para uso com células BM primárias pela primeira vez. Estudos prévios sobre a funcionalidade mediada pelo FC por células BM têm sido largamente limitados à mensuração de rajadas oxidativas ou ensaios de fagocitose baseados em histologia usando c...

O leite materno humano (BM) é constituído por células maternas que são > 90% viáveis1. A composição celular é fortemente impactada pelo estágio de lactação, estado de saúde da mãe e do lactente, e variação individual, que permanece pouco compreendida1,2,3,4. Dado que o BM contem ~ 103− 105 leucócito/ml, pode-se estimar que os infantes amamentados ingerem ~ 105− 108 leucócitos maternos diários5. Vários estudos in vivo demonstraram que os leucócitos maternos fornecem imunidade crítica ao lactente e são funcionais bem além desses sítios de ingestão inicial5,6,7,8 ,9,10,11. Todas as células derivadas da maternally ingeridas pelo lactente têm potencial para realizar funções imunes ao lado ou para compensar os leucócitos próprios do lactente12.
A transmissão materno-infantil (MTCT) do vírus da imunodeficiência humana (HIV) continua a ser uma crise em países com recursos limitados. Como as doenças diarreicas e respiratórias são responsáveis por taxas substanciais de mortalidade entre lactentes em países com recursos limitados, e essas doenças são significativamente reduzidas pelo aleitamento materno exclusivo, os benefícios para as mães infectadas pelo HIV a amamentação supera em muito os riscos13,14,15. A menos que o acesso à água potável e à fórmula infantil adequada seja confiável, a OMS não recomenda a cessação do aleitamento materno para mães infectadas pelo HIV16. Aproximadamente 100.000 MTCTs via BM ocorrem anualmente; no entanto, apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por suas mães infectadas pelo HIV tornam-se infectados, sugerindo um forte efeito protetor da BM17,18,19,20,21. Inúmeros fatores provavelmente funcionam em conjunto para evitar a transmissão. Importante, os anticorpos HIV-específicos (ABS) no BM foram correlacionados com o MTCT reduzido e/ou a morte infantil reduzida da infecção de HIV22,23. O que permanece em grande parte obscuro é a contribuição da fração celular da BM para suas qualidades antivirais.
Muitos ABS facilitam uma variedade de atividades antivirais mediadas pela região ' constante ' da molécula de imunoglobulina, o fragmento cristalizável (FC), através da interação com receptores FC (FcRs) encontrados em praticamente todas as células imunes inatas, praticamente todos os quais são encontrados em humanos BM24. O fagocitose celular anticorpo-dependente (ADCP) foi demonstrado como necessário para o afastamento de infecções virais e foi subestudado no caso da prevenção do MTCT do HIV25,26,27, 28 anos de , 29. dada a escassez de conhecimento sobre a potencial contribuição da atividade da ADCP pelos FAGOÓCITOS da BM para a prevenção da MTCT do HIV, objetivou-se desenvolver um método rigoroso para isolar as células da BM humana, a fim de realizar um estudo de ADCP mediado por células de BM Obtido em vários estágios de lactação.

<table><tbody><tr><td>1 &micro; m Microesferas marcadas com neutravidina FluoSpheres&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>F8776</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45</td><td>BD</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino Albumina</td><td>MP Biomedicals</td><td>8810025</td><td></td></tr><tr><td>Corning Placa de 96 poços de poliestireno com fundo em V&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3894</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Sigma</td><td>22144-77-0</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-LC-LC-Kit de Biotina&nbsp;</td>Tubos de Centrífuga Cônicos <td>Thermo Fisher</td><td>21338</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>352196</tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubos de Centrífuga Cônicos</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Mancha de Viabilidade Fixável 450&nbsp;</td><td>BD</td><td>562247</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído</td><td>Sigma</td><td>252549&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sem Cálcio, Magnésio ou Fenol Vermelho</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr> BD <tr><td>Humano Fc Block</td><td>BD</td><td>564219</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Humano</td><td>MP Biomedicals</td><td>2191349</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes Limpeza de Tarefas Delicadas</td><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp;</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7.4</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Poliestireno 10 mL Pipetas Sorológicas&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Concentradores de Proteínas PES, 3K MWCO, 0,5 mL</td><td>Pierce</td><td>88512</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de hiv

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Mesmo na ausência de medicamentos antirretrovirais, apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV tornam-se infectados, sugerindo um forte efeito protetor do leite materno (BM). A menos que o acesso à água potável e à fórmula infantil apropriada seja confiável, a OMS não recomenda a cessação do aleitamento materno para as mães infectadas pelo HIV. Inúmeros fatores provavelmente funcionam em conjunto para reduzir a transmissão da BM. Lactentes amamentados ingerir ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora o que permanece em grande parte obscuro é a contribuição dessas células para as qualidades antivirais do BM. atualmente, objetivou-se isolar as células do BM humano para medir fagocitose celular anticorpo-dependente (ADCP), uma das respostas imunes inata as mais essenciais e as mais Pervasive, por fagócitos do BM de encontro aos alvos do HIV. As células foram isoladas de 5 amostras de BM humanas obtidas em vários estágios de lactação. A isolação foi realizada através da centrifugação delicada seguida pela remoção cuidadosa da gordura de leite e da lavagem repetida da pelota da pilha. Os grânulos fluorescentes revestidos com o epítopo do envelope do HIV (env) foram usados como alvos para a análise de ADCP. As pilhas foram manchadas com o marcador de superfície CD45 para identificar leucócito. Verificou-se que a atividade da ADCP foi significativa acima dos experimentos de controle e mensurável através de um anticorpo 830A específico para o HIV.

O leite pode ser mantido à temperatura ambiente ou refrigerador (embora não congelado); no entanto, uma vez que observamos uma redução da viabilidade quando o leite foi mantido muito frio (dados não mostrados), e que é mais simples de recolher, armazenar brevemente, e transportar a temperaturas ambiente, recomenda-se que as amostras não são refrigeradas, a fim de reduzir variabilidade amostra-amostra. No leite obtido 7 − 183 dias após o parto, a concentração celular determinada pelo conta...

O leite materno transmite o vírus da imunodeficiência humana (HIV), embora apenas ~ 15% dos lactentes amamentados por mães infectadas pelo HIV sejam infectados. Lactentes amamentados ingeriram ~ 105− 108 leucócitos maternos diários, embora essas células sejam subestudadas. Aqui nós descrevemos a isolação de leucócito do leite de peito e uma análise de sua capacidade fagocitária.

Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...

Desenvolvemos um método rigoroso para isolar células do leite materno humano para estudar a faagocitose celular dependente de anticorpos, ou ADCP, por fagocitos de leite materno contra alvos do HIV. Esta técnica facilita o isolamento relativamente rápido e fácil das células de leite materno para avaliar a capacidade das populações de leucócitos de realizar a ADCP. Demonstrando o procedimento estará Alisa Fox, uma técnica do meu laboratório.Depois de selecionar um antígeno alvo relevante, use um kit comercial para biotinular a proteína de interesse de acordo com o protocolo do fabricante. E deposite a amostra biotinilada na câmara superior de uma coluna giratória. Adicione PBS até 400 microliters e tampe a câmara antes de inserir a coluna em um tubo de coleta para centrifugação.Depois de descartar o fluxo através, adicione PBS a 400 microliters para uma segunda centrifugação. Descarte o fluxo através, adicione PBS a 400 microliters, e meça a concentração de proteínas por um espectrofotômetro para conjugar a proteína biotinilada às microferas dos micrômetros. Incubar seis microgramas de proteína com 12 microliters de contas de estoque em 200 microliters de PBS por placa de contas conjugadas à temperatura ambiente por duas horas, com vórtice suave a cada 20 minutos.No final da incubação, pelota as contas conjugadas de proteína por centrifugação e descarte o supernasce. Após o suave vórtice, resuspenja a proteína em 1200 microliters de 0,1% BSA em PBS, e lave o tubo por centrifugação mais duas vezes como apenas demonstrado. Após a última lavagem, resuspenja a pelota em 1200 microliters em PBS mais BSA.Para configurar placas de ensaio ADCP, primeiro prepare 12 diluições de microliter de anticorpos, ou o soro imunológico de interesse, em 2%BSA em PBS em uma placa redonda inferior 96 bem. Adicione 10 microliters de contas conjugadas de proteínas por poço à placa para uma incubação de duas horas a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, adicione 200 microliters de PBS mais BSA.Após a obtenção do leite materno humano de mulheres lactantes saudáveis expressando usando uma bomba, dentro de quatro horas de expressão separam o teor de leite por centrifugação e despejam cuidadosamente o leite e a gordura desnatados, deixando a pelota celular intacta. Limpe o interior do tubo com uma limpeza sem fiapos para remover toda a gordura da parede do tubo e adicione 10 mililitros de PBS mais HSA. Resuspengue a pelota com tubulação suave para evitar a ativação celular na apoptose, e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros para centrifugação.Depois de uma segunda lavagem em PBS mais HSA como apenas demonstrado, resuspend suavemente as células em um a dois mililitros de PBS fresco mais HSA para contar. Para um ensaio ADCP, inverta rapidamente a placa ADCP preparada para decantar o supernante após a centrifugação final e adicionar cinco vezes 10 em uma quarta célula de leite materno recém-isolada em 200 microliters de PBS mais BSA para uma incubação de duas horas a 37 graus Celsius. No final da incubação, centrifugar as células e lavar as pelotas duas vezes em 200 microliters de PBS fresco, como demonstrado.Após a última lavagem, manche as células com 0,5 microgramas por mililitro de mancha de viabilidade fixa 450 por poço em 50 microliters de PBS por 30 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz. No final da incubação, pelota as células para duas lavagens em PBS fresco como demonstrado, e mancha as células para os marcadores leucócitos de interesse por 30 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz. Ao final da incubação, colete as células centrifugação e lave as células duas vezes em 200 microliters de 1%BSA mais PBS por lavagem.Após a última lavagem, fixe as pelotas em 200 microlitres de 0,5% de formaldeído por poço por 30 minutos em temperatura ambiente, protegidos da luz. Para análise citométrica de fluxo das amostras celulares, defina um citómetro de fluxo equipado com um leitor de placa de alto rendimento para retirar 175 microliters de amostra e coletar 5000 células por poço. Realize o gating inicial para eliminar dobras e detritos em uma dispersão para a frente versus gráfico de dispersão lateral.Use uma dispersão lateral versus a viabilidade do gráfico de manchas para eliminar as células mortas. E use uma dispersão lateral versus o enredo CD45 para diferenciar as principais classes de leucócitos. Para todas as células positivas cd45, ou para cada subconjunto de interesse leucócito, meça a atividade de fagocitose celular dependente de anticorpos, gating com um marcador nas células positivas das contas em um histograma do canal fluoróforo apropriado para as contas conjugadas.Em seguida, calcule os escores de fagocitose celular dependentes de anticorpos como a mediana da intensidade de fluorescência das células positivas das contas pelo percentual do CD45 total mais as células da população positiva. Aqui, a estratégia de gating para eliminar doublets, detritos e células mortas é mostrada. Entre um a 12% do total de células vivas são tipicamente leucócitos positivos CD45 com a maioria dos supostos lados dispersos baixos para mdados intermediários CD45 baixos aparentando ser precursores, ou para células imaturos, com base na dispersão lateral versus gating CD45.Os supostos granulócitos são definidos como dispersão lateral alta, células intermediárias CD45. A medição da atividade ADCP de células de leite materno recém-isoladas usando um anticorpo monoclonal humano específico do HIV em um mês pós-parto revela que o tratamento com o inibidor de actina Cytochalasin D e ou receptor fc bloqueando anticorpos antes da incubação com contas de anticorpos ligados a antígenos resulta na atividade ADCP na ou abaixo do observado na presença de anticorpos de controle. A pontuação ADCP determinada para células positivas CD45 totais é comumente entre 25 a 35 vezes acima dos níveis de fundo, definida usando um controle negativo, anticorpo monoclonal anti-antraz.Cada amostra de leite materno é única e algumas pelotas podem ser difíceis de ver. Além disso, as populações de leucócitos e, portanto, os escores de ADCP, podem variar imensamente de amostra para amostra.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células B do sangue periférico humano usando anticorpos biotinilados específicos para células não B e microesferas magnéticas conjugadas com estreptavidina.

Isolamento e purificação de células B do sangue periférico humano

Este vídeo demonstra um ensaio para medir a fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP) por fagócitos do leite materno. Microesferas marcadas com fluorescência conjugadas a um complexo antígeno-anticorpo são combinadas com uma suspensão celular isolada do leite materno para induzir a fagocitose celular dependente de anticorpos pelos leucócitos fagocíticos. Ao marcar as células com anticorpos contra o antígeno leucocitário comum (CD45), a citometria de fluxo é usada para medir a...

Um ensaio in vitro para medir a fagocitose celular dependente de anticorpos por fagócitos

Aqui descrevemos um protocolo para o isolamento de subconjuntos de precursor células B do sangue do cordão umbilical. A quantidade e qualidade suficientes de ácidos nucleicos podem ser extraídos a partir das células e usadas em ensaios subsequentes utilizando DNA ou RNA.

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

Descrito aqui é um protocolo para isolar e estudar mais detalhadamente os leucócitos infiltrantes da decídua basal e decídua parietalis - a interface materno-fetal humana. Este protocolo mantém a integridade dos marcadores de superfície celular e produz células viáveis suficientes para aplicações a jusante, conforme comprovado pela análise de citometria de fluxo.

Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

Técnicas que descrevem um procedimento de gradiente para separar exossomos de partículas do vírus da imunodeficiência humana (HIV) são descritas. Este procedimento foi usado para isolar exossomos de partículas de HIV no plasma humano de indivíduos infectados pelo HIV. Os exossomos isolados foram analisados quanto ao conteúdo de citocinas/quimiocinas.

Isolamento de exossomas a partir do plasma do HIV-1 indivíduos positivos

Descrevemos um método para medir a velocidade dos fagossomos que se movem em direção ao centro celular em células vivas infectadas com ou sem o vírus da imunodeficiência humana (HIV) tipo 1, usando microscopia de fluorescência confocal de disco giratório para identificar células infectadas fluorescentes e microscopia de campo claro para detectar fagossomos.

Migração fagossomo e velocidade medida no Live primárias macrófagos humanos infectados com o HIV-1

O sangue periférico humano é comumente usado para a avaliação da resposta imune humoral. Aqui, são descritos os métodos para isolar células B humanas do sangue periférico, diferenciar células B humanas em células B secretoras de anticorpos (Ab) (ASCs) em cultura e enumerar o total de IgM- e IgG-ASCs por meio de um ensaio ELISpot.

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

Nós descrevemos um método para processar o líquido broncoalveolar do lavagem e o sangue periférico combinado dos indivíduos cronicamente HIV-contaminados na terapia antiretroviral para avaliar reservatórios pulmonars do HIV. Estes métodos resultam na aquisição de células T CD4 altamente puras e macrófagos alveolares que posteriormente podem ser utilizados para a imunofenotipagem e quantificações de DNA/RNA do HIV por reação em cadeia da polimerase ultrassensora.

Processamento de fluido de lavagem broncoalveolar e sangue pareado para macrófago alveolar e CD4+ T-Cell immunophenotyping e avaliação do reservatório de HIV

Apresentado aqui é um protocolo otimizado para isolar, cultivar, transfeccionar e diferenciar monócitos primários humanos de indivíduos infectados pelo HIV e controles saudáveis.

Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários

Este protocolo detalha um método compatível com automação de alto rendimento para isolar células mononucleares do sangue periférico humano para biobancos e outros fins.

Isolando células mononucleares do sangue periférico humano de Buffy Coats por meio de separação de esferas imunomagnéticas de alto rendimento

Este protocolo foi projetado para agilizar e permitir o isolamento eficaz de vesículas extracelulares do leite materno humano com alta pureza.

Isolamento rápido de vesículas extracelulares derivadas do leite materno humano

Aprenda a isolar leucócitos do leite materno humano para avaliar a fagocitose celular dependente de anticorpos contra alvos de HIV. Este método permite estudar a resposta imune e a transmissão do vírus em lactentes.

Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de leucócitos do leite materno humano para uso em um ensaio de fagocitose celular dependente de anticorpos de alvos de HIV

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