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Artigo de método

Um modelo pré-clínico para avaliar a recuperação do cérebro após acidente vascular cerebral agudo em ratos

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DOI:

10.3791/60166

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6 de novembro de 2019

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1Beijing Yinfeng Dingcheng Biological Engineering Technology Ltd., 2Hulunbuir People's Hospital, 3Shandong Qilu Stem Cell Engineering Co. Ltd.

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O objetivo deste estudo é estabelecer e validar um modelo animal para pesquisa nos estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral testando infarto cerebral e função sensóriomotor após oclusão/refusão da artéria cerebral média (MCAO/R) após 1-90 dias em ratos.

Resumo

O objetivo deste estudo foi estabelecer e validar um modelo de isquemia cerebral animal nos estágios de recuperação e sequela. Um modelo de oclusão/refusão da artéria cerebral média (MCAO/R) em ratos machos sprague-dawley foi escolhido. Ao alterar o peso do rato (260-330 g), o tipo de parafuso de linha (2636/2838/3040/3043) e o tempo de infarto cerebral (2-3 h), uma pontuação maior de Longa, um volume maior de infarto e uma maior relação de sucesso do modelo foram rastreados usando a pontuação da Longa e manchas ttc. A condição ideal do modelo (300 g, 3040 parafuso de linha, 3 h tempo de infarto cerebral) foi adquirida e utilizada em um período de observação de 1-90 dias após a refusão através da avaliação das funções sensório-motoras e volume infarto. Nestas condições, o teste bilateral da assimetria teve uma diferença significativa de 1 a 90 dias, e o teste grid-walking teve uma diferença significativa de 1 a 60 dias; ambas as diferenças podem ser um teste funcional sensorimotor adequado. Assim, a condição mais adequada de um novo modelo de rato nos estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral foi encontrada: 300 g de ratos que se submeteram ao MCAO com um parafuso de linha 3040 para um infarto cerebral de 3 h e depois reperfundido. Os testes funcionais sensorimotores apropriados foram um teste bilateral de assimetria e um teste de caminhada em grade.

Introdução

A isquemia cerebral é dividida em três etapas com diferentes indicadores pós-AVC: o estágio agudo (dentro de 1 semana), a fase de recuperação (1 semana a 6 meses) e a fase sequelae (mais de 6 meses). Atualmente, a maioria dos estudos se concentra no estágio agudo da isquemia cerebral por causa de seu efeito significativo e modelos de pesquisa multi-relativos1,2,3. No entanto, os estágios de recuperação e sequelas da isquemia cerebral não podem ser ignorados devido à sua complicação a longo prazo das deficiências. Portanto, o objetivo deste estudo é explorar um modelo animal estável, confiável e relativamente simples para pesquisar os estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral.

Entre os muitos modelos experimentais de isquemia cerebral, usamos oclusão da artéria cerebral média (MCAO) via inserção de parafuso de fio na artéria cerebral média direita (MCA). Este modelo é semelhante ao acidente vascular cerebral humano, que pode produzir maiores volumes de infarto, resultar em muitos distúrbios comportamentais relacionados ao acidente vascular cerebral, e pode permitir a refusão de sangue (R), removendo o parafuso de linha4,5,6. MCAO/R também é considerado o modelo animal padrão-ouro da isquemiacerebral 7. Além disso, a gravidade da lesão cerebral depende do diâmetro e do comprimento de inserção do parafuso de linha, a duração da isquemia cerebral e o peso animal (ratos maiores têm cérebros maiores e vasos cerebrais mais grossos)8. Portanto, alterando o tipo de parafuso de linha, o tempo infarto e o peso do rato, um modelo adequado pode ser encontrado para os estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral em ratos MCAO/R. Para validar o modelo de rato, realizamos um estudo de 1 dia, 35 dias, 60 dias e 90 dias do modelo MCAO/R usando experimentos de coloração TTC e função sensóriomotor (um teste bilateral de assimetria, um teste de caminhada em grade, um teste de rotarod e um teste de corda de elevação).

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Protocolo

O procedimento e o uso de indivíduos animais foram aprovados pelo Instituto Nacional de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório. Este protocolo é ajustado especificamente para os testes de oclusão/refusão da artéria cerebral média (MCAO/R) e função sensóriomotora.

1. Design experimental e agrupamento

  1. Use um modelo mcao/r de rato para rastrear um método de modelo isquêmico cerebral de rato com lesão cerebral mais grave e maior relação de sucesso do modelo usando a pontuação de Longa e coloração TTC.
    1. Realize o experimento em ratos sprague-dawley machos pesando 260 a 330 g que têm 7 a 9 semanas de idade. O peso real do rato é de 275 ± 15 g para 275 g, 300 ± 10 g para 300 g, e 320 ± 10 g para 320 g.
    2. Use os seguintes sete agrupamentos (peso, tipo do parafuso da linha, tempo do infarto): grupo 1 com 15 ratos (275 g, 2636, 2 h); grupo 2 com 15 ratos (275 g, 2636, 3 h); grupo 3 com 15 ratos (275 g, 2838, 2 h); grupo 4 com 15 ratos (275 g, 2838, 3 h); grupo 5 com 13 ratos (300 g, 3040, 3 h); grupo 6 com 10 ratos (320 g, 3040, 3 h); grupo 7 com 13 ratos (300 g, 3043, 3 h).
  2. Estude o estado de recuperação cerebral por coloração TTC e use testes de função sensóriomotor adequados para indicar os déficits funcionais de longo prazo pelo teste bilateral de assimetria, teste de caminhada em grade, teste de rotarod e teste de corda de elevação após 1, 35, 60, 90 dias de MCAO/R.
    1. Use ratos sprague-dawley masculinos pesando 300 ± 10 g que são 8-9 semanas de idade.
    2. Use os seguintes cinco agrupamentos: um grupo de controle (normal) com 20 ratos; um grupo de 1 dia com 16 ratos; um grupo de 35 dias com 16 ratos; um grupo de 60 dias com 17 ratos; e um grupo de 90 dias com 19 ratos.
  3. Após a pontuação do Longa na etapa 1.1 ou testes funcionais sensóriomotores na etapa 1.2, anestesiar e decapitar todos os ratos para coloração TTC.

2. Estabelecimento de um modelo unilateral mcao/r em ratos9

NOTA: Durante a operação, use os microfóricos suavemente para evitar a quebra do vaso sanguíneo. Evite danos aos nervos e outros vasos sanguíneos no pescoço do rato quando o vaso está isolado. Devem ser tomados cuidados para apresentar técnica asséptica adequada para todos os procedimentos cirúrgicos de sobrevivência. A técnica ilustrada mais tarde no vídeo deve ser praticada através de todo o procedimento.

  1. Ao longo da cirurgia, manter a temperatura corporal dos ratos em 37,0 ± 0,5 °C em um termostato pequeno animal. Prepare quatro suturas de 6 cm 5-0.
  2. Defina a taxa de fluxo de oxigênio de uma pequena máquina de anestesia animal (com um dispositivo de tratamento de gás residual) em 0,4-0,6 L/min e a concentração de isoflurano seja de 5%. Coloque o rato na máquina de anestesia.
  3. Depois que o animal desmaiou, coloque o rato em uma mesa de fixação cirúrgica. Conecte a boca do rato à máscara da máquina de anestesia (a taxa de fluxo de oxigênio permanece inalterada; ajuste a concentração de isoflurano para ser 3%). Confirme que o animal entrou na anestesia profunda observando uma falta de tensão nas extremidades, reflexos da córnea e dor.
  4. Corrija seus membros para se deitar na mesa de operação com bandagens de papel (ou outras ferramentas).
  5. Retire o revestimento do pescoço com uma máquina de barbear elétrica e esterilizar com 75% de álcool (iodophor é melhor). Consertar a boca do rato com um gancho.
  6. Corte 2-3 cm ao longo da forma longitudinal central do pescoço com tesoura oftalmológico.
  7. Separe a artéria carótida comum. Separe o músculo subcutâneo com fórceps oftálmicos. Use um retrator caseiro para expor totalmente o campo de visão. Depois de separar o músculo anterior da traqueia com fórceps oftalmológicos, separe ao longo do tendão sternocleidomastoide direito até que a artéria carótida comum seja visível.
  8. Isolar a artéria carótida comum, a artéria carótida externa e a artéria carótida interna com fórceps oftalmológicos. Ligate a artéria carótida comum (nó duro), artéria carótida externa longe do coração (nó duro), e artéria carótida interna (nó solto) com suturas 5-0. Forre a artéria carótida externa perto do fim do coração com suturas 5-0.
  9. Insira um parafuso de linha. Corte uma pequena abertura na artéria carótida externa usando tesoura oftalmológico e insira suavemente um parafuso de fio. Ligate a sutura da artéria carótida externa que tem sido em nó solto e cortar a artéria carótida externa.
    1. Solte o nó solto da artéria carótida interna e continue inserindo o parafuso de fio até o início da artéria cerebral média (sutura marcada). Em seguida, cortar o parafuso de linha exposta.
  10. Após o tempo isquêmico é atingido (2-3 h), corrigir a fratura da artéria carótida externa com um microforceps, e gentilmente retirar o parafuso de linha com outro microforceps. Quando a extremidade dianteira do parafuso da linha é retirada completamente da artéria carótida interna, ligate a artéria carótida externa que foi alinhada com suturas 5-0, e retire então o parafuso da linha completamente.
  11. Solte a artéria carótida comum, e daub ~ 50.000 U de pó de sódio de penicilina na superfície da ferida para evitar a infecção. Sutura músculos subcutâneos e pele com 4 suturas.
  12. Dê ~ 0,2 mL de sosselo estéril para o rato por via oral usando uma seringa de 1 mL (injeção de SQ-PEN é melhor) para evitar a escassez de água pós-operatória depois de colocar o rato de volta para a gaiola.
  13. Escolha os animais após 24 horas de refusão de acordo com a pontuação10da Longa. Selecione animais com pontuação de Longa de 1 a 3 para a próxima coloração TTC no passo 1.1, e animais com pontuação de Longa de 2 a 3 para o estudo de 1, 35, 60, 90 dias no passo 1.2.
    NOTA: Pontuação de Longa10: 0 pontuação, sem déficit neurológico; 1 pontuação, falha em estender o foreclaw esquerdo; 2 pontuação, circulando para a esquerda; 3 pontuação, caindo para a esquerda; 4 pontuação, não pode andar espontaneamente e tem uma consciência deprimida.
  14. Analise a pontuação do Longa por ANOVA de sentido único. Os valores mostrados representam média ± S.D. P < 0,05 indicam diferença.

3. Mancha ttc

NOTA: O molde e a lâmina da fatia do cérebro de rato devem pre-ser refrigerados em um refrigerador de -20 °C antes do uso para impedir a adesão causada por uma grande diferença de temperatura. Durante a coloração, evite a adesão entre as fatias cerebrais e a placa de cultura, o que pode resultar em coloração insuficiente.

  1. Anestesie o rato por injeção intraperitoneal de hidrato de cloro de 400 mg/kg após a pontuação da Longa na etapa 1.1 ou testes funcionais sensóriomotores na etapa 1.2.
  2. Decapite o rato com tesoura cirúrgica ou com um aparato de decapitação de ratos. Retire o cérebro com tesoura cirúrgica e fórceps hemostáticos.
  3. Coloque o cérebro na geladeira em -20 °C por 30 min para facilitar o corte.
  4. Retire o cérebro da geladeira e coloque-o em molde pré-resfriado fatia do cérebro de rato. Corte o cérebro em seis seções consecutivas de 2 mm de espessura com uma lâmina pré-resfriada.
  5. Manchar as seções com 2% 5-triphenyl-2H-tetrazolium cloreto (TTC) em uma placa de cultura de 6 poços.
  6. Cultura as seções de 30 a 60 min a 37 °C em uma cama de agitação. Vire as seções a cada 10 min até que a área de isquemia cerebral e a área normal sejam claramente brancas e vermelhas.
  7. Forre as fatias do cérebro verticalmente, a fim da parte de trás para a frente do cérebro. Use uma régua para garantir que o comprimento total de cada linha é o mesmo. Tire fotos com câmera digital.
  8. Analise o volume do infarto.
    1. Pré-tratamento da foto com software photoshop
      1. Importe a foto usando photoshop CS6. 00:00-00:14
      2. Clique selecione para selecionar as fatias do cérebro, clique em Select | Inverso. 00:15-00:36
      3. Clique em primeiro plano para selecionar preto e clique OK. 00:37-00:42
      4. Pressione alt +excluir para preencher a cor de fundo, e CTRL +D para desmarcar. 00:43-00:46
      5. Clique no Arquivo | Economize para desktop. 00:47-01:08
    2. Pré-tratamento da foto com o software Image Pro Plus.
      1. Software Open Image Pro Plus 6.0 e importar a foto. 01:09-01:24
      2. Para modificação de defeitos, ajuste o brilho com a ferramenta de aprimoramento do contraste, para que o fundo seja preto. 01:25-01:37
      3. Use a ferramenta mediana no filtro para remover os destaques. 01:38-01:46
    3. Calcule a área do cérebro esquerda (normal) com o software Image Pro Plus
      1. Selecione a cor usando segmentação e ajuste o valor do H/S/I,de modo que as fatias do cérebro sejam separadas do fundo preto. 01:47-02:12
      2. Retorno à Contagem | Tamanho. 02:13-02:16
      3. Clique na Contagem | Divida objetos em eita para separar o cérebro da linha média. O software irá distinguir automaticamente as áreas do cérebro esquerdo e direito. 02:17-02:49
    4. Calcule a área cerebral do infarto certo com o software Image Pro Plus
      1. Implementar passo 3.8.1-3.8.2. 02:50-03:14
      2. Selecione contagem | Tamanho. 03:15-03:21
      3. Clique no Sorteio | Mesclar ferramenta objetos em Eit. Selecione manualmente a área isquêmica e clique em Contar para calcular a área isquêmica. 03:16-05:31
    5. Calcule a área do cérebro da saúde com o software Image Pro Plus
      1. Implementar passo 3.8.1-3.8.2. 05:32-06:44
      2. Selecione a cor usando segmentação e ajuste o valor do H/S/I,de modo que a parte normal das fatias do cérebro seja separada do fundo preto. 06:45-07:10
      3. Retorno à Contagem | Tamanho e clique na contagem para calcular esta área. 07:11-07:21
      4. Clique em Objetos Divididos em Eitir para separar o cérebro da linha média. O software irá distinguir automaticamente as áreas do cérebro esquerdo e direito. 07:22-08:08
  9. Calcule o volume do infarto (%) e infarto e diminuir o volume (%):

    Volume infarto (%) = [área do infarto direito/(2 x área do cérebro esquerdo)] x 100.
    Infarto e diminuir o volume (%) = [(área do cérebro esquerdo - área do cérebro de saúde direita) / (2 x área do cérebro esquerdo)] x 100.

    NOTA: O cérebro direito é a parte lesada. Os dados foram analisados por ANOVA univia. Os valores mostrados representam média ± S.D. P < 0,05 indicam diferença.

4. Avaliação da função sensório-motora

NOTA: Ratos (300 g, 3040 parafuso de linha, 3 h tempo infarto cerebral) com uma pontuação de Longa de 2-3 foram selecionados para realizar os experimentos de função sensório-motora de 1 a 90 dias. Mantenha a calma e não perturbe os animais durante este período de estudo. Os dados foram analisados pela ANOVA bisvial. Os valores mostrados representam média ± S.D. P < 0,05 indicam diferença.

  1. Teste bilateral de assimetria11
    1. Envolva fita de papel (5 cm de comprimento, 0,8 cm de largura) na parte saphenous de cada foreclaw de um rato três vezes com pressão igual.
    2. Para cada rato, registre o número de vezes que cada foreclaw é contatado e fita removida em 5 min com câmera, incluindo tempos de pata não afetados e tempos de pata afetados.
    3. Após 30 min, repita os passos 4.1.1 e 4.1.2 novamente.
    4. Calcule o valor médio do viés sensório-motor (%):
      Viés sensório-motor (%) = (tempos de pata não afetados - tempos de pata afetados)/(tempos de pata não afetados + tempos de pata afetados) x 100
  2. Teste de caminhada em grade
    1. Coloque o rato no centro de uma plataforma de superfície de grade elevada (área: 1 m2; altura: 90 cm) com aberturas de grade de 2,5 cm2.
    2. Empurre os quadris do rato levemente para incentivar o rato a atravessar a superfície da grade.
    3. Registre o número de falhas no pé feitas pelos membros não afetados (à direita) e afetados (à esquerda) e o número total de passos em 1 min com câmera.
    4. Calcule os tempos de erro:
      Tempos de erro (%) = membro (direito) afetado - membro afetado (esquerdo)/número total da etapa x 100.
      NOTA: O número total de etapas abaixo dos dados de 20 etapas foi removido.
  3. Teste Rotarod12,13
    1. Configure o aparelho de fadiga de barra rotativa de rato (diâmetro de 90 mm) de ratos usando o software de suporte a uma velocidade de 13 rpm durante um período de 5 min no computador.
    2. Comece os programas de computador e coloque o rato nos degraus rotarod ao mesmo tempo.
    3. Termine um julgamento se o rato cair do degrau ou continuar andando por 5 min e registre o tempo rotativo.
    4. Ter o descanso de rato por 30 min.
    5. Repita os passos 4.3.2-4.3.4 duas vezes mais e escolha o valor máximo para ser o último tempo rotativo.
  4. Levantamento do teste de corda14
    1. Coloque o instrumento de corda de elevação (70 cm de altura; a corda tem 0,2 cm de diâmetro e 40 cm de comprimento) sobre a mesa.
    2. Tenha o rato segurar a corda com seus membros anteriores e pendurar o rato.
    3. Registre o tempo de suspensão e calcule as pontuações.
      NOTA: Uma pontuação de 3: 0 a 2 na corda; Uma pontuação de 2: 3-4 s na corda; Uma pontuação de 1: 5 a 6 s na corda; Uma pontuação de 0: mais de 7 s na corda.

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Resultados

Usando o procedimento acima mencionado para um modelo MCAO/R com escore de Longa e coloração TTC, diferentes tratamentos de peso médio (275/300/320 g), tipos de parafuso (2636/2838/3040/3043; Tabela 1) e os tempos isquêmicos (2-3 h) e a refusão de 1 dia foram usados para selecionar para o modelo óptimo da isquemia do cérebro nos ratos. Parâmetros de modelo de 300 g de peso, 3040 parafuso de linha e 3 h de tempo de infarto cerebral foram os mais adequados para o maior infa...

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Discussão

Muitos modelos que estabelecem métodos e indicadores comportamentais que são bem utilizados na isquemia cerebral aguda podem não ter mudanças significativas nos estágios de recuperação e sequela da isquemia cerebral16,17. No entanto, o número de pacientes com isquêmico cerebral nos estágios de recuperação e sequela é o maior. É essencial selecionar um modelo animal adequado para os estágios de recuperação e sequela do acidente vascular cerebral da isquemia.

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (81603315, 81603316), Key R & D plano da província de Jiangxi na China (20171ACH80001), projetos de cooperação industrial e acadêmica em faculdades e universidades da província de Fujian em China (2018Y41010011).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microscópio anatômicoLeica (Alemanha)S8Instrumento operacional microscópico
LâminaGellette/Corte de seções cerebrais
Cama de agitação de temperatura constanteTaicang Fábrica de equipamentos experimentaisTHZ-CPara manter as seções cerebrais coradas uniformemente e a uma temperatura constante
Câmera digitalCanon700DPara tomar fotos de TTC coloração
Barbeador elétricoShanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd.3000 #Remoção de pêlos do pescoço de ratos
Fórceps HamostáticoXangai Medical device Co., Ltd.14 cmUsando para remoção do cérebro
Image Pro Plus SoftwareMedia Cybernetics Inc.6.0Analise o volume do infarto
IsofluranoRWD Ciências da Vida217170702Gás anestésico
MicrofórcepsShanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd.Microshear vascular de Microshear de micromanipulação de10 cm
Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd.10 cmMicromanipulação
vascular fórceps oftálmicoShanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd.Pphthalmic auxiliar da anatomia da pele e do músculo10 cm
Shanghai Jinzhong Medical Devices Co., Ltd.10 cmUsando-se para cortar a pele do molde da fatia do cérebro do rato
do pescoço Shanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd.400 gPara o corte padrão e uniforme do tecido cerebral
Aparelho de fadiga de barra rotativa de ratoAnhui Zhenghua Biological Instrument and Equipment Co., Ltd.ZH-300BPara testar a função sensório-motora,
a máquina de anestesia de pequenos animaisShanghai Yuyan Scientific Instruments Co., Ltd.ABM3000Uma máquina anestésica de gás
Termostato de animais pequenosBeijing Damida Technology Co., Ltd.DM.7-YLS-20APara manter a temperatura corporal do animal constante durante a operação
Tesoura cirúrgicaShanghai Medical device Co., Ltd.16 cmUsando-se para decapitar e remover o cérebro
SuturaShanghai Jinhuan Medical Devices Co., Ltd.4-0 / 5-0Uso para suturas de pele e músculo / Uso para ligaduras vasculares
Parafuso de roscaBeijing Cinontech Co., Ltd.2636/2838/3040/3043-A4Bloqueio da artéria cerebral média em ratos
5-trifenil-2H-cloreto de tetrazólio (TTC)SigmaLOT#BCBP3272VReagente de coloração de seção cerebral
Tesoura de

Referências

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Reimpressões e permissões

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