Um modelo de expressão de Quimiocina ectópica para testar o recrutamento de macrófago in vivo

O zebrafish é um pequeno peixe tropical de água doce de ossos duros originado na Índia. A respeito da conservação genética, o zebrafish tem uma similaridade de 87% ao ser humano¹. Pode fornecer-nos introspecções em assuntos relacionados do ser humano estudando o Regulamento do gene, a função da proteína e o comportamento da pilha tais como a migração, proliferação et.al no zebrafish. O embrião de zebrafish pode ser usado para observar o desenvolvimento de embriões adiantados em estágios diferentes após ter inibindo o pigmento. Enquanto isso, leva apenas três meses para que o zebrafish se desenvolva em maturidade sexual, então o zebrafish pode produzir centenas de ovos a cada 4 dias. O mini-tamanho, melhoramento simples, capacidade reprodutiva forte, estas vantagens faz a cultura do zebrafish muito espaço-economia, conducente à cultura em grande escala. O rato modelo tradicional de mamíferos tem um custo de manutenção mais elevado do que o zebrafish, limitando conseqüentemente a escala da elevação do rato. No aspecto do desenvolvimento embrionário precoce, o embrião de camundongo é difícil de observar em condições de viver devido às características do desenvolvimento embrionário do camundongo no útero materno. Pelo contrário, os embriões de zebrafish desenvolvem-se externamente e são transparentes, por isso são fáceis de observar um microscópio. Além disso, o zebrafish é muito fácil construir uma variedade de linhas transgênicas para a pesquisa relacionada da função do gene. Atualmente, várias linhas de zebrafish transgênicos estão disponíveis para rotular diferentes tipos de células. É muito conveniente agora para construir linhas transgênicas para sobre-expressão quimiocinas em locais específicos e estudar a função de quimiocinas no comportamento celular em zebrafish.

Aqui, fornecemos um fluxo de trabalho para a utilização da linha de zebrafish transgênica para investigar a função do Il-34 no comportamento dos macrófago in vivo^2,3,4,5,6,7. Primeiramente, nós construímos um plasmídeo de superexpressão fígado-específico do gene il34 e injetamos o plasmídeo em embriões de peixes do estágio TG da um-pilha (MPEG1: GFP) que etiquetaram especificamente os macrófagos pela proteína fluorescente GFP. Então, nós usamos a hibridação in situ fluorescente da montagem inteira e a imunocoloração para detectar o teste padrão da expressão il34 e o número ou a posição dos macrófagos. Os embriões de WT injetados foram levantados para gerar uma linha transgênica estável. Nessas etapas, estabelecemos e validamos a linha produtora de citocinas e avaliamos visualmente os efeitos que podem ser observados na distribuição de macrófago. Por fim, para investigar o comportamento dos macrófago em resposta à citocina, utilizou-se a imagem viva confocal para observar diretamente a migração de macrófago para confirmar a função de il34 na migração de macrófago in vivo.

Nota: Todas as amostras foram tratadas pela água do ovo de phenylthiourea (PTU) para inibir o pigmento.

1. geração de TG (fabp10a: il34) construções transgênicas e injeção de peixe

1. Clone o 2,8 KB fabp10a promotor⁸ e as regiões de codificação Il-34 (ensdart 00000126460.3) de zebrafish no vetor pTol2 para gerar a construção fabp10a-il34. Injete os constructos em um estádio de células TG (MPEG1: GFP) e em embriões de peixes WT juntamente com a peptídeo mRNA. Levante os embriões injetados fabp10a-il34 do WT ao adulto⁹ e identifique o founder transgênicas pela hibridação in situ.
   Nota: A injeção do construto Tol2 diretamente em outro transgênico pode ser problemática se a outra linha transgênica for feita com o mesmo sistema de Transposon. Uma prática geral seria fazer uma linha transgênica independente e, posteriormente, cruzar a nova linha com outra linha de repórter. Isso garante que não haverá efeitos da nova transgênese em um transgene previamente inserido.

2. fluorescente toda a montagem in situ hibridação (WISH) combinar com imunocoloração

1. Fixação da amostra
   1. Colete embriões de injeção transitória ou linha transgênica estável IL-34 que cruzou com TG (MPEG1: GFP) em estágios desejados.
      Nota: Para este caso, os embriões foram coletados em 4 d pós-fertilização (DPF). (Se necessário) Retire o Chorion por seringa.
   2. Fixar os embriões com paraformaldeído 4% (PFA) durante a noite a 4 ° c ou 2 h à temperatura ambiente (RT) (cerca de 25 ° c).
   3. Lave os embriões com tampão fosfato salina mais Tween 20 (PBST) 3x 5 min.
   4. Desidrata os embriões separadamente com 50% de metanol em PBST (50% metanol/PBST) e 100% de metanol, 1x 5 min cada. Em seguida, mude para o metanol 100% fresco e armazene a-20 ° c (pelo menos 2 h).
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Hibridação da sonda (dia I)
   1. Rehidratar os embriões nas etapas anteriores com 50% de metanol em PBST (50% metanol/PBST), em seguida, lave com PBST 3x 5 min.
   2. Digerir os embriões com proteinase K em PBST em RT (concentração final: 10 μg/mL; 1:2000 em PBST).
      Nota: O tempo da digestão depende do estágio dos embriões: menos do que a fertilização do borne de 36 h (HPF), nenhuma necessidade; 36 HPF-2 DPF embrião, 3-5 min; 2-3 DPF embrião, 10 min; 3-4 DPF embrião, 15 min; 4-5 DPF embrião, 15-20 min; 5-6 DPF embrião, 20-27 min; > 6 DPF embrião, 25-30 min em RT (cerca de 25 ° c).
   3. Descarte a solução de digestão e realize a fixação novamente com 4% de PFA, por 20 min em RT.
   4. Lave os embriões com PBST 2x 10 min.
   5. Descarte o PBST, realize a pré-hibridação com amortecedor aquecido da hibridação (amortecedor do HB) em 65 ° c por 5 minutos, recicl o amortecedor do HB no tubo original.
   6. Realize a pré-hibridação com um novo tampão de HB aquecido a 65 ° c, pelo menos, 1 h.
   7. Pré-aqueça a sonda⁹ (para este caso foi uma sonda il34 , 1 ng/ml) a 65 ° c, pelo menos, 10 min. Em seguida, recicle o tampão HB no tubo original. Realize a hibridação com a sonda pré-aquecida a 65 ° c durante a noite.
3. Tratamento de anticorpos (dia II)
   1. Pré-aqueça o 50% formamide/2x citrato de sódio fisiológico mais Tween 20 (SSCT), 2x SSCT, 0,2 x SSCT a 65 ° c.
   2. Recicle a sonda no tubo original e guarde a sonda a-20 ° c.
   3. Lave os embriões separadamente com 50% de formamida/2x SSCT; 2x SSCT; 0.2 x SSCT, 3x 20 min ou 2x 30 min cada a 65 ° c.
   4. Lave os embriões com PBST 3x 5 min.
   5. Bloqueie as amostras com 600 μL de tampão de bloqueio (5% de soro bovino fetal filtrado (FBS) em PBST) durante 1 h na RT.
   6. Adicionar 400 μL de solução de anticorpos anti-Digoxigenina-HRP (1:1.000-1:2000 em tampão de bloqueio) e incubar os embriões a 4 ° c durante a noite. Se os sinais são fracos, use 1:500 diluição do anticorpo.
4. Coloração e anticorpo primário incubador (dia III)
   1. Retire o anticorpo; Lave os embriões com PBST, 6x 20 min em RT.
   2. Enxague a amostra com 30 μL de diluente de amplificação 1x Plus durante 5 min em RT.
   3. Descarte o diluente introduzindo a pipetagem; diluir a solução de Fluorophore Tyramide (cyanine 3 Plus reagente de amplificação (Cy3) ou o reagente de amplificação de cyanine 5 Plus (Cy5), para este caso Cy3 foi utilizado) 1:50 em 1x Plus diluente de amplificação para fazer a Fluorophore Tyramide solução de trabalho. Prepare 50-100 μL de solução de trabalho para cada amostra.
   4. Incubar a amostra no Fluorophore Tyramide solução de trabalho para 5-15 min no escuro em RT. Se os sinais são fracos, estender o tempo de incubação para 30 min.
   5. Pare a reacção alterando a solução de trabalho com PBST e examine os sinais.
   6. Lave os embriões com PBST 3x 10 min em RT.
   7. Incubar a amostra com anticorpo primário a 4 ° c durante a noite. Para este caso, use o anticorpo goat-anti-GFP como o anticorpo preliminar.
5. Coloração do anticorpo secundário (dia IV)
   1. Lave os embriões com PBST por 4x 30 min.
   2. Incubar os embriões com anticorpo secundário a 4 ° c durante a noite. Para este caso, use o anticorpo de Alexa 488-anti-cabra como o anticorpo secundário.
6. Tirar fotos (dia V)
   1. Lave os embriões com PBST 3x 10 min em RT.
   2. Armazene os embriões em 70% de glicerol em escuro a 4 ° c durante a noite ou-20 ° c por mais tempo.

3. imagens ao vivo

1. Seleção de amostra
   Nota: use a imagem ao vivo para observar diretamente se os macrófagos de TG (fabp10a: Il34; fabp10a: DSRED; MPEG1: GFP) peixes migrariam para o fígado a indução de Il-34 durante 3-3,5 DPF. Aqui a linha transgênica TG (Fabp10a-dsred) é usada para rotular a região hepática e torná-la visível, para facilitar a localização do fígado e para determinar se os macrófagos migram para o fígado. Antes da imagem latente, use um microscópio de fluorescência para selecionar os embriões positivos dobro de DsRed e de GFP.
2. Montagem dos peixes
   1. Use um banho do metal para aquecer 1 mL do agarose de derretimento baixo de 1% a acima de 90 ° c para derretê-la completamente.
   2. Depois que o baixo agarose de derretimento é refrigerado à temperatura de corpo, adicione 50 μL do tricaine de 0,2%, e misture uniformemente o tricaine com o agarose.
   3. Mova os embriões anestesiados para um pequeno prato montado com um slide de cobertura na parte inferior, retire a água circundante, solte lentamente o baixo agarose de fusão sobre os embriões, cuidadosamente definir a posição do peixe antes que o agarose é solidificada, manter a área do fígado perto de a corrediça da tampa na parte inferior do prato.
   4. Depois que o baixo agarose de derretimento solidified, cubra-o com cuidado com uma outra camada de agarose para reforçá-la.
   5. Coloc o prato na tabela confocal do portador do microscópio, cubra os peixes com a solução E2¹⁰ com tricaine e comece a imagem latente.
3. Operação do software do microscópio confocal
   1. Abra o software do preto 2,3 do Zen , instale a bancada viva da pilha na tabela do portador do microscópio.
   2. Clique em Localizar | Incubação | Temperatura para ajustar a temperatura a 29 ° c.
   3. Coloque o prato no centro da bancada de célula viva, cubra o peixe com a solução E2¹⁰ com tricaína.
   4. Clique no menu aquisição , selecione o modo de digitalização e os lasers necessários no menu configuração inteligente e, em seguida, selecione Z-Stack e Position.
   5. Clique no menu Designer de experimento , selecione habilitar experimento de vários blocos, no primeiro bloco, para localizar a amostra a baixa ampliação e, em seguida, alterne para a alta ampliação, deixe a área observada no centro do campo visual.
   6. Ajuste a posição e a informação da Z-pilha, selecione a intensidade apropriada do laser, as camadas da exploração e a velocidade da imagem latente.
   7. Crie um novo bloco e repita os passos acima. Depois de configurar todos os blocos, defina o número apropriado de loops e inicie a gravação (Figura 1).

As etapas envolvidas no protocolo de zebrafish são ilustradas na Figura 2. Em primeiro lugar, geramos o construto pBLK-fabp10a-il34-SV40 no qual il34 foi conduzido pelo promotor fabp10a (Figura 2). O construto foi microinjetado em embriões de zebrafish de fase TG (MPEG1: GFP) de uma célula que pode rotular macrófagos com embriões de GFP e WT que foram levantados para adultos para gerar linha estável transgênica (Figura 2). A expressão de il34 foi analisada pela hibridação in situ da fluorescência da montagem inteira (Figura 2 e Figura 3). Os macrófagos rotulados por GFP foram analisados por imunocoloração (Figura 2 e Figura 3). Nós usamos a imagem latente viva para observar diretamente se os macrófagos migrariam no fígado a indução il34 durante 3-3.5 DPF (Figura 2, Figura 4, filme suplementar 1 e filme suplementar 2) .

Figura 1: operação do software da imagem latente viva do microscópio confocal. Abra o software Zen black 2,3 , instale a bancada de célula viva na mesa do portador do microscópio e clique em Localizar (a) | Incubação | Temperatura (B) para ajustar a temperatura a 29 ° c. Coloque o prato no centro da bancada de célula viva, cubra o peixe com a solução E210 com tricaína. Depois de tudo isso, clique no menu aquisição (C), selecione o modo de digitalização necessário e os lasers no menu configuração inteligente (D) e, em seguida, selecione Z-Stack e Position (e). Por fim, clique no menu Designer de experimento (F), selecione a opção Habilitar experimento multibloco, no primeiro bloco, para localizar a amostra a baixa ampliação e, em seguida, alterne para a alta ampliação, deixe a área observada no centro do campo visual, definir a posição e Z-Stack (G e H) informações, selecione a intensidade do laser apropriado, as camadas de digitalização e velocidade de imagem. Crie um novo bloco e repita as etapas acima. Depois de configurar todos os blocos, defina o número apropriado de loops (I) e iniciar a gravação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: um fluxo de trabalho para investigar a função de uma quimiocina na migração de macrófago in vivo. Nós construímos um plasmídeo do superexpressão do tecido-específico (fígado) para sobre-expressão Il-34 e injetamos o plasmídeo em uns embriões transgênicas do peixe da fase da um-pilha cujos os macrófagos fossem etiquetados especificamente por uma proteína fluorescente (TG: (MPEG1: GFP )). Os embriões de WT injetados foram levantados para gerar uma linha transgênica estável. Nós usamos então a hibridação in situ fluorescente da montagem inteira e a imunocoloração para detectar o teste padrão da expressão de gene e o número ou a posição dos macrófagos dos embriões injetados transientes ou da linha estável embriões (4 DPF). Por fim, utilizou-se a imagem latente ao vivo confocal para observar diretamente o comportamento dos macrófagos no peixe transgênico estável (3-3,5 DPF) para estudar a função de IL-34 em macroages in vivo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: desejo fluorescente combinar com imunocoloração. Este número foi modificado de Jiang et al.11. Um total de 1,8 nL (30 NG/μL) da construção pBLK-fabp10a-il34-SV40 foi microinjetado em embriões de zebrafish de fase TG (MPEG1: GFP) de uma célula. (A) desejo de expressão de il34 (vermelho) e coloração de anticorpos de montagem inteira de expressão de GFP (verde) em 4 embriões de DPF (6x). O retrato inteiro do corpo do peixe é compo de duas imagens separadas tomadas por confocal e costuradas junto em Photoshop. Os Insets são a ampliação elevada (20x) das regiões encaixotadas correspondentes (áreas pontilhadas laranja). (B) análise quantitativa de números de células de macrófago no fígado de embriões injetados e construto (mostrados na área pontilhada branca) e na região da cauda (aproximadamente entre os 13 e 17 somite, mostrados entre duas linhas pontilhadas brancas). Os dados foram analisados pelo teste U de Mann Whitney, * * p < 0, 1 comparado ao controle. n = 5, 5 para o 4 DPF injetado e controle de peixes. Barras: 200 μm (linha branca); 50 μm (linha amarela). (C) desejo da expressão de il34 e do anticorpo da inteiro-montagem que mancha da expressão do GFP em 4 DPF linha estável embrião (6x). O retrato inteiro do corpo do peixe é compo de duas imagens separadas tomadas por confocal e costuradas junto em Photoshop. Os Insets são a ampliação elevada (20x) das regiões encaixotadas correspondentes (áreas pontilhadas laranja). (D) análise quantitativa de números de células de macrófago em TG (MPEG1: GFP) e TG (fabp10a: il34; MPEG1: GFP) embriões ' fígado (mostrado na área pontilhada branca) e região da cauda (aproximadamente entre o 13º e 17 somite, mostrada entre duas linhas brancas pontilhadas). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: a imagem latente viva confocal para observar diretamente o comportamento do macrófago no peixe transgênicas estável. Este número foi modificado de Jiang et al.11. Os micrographs da imagem latente viva mostram o processo de um macrófago (verde, etiquetado por setas brancas) que passam pelo fígado (vermelho) dentro de 28 minutos no peixe do controle (a) e no processo de um macrófago (verde, etiquetado por setas brancas) que migram no fígado (vermelho) dentro de 28 min em IL-34 sobreexpressando peixes (B). Barras de escala = 40 μm (linha branca). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar filme 1: imagens ao vivo mostrando o processo de macrófagos (verde, rotulado por setas brancas) migrando para o fígado (vermelho) dentro de 2 h em Il-34 sobreexpressar peixes. Barras de escala = 20 μm (linha branca). Este filme foi republicado a partir de Jiang et al.11. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Complementar filme 2: imagens ao vivo mostrando o processo de macrófagos (verde, rotulado por setas brancas) vagando ao redor do fígado (vermelho) dentro de 2 h em peixes de controle. Barras de escala = 20 μm (linha branca). Este filme foi republicado a partir de Jiang et al.11. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)

Os autores não têm nada a revelar.