Aqui, nós apresentamos um protocolo para a coleção de espectros confocal de Raman dos indivíduos humanos em estudos clínicos combinados com as aproximações quimiométricas para a remoção espectral do outlier e a extração subseqüente de características chaves.
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Artigo de método
Resolvendo água, proteínas e lipídeos de in vivo confocal Raman Spectra de stratum corneum através de uma abordagem quimiométrica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O desenvolvimento deste método espectroscópico Raman confocal in vivo possibilita a mensuração direta de água, proteínas e lipídios com resolução de profundidade em indivíduos humanos. Esta informação é muito importante para doenças relacionadas com a pele e caracterizar o desempenho do produto de cuidados da pele. Este protocolo ilustra um método para a coleção confocal dos espectros de Raman e a análise subseqüente do conjunto de dados espectral que aproveita o chemometrics. O objetivo deste método é estabelecer um protocolo padrão para a coleta de dados e fornecer orientações gerais para a análise de dados. O pré-processamento (por exemplo, remoção de espectros de outlier) é um passo crítico ao processar grandes conjuntos de dados de estudos clínicos. Como exemplo, fornecemos orientação com base no conhecimento prévio de um conjunto de dados para identificar os tipos de outliers e desenvolver estratégias específicas para removê-los. Uma análise de componentes principais é realizada e os espectros de carga são comparados com os espectros de materiais de referência para selecionar o número de peças usadas na análise de resolução de curva multivariada (MCR) final. Essa abordagem é bem-sucedida para extrair informações significativas de um grande conjunto de dados espectral.
Introdução
Em estudos clínicos, a Espectroscopia Raman confocal in vivo demonstrou sua habilidade única para determinar a espessura do estrato córneo e o teor de água1,2,3,4e rastrear a penetração de materiais ativos aplicados topicamente na pele5,6. Como uma aproximação não invasora, a espectroscopia confocal de Raman detecta sinais moleculars baseados em modos vibracional. Assim, a rotulagem não é necessária7. A Espectroscopia Raman confocal in vivo fornece informações químicas com resolução de profundidade com base na natureza Confocal da técnica. Esta informação dependente da profundidade é muito útil em estudar os efeitos de produtos do cuidado de pele4,8, envelhecendo9,10, mudançassazonais3, assim como doenças da função da barreira da pele, como a dermatite atópica11,12. Há muita informação na região de alta frequência da espectroscopia confocal Raman (2500 – 4000 cm-1), onde a água produz picos distintos na região entre 3250 – 3550 cm-1. No entanto, os picos Raman de proteínas e lipídios, que são centralizados entre aproximadamente 2800 – 3000 cm-1, se sobrepõem uns aos outros porque os sinais são produzidos principalmente a partir de metileno (-CH2-) e metil (-CH3) grupos13 . Esta informação sobreposta apresenta um desafio técnico ao obter quantidades relativas de espécies moleculares individuais. O encaixe máximo14,15 e a posição de pico seletivo12,16 aproximações foram usadas para resolver este desafio. Entretanto, é difícil para estes únicos métodos Peak-based extrair a informação componente pura porque os picos Raman múltiplos do mesmo componente mudam simultaneamente17. Em nossa recente publicação18, uma abordagem MCR foi proposta para elucidar a informação do componente puro. Usando esta aproximação, três componentes (água, proteínas, e lipídios) foram extraídos de um grande conjunto de dados espectroscópicos confocal Raman in vivo.
A execução de grandes estudos clínicos pode ser exigente em indivíduos que coletam dados espectroscópicos in vivo. Em alguns casos, a aquisição espectral pode exigir o equipamento operando-se por muitas horas em um dia e o estudo pode estender até semanas ou meses. Nessas condições, os dados espectroscópicos podem ser gerados por operadores de equipamentos que não possuem expertise técnica para identificar, excluir e corrigir todas as fontes de artefatos espectroscópicos. O conjunto de dados resultante pode conter uma pequena fração de outliers espectroscópicos que precisam ser identificados e excluídos dos dados antes da análise. Este papel ilustra em detalhe um processo de análise quimiométrico para "limpar" um conjunto de dados clínico Raman antes de analisar os dados com MCR. Para remover com sucesso os outliers, os tipos de outliers e a causa potencial para a geração dos espectros do outlier precisam de ser identificados. Em seguida, uma abordagem específica pode ser desenvolvida para remover os outliers direcionados. Isso requer o conhecimento prévio do conjunto de dados, incluindo um entendimento detalhado sobre o processo de geração e o design do estudo. Neste conjunto de dados, a maioria dos Outliers são baixos espectros de sinal para ruído e originam-se principalmente de 1) espectros recolhidos acima da superfície da pele (6.208 fora de 30.862), e 2) forte contribuição para o espectro da luz fluorescente do quarto (67 de 30.862). Espectros recolhidos acima da superfície da pele produzem uma fraca resposta Raman, como o ponto focal laser se aproxima da superfície da pele e é principalmente na janela do instrumento abaixo da pele. Os espectros com uma contribuição forte da luz fluorescente do quarto são gerados devido ao erro do operador do instrumento ou ao movimento do assunto, que produz uma circunstância onde a janela Confocal da coleção de Raman não seja coberta inteiramente pelo local do corpo do assunto. Embora esses tipos de artefatos espectrais possam ser identificados e remediados durante a aquisição espectral por um especialista espectroscópico no momento da aquisição de dados, os operadores de instrumentos treinados utilizados neste estudo foram instruídos a coletar todos os dados, a menos que um a falha catastrófica foi observada. A tarefa de identificar e excluir outliers é incorporada ao protocolo de análise de dados. O protocolo apresentado é desenvolvido para resolver esse desafio. Para endereçar os baixos espectros do sinal-à-ruído acima da superfície da pele, a posição da superfície da pele precisa de ser determinada primeiramente para permitir a remoção dos espectros recolhidos acima da superfície da pele. A localização da superfície da pele é definida como a profundidade onde o ponto focal do laser Raman é metade na pele e metade da pele, como ilustrado na Figura 1 suplementar. Após a remoção de baixos espectros de sinal para ruído, uma análise de componentes principais (PCA) é implementada para extrair o fator dominado por picos de luz de sala fluorescente. Esses Outliers são removidos com base no valor da Pontuação do fator correspondente.
Este protocolo fornece informações detalhadas sobre como seis componentes principais são determinados no processo MCR. Isso é feito por meio de uma análise de PCA seguida pela comparação da forma espectral entre as cargas para os modelos gerados com um número diferente de componentes principais. O processo experimental para coleta de dados de materiais de referência, bem como os sujeitos humanos também é explicado detalhadamente.
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de revisão institucional do hospital infantil de Pequim, em conformidade com as diretrizes éticas da declaração 1975 de Helsínquia. Foi conduzido de acordo com as diretrizes da ICH para boa prática clínica. O estudo foi realizado de maio a julho de 2015.
1. coleção de espectros Raman confocais in vivo de indivíduos humanos com dermatite atópica
- Inclua os sujeitos em conformidade com os seguintes critérios.
- Inclua assuntos entre as idades de 4 – 18.
- Incluir indivíduos com dermatite atópica leve a moderada (escore de 2 ou 3 de acordo com a avaliação global do médico) com sintomas de doença ativa em 5% – 30% da superfície corporal, com pelo menos duas lesões nos braços.
- Incluir indivíduos que estão em boa saúde, excluindo os sintomas diretamente relacionados com a doença de AD.
- Inclua assuntos que forneçam consentimento informado por escrito.
- Inclua assuntos que tenham um valor de ângulo de topologia individual (ITA) superior a 40 no local de teste.
- Exclua assuntos que atendam a qualquer um dos seguintes critérios.
- Excluir indivíduos que estejam participando ou tenham participado anteriormente de um estudo clínico em qualquer instalação de teste nas últimas 4 semanas.
- Exclua indivíduos com câncer ou que tenham sido diagnosticados ou tratados para câncer dentro de 5 anos antes do estudo.
- Excluir indivíduos diabéticos.
- Exclua os indivíduos que têm uma doença imunológica ou infecciosa que poderia colocar o sujeito em risco ou interferir com a precisão dos resultados do estudo (ou seja, hepatite, tuberculose, HIV, AIDS, lúpus, ou artrite reumatóide).
- Exclua os indivíduos que têm condições de pele que podem interferir com medidas instrumentais ou impedirão a avaliação clara da pele somente à dermatite atópica. Exemplos incluem pele extremamente seca, pele danificada, cortes, arranhões, queimaduras solares, marcas de nascença, tatuagens, cicatrizes extensas, erupções cutâneas, crescimento excessivo de pêlos, ou acne.
- Exclua indivíduos que usam drogas imunossupressoras orais, antibióticos ou outras terapias sistêmicas no mês passado, exceto para tranquilizantes menores.
- Excluir sujeitos com qualquer outra condição médica que, na opinião do investigador, os impeça de participar do estudo.
- Exclua indivíduos com maior pigmentação na área de teste.
- Rotule a área da lesão do participante do estudo da dermatite atópica e marque com uma área de 3 cm x 4 cm em ou perto do local da lesão, como mostrado na Figura 1a.
- Rotule a área não-lesão com o mesmo marcador no local do corpo de contrapartida (por exemplo, antebraço esquerdo versus antebraço direito), como mostrado na Figura 1B.
- Coloque o local do corpo marcado em contato próximo com a janela do instrumento Raman confocal in vivo, como mostrado na Figura 2A e Figura 2B. Cubra a janela inteira para evitar o impacto da luz do quarto no local do corpo.
- Realize a coleta de dados Raman.
Nota: o instrumento tem uma resolução espectral de 2 cm-1 e 50x microscópio objetivo (NA = 0,9 imersão a óleo), usando um laser de 671 nm com uma potência de 17 MW. O comprimento de onda é calibrado usando o espectro de uma lâmpada interna do néon-argônio. A calibração da intensidade é feita medindo o espectro de um padrão de calibração de vidro do NIST (Instituto Nacional das normas).- Mova o foco até que um espectro como ilustrado na Figura 2C é observado, em seguida, mova o foco para longe da superfície da pele 10 μm.
- Inicie a coleta de dados para 26 etapas com um tamanho de etapa de 2 μm na região de 2.510 cm-1– 4.000 cm-1 Frequency. Use um tempo de exposição de 1 s e medir oito repetições para cada área duradoura ~ 10 – 15 min total.
2. coleção de espectros confocais Raman a partir de materiais de referência
- Coloc os materiais de referência, os componentes principais no córneo19do estrato da pele humana, na janela do instrumento confocal de Raman (veja tabela dos materiais: albumina de soro bovina (BSA), água deionizada (água do di), ceramide, colesterol, livre ácido graxo e esqualeno).
- Colete os espectros Raman dos materiais de referência consecutivamente do exterior do material para o centro de material usando os mesmos parâmetros de coleta descritos acima.
- Integre a área cada espectro Raman entre o intervalo de 2510 – 4000 cm-1 e identifique os três principais pontos de valor máximo nessas 26 medições. Média dos espectros Raman desses três pontos para obter os espectros de material de referência final.
3. remoção dos espectros de outlier através da análise quimiométrica
- Determine a superfície da pele e remova os espectros fora da pele.
- Altere a extensão de arquivo de '. Ric ' para '. Mat ' e carregue o arquivo. Mat na plataforma de software MATLAB.
- Corrija a linha de base usando a linha de base (quadrados ponderados automáticos) clicando com o botão direito do mouse no conjunto de dados importado em Analyze | Outras ferramentas | Pré-processamento no software PLS_Toolbox com configuração padrão.
- Somar os valores entre 2910 – 2965 cm-1 para obter os valores de intensidade cada espectro Raman a partir da medida de 26 etapas consecutivas, como mostrado na Figura 3a através da função sum no MATLAB.
- Interpolar o valor de deslocamento do instrumento (valor no eixo X na Figura 3B) de 26 – 260 usando a função linspace no MATLAB.
- Interpolar o valor de intensidade de 26 a 260 usando o método spline no MATLAB, aproveitando os valores de posição 260 recém-gerados.
- Use as funções documentos e polyval do MATLAB para obter o novo conjunto de valores de intensidade com 260 pontos. Primeiro, use os valores de posição e intensidade de 260 como entradas X e Y para a função documentos , respectivamente. Defina o valor de grau como 20. Em seguida, use os coeficientes de saída e os valores de posição estendida 260 como a entrada para polyval para obter os valores de intensidade 260 final.
- Use as funções Max e min do MATLAB para identificar os pontos máximos e mínimos dos valores de intensidade de 260 recém-interpolados.
- Calcule o valor de intensidade média dividindo a soma do valor de intensidade máxima e mínima por dois.
- Identifique o valor de intensidade dos valores de intensidade de 260 (calculado a partir da etapa 3.1.6) que está mais próximo do valor de intensidade média e defina seu valor de posição correspondente como superfície da pele. Defina esse valor de posição como o ponto zero no eixo X, conforme ilustrado na Figura 3B.
- Altere todos os outros valores de posição de acordo com o ponto zero e o tamanho de etapa 2 μm conhecido.
- Remova todos os espectros recolhidos acima da superfície da pele de acordo com o seu valor de posição.
- Importe o restante dos dados para PLS_Toolbox para criar um DataSet e renomeá-lo como "RamanData. Mat".
- Remova os espectros do outlier com o efeito da luz da sala.
- Carregue o conjunto de dados de espectros Raman (RamanData. Mat) após a remoção dos espectros fora da pele e implemente a análise de PCA.
- Carregue o conjunto de dados no software PLS_Toolbox a plataforma MATLAB e clique com o botão direito do mouse no conjunto de dados para escolher Analyze | O PCA.
- Selecione Normalize como a abordagem de pré-processamento e escolha None para a validação cruzada.
- Use os três componentes para a análise de decomposição da PCA, como mostrado na Figura 2 suplementar.
- Retire a tampa da janela de coleta do instrumento Raman in vivo e colete os espectros de luz da sala na região de alta frequência usando os mesmos parâmetros usados para a coleta de dados de materiais de referência.
- Identifique o fator de efeito de luz da sala por meio da comparação com os espectros de fundo da luz do ambiente, conforme mostrado na Figura 3.
- Remova os espectros com um valor de pontuação correspondente significativamente maior do que o normal (mais de 99,8% dos valores de escore de todo o conjunto de dados, que é 0,16 neste estudo).
4. seleção do número de componentes na análise de decomposição de MCR
- Corrija a linha de base dos espectros Raman utilizando a mesma abordagem descrita acima (secção 3.1.2).
- Realize a análise de PCA no conjunto de dados pré-processado, conforme descrito acima (seção 3,2), exceto para selecionar "PQN" – "centro médio" em vez de "normalizar", e plotar os autovalores na escala logarítmica, juntamente com o número de componentes (20) como o número padrão em a análise de decomposição clicando no botão escolher componentes e selecione log (autovalores) como o valor Y. Escolha três a oito como o número dos componentes usados para a análise de MCR.
- Execute a análise de MCR.
- Carregue o conjunto de dados no software MCR_main20 através do botão de seleção de
- Escolha o número de componentes (três a oito) clicando na determinação do número do botão de componentes .
- Clique no botão puro na guia estimativa inicial , selecione concentração a direção da guia Seleção de variáveis e clique no botão fazer .
- Clique no botão OK e, em seguida, o botão continuar para a página seguinte.
- Clique em continuar na próxima página e, em seguida, selecione fnnls e 6 a implementação e Nr. de espécies com guias de perfis de não-negatividade , respectivamente. Clique no botão continuar .
- Escolha os mesmos parâmetros que a seção de "a" para esta página e clique em continuar.
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Resultados
Neste estudo clínico, os espectros de Raman confocal in vivo foram coletados de 28 indivíduos de 4 a 18 anos de idade. Um total de 30.862 espectros Raman foram coletados com o protocolo de coleta de dados mencionado acima. Este grande conjunto de dados espectral contém 20% de outliers espectrais, como mostrado na Figura 4A. Os baixos espectros do outlier do sinal-à-ruído foram removidos após a determinação da superfície da pele, seguido pelo PCA para identificar os espectros com caracter...
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Discussão
Durante a coleta de dados, conforme descrito na seção 2 e 3 do protocolo, cada perfil de profundidade foi coletado em uma área com contato entre a janela do instrumento e a pele, encontrando as áreas mais escuras das imagens microscópicas destacadas nos círculos vermelhos em Figura 2C. Uma vez que estas áreas foram localizadas, era crítico para iniciar o perfil de profundidade acima da superfície da pele para determinar com precisão a localização da superfície da pele para ...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem grandemente o apoio financeiro do departamento de cuidados analíticos e de limpeza pessoal da função corporativa. Queremos expressar nossa gratidão aos diretores analíticos associados MS. Jasmine Wang e Dr. Robb Gardner por sua orientação e apoio e Sra. li Yang para sua ajuda na coleta de dados.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | ||
| Colesterol 3-sulfato de sódio | Sigma-Aldrich | ||
| D-Eritro-Dihidroesfingosina | Sigma-Aldrich | ||
| DI água | purificada com Milipore (18,2 M e ômega;) | ||
| Gen2-SCA analisador de pele | River Diagnostics, Roterdã, Holanda | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoil-D-eritro-esfingosina | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroil-D-eritro-esfinganina(ceramida) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Ácido oleico | Sigma-Aldrich | ||
| Ácido palmitoleico | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox versão 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Roterdã, Holanda | versão 3.2 | |
| Esqualeno | Sigma-Aldrich | ||
| Ácido esteárico | Sigma-Aldrich |
Referências
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Reimpressões e permissões
