Um protocolo da microdissecção da captação do laser que rende o RNA da alta qualidade dos ossos frescos-congelados do rato

Os tecidos são compo de tipos heterogêneos e espacialmente distribuídos da pilha. Diferentes tipos de células em um determinado tecido podem responder de forma diferente ao mesmo sinal. Portanto, é essencial ser capaz de isolar populações de células específicas para a avaliação do papel de diferentes tipos de células em condições fisiológicas e patológicas. A microdissecção de captura a laser (LCM) oferece um método relativamente rápido e preciso para isolar e remover células especificadas de tecidos complexos¹. Os sistemas de LCM usam o poder de um feixe de laser para separar as pilhas do interesse das seções histológicas do tecido sem a necessidade para o processamento enzimático ou o crescimento na cultura. Isto significa que as pilhas estão em seu habitat natural do tecido, e que a arquitetura do tecido que inclui a relação Spatial entre pilhas diferentes é mantida. A morfologia das células capturadas e do tecido residual é bem preservada, e vários componentes teciduais podem ser amostrados sequencialmente a partir do mesmo slide. As células isoladas podem então ser usadas para análise subsequente de seu conteúdo de RNA, DNA, proteína ou metabólito^2,3.

Para analisar a expressão gênica em diferentes populações celulares, ou após diferentes tratamentos, é necessário obter mRNAs de qualidade e quantidade suficientes para a análise subsequente^4,5. Em contraste com o DNA, as RNAs são mais sensíveis à fixação e o uso de tecido congelado é recomendado quando o objetivo é estudar o RNA. Desde que os mRNAs estão degradados rapidamente por ribonucleases onipresente (RNase), as condições RNase-livres estritas durante a manipulação e a preparação do espécime e evitando o armazenamento das amostras na temperatura ambiente são exigidas. Além, as técnicas rápidas sem nenhumas etapas aquosas prolongadas da fase são cruciais impedir a degradação⁶do RNA. O rendimento e a integridade do RNA também podem ser afetados pelo processo de LCM e o^{sistema de}LCM utilizado^7,8. Atualmente, quatro sistemas de LCM com diferentes princípios operacionais estão disponíveis². O método da extração do RNA pode igualmente ser importante, desde que os jogos diferentes da isolação do RNA foram testados com diferenças significativas na quantidade e na qualidade do RNA^7,8.

Qualquer método de preparo tecidual requer encontrar um equilíbrio entre a obtenção de bom contraste morfológico e a manutenção da integridade do RNA para análises adicionais. Para preparar seções congeladas do osso, um filme adesivo foi desenvolvido e melhorado continuamente⁹. As seções do osso são cortadas e manchadas diretamente na película adesiva. Esta película adesiva é aplicável a muitos tipos de mancha, e pode ser empregada para isolar as pilhas do interesse dos Cryosections do osso usando LCM^{9,10,11,12,13,} a ¹⁴. Todos os passos, incluindo a remoção cirúrgica, incorporação, congelamento, corte e coloração pode ser concluída dentro de menos de uma hora. É importante ressaltar que células como osteoblastos, células de forro ósseo e osteoclastos podem ser claramente identificadas^{9,10,11,12,13,14.} Este método tem a vantagem de ser rápido e simples. Um método alternativo para a geração de criossecções ósseas é o uso do sistema de transferência de fita¹⁵. No entanto, a última técnica é mais demorada e requer instrumentação adicional, uma vez que as secções têm de ser transferidas da fita adesiva para lâminas de membrana pré-revestidas por ultravioleta (UV) cross-linking. Embora o sistema de transferência de fita tenha sido acoplado com êxito com o LCM^16,17,18,19, deve-se notar que o revestimento reticulado pode criar um padrão de plano de fundo que pode interferir com a identificação do tipo celular²⁰.

Tipicamente, apenas pequenas quantidades de RNA são extraídas de células microdissecadas, e a qualidade e a quantidade de RNA são frequentemente avaliadas por eletroforese microcapilar²¹. Um programa de computador é usado para atribuir um índice da qualidade aos extratos do RNA chamados número da integridade do RNA (RIN). Um valor de RIN de 1,0 indica o RNA completamente degradado, visto que um valor de 10,0 sugere que o RNA esteja inteiramente intacto²². Geralmente, os índices sobre 5 são considerados suficientes para estudos do RNA. Os testes padrões da expressão de gene nas amostras com um valor de RIN de 5.0 − 10.0 foram relatados para correlacionar bem uns com os outros²³. Embora a sensibilidade deste método seja elevada, uma vez que tão pouco quanto 50 PG/μL do RNA total pode ser detectado, pode ser muito difícil obter uma avaliação da qualidade se a concentração do RNA na amostra for muito baixa. Conseqüentemente, a fim avaliar a qualidade do RNA, a seção do tecido que permanece após o LCM é usada frequentemente para extrair o RNA, introduzindo com pipting o amortecedor na corrediça²⁴.

Embora o LCM seja usado extensivamente em tecidos congelados diferentes, os valores de RIN de RNAs extraídos são relatados raramente. Além disso, não há estudos comparativos para esclarecer o método mais adequado para estudar RNA em ossos do rato. No presente estudo, foram utilizados cortes congelados de fêmures de camundongo adulto para otimizar a preparação da amostra, o protocolo de LCM e a extração de RNA para obtenção de RNAs de alta qualidade. O presente protocolo foi otimizado especialmente para o sistema de LCM que utiliza a gravidade para coleta de amostras.

O tecido ósseo de camundongos foi usado em estrita conformidade com as diretrizes vigentes para o cuidado dos animais e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais.

1. animais e congelamento de incorporação

1. Animais da casa em condições de temperatura ambiente constante (RT; 24 ° c) e um ciclo de 12 h de luz/12 h escuro com acesso gratuito à comida e água.
   Nota: os tecidos ósseos deste estudo foram obtidos de camundongos machos selvagens de 3 meses, tipo C57Bl/6.
2. Na necropsia, exsanguinar camundongos da veia cava abdominal anestesia geral (cetamina/xilazina, 100/6 mg/kg intraperitoneal).
   Nota: A fim evitar a degradação do RNA, use instrumentos e materiais RNase-livres, luvas do desgaste e trabalhe rapidamente evitando o armazenamento das amostras no RT durante todo o experimento inteiro.
3. Remova os fêmures inteiros ràpida, limpe-os dos tecidos macios circunvizinhos usando o bisturi e as toalhas de papel. Derrame o composto ideal da temperatura do corte (OCT) no molde de incorporação, e põr o fémur na parte inferior do molde de incorporação. Snap-congelar as amostras em nitrogênio líquido. OCT é transparente em RT e branco quando congelado.
4. Uma vez que inteiramente congelado, enrole as amostras na folha e transfira-as no gelo seco a-80 ° c. Armazene amostras em-80 ° c até o processamento adicional.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

2. preparação da seção

1. Ajuste a temperatura no criostat a-19 ° c e do suporte do bloco a-17 ° c. Limpe o interior do criostat usando 70% de etanol. Coloque a lâmina descartável para tecidos duros, as lâminas de vidro e uma ferramenta de encaixe no criostat para esfriar. Mantenha-os dentro do criostat para a duração do corte.
2. Transfira o bloco de tecido congelado em gelo seco para o criostato e deixe-o equilibrar por pelo menos 10 min.
   Nota: Evite descongelamento repetitivo e ciclagem frequente de um bloco de-80 ° c a-19 ° c para criseccionamento.
3. Pressione a parte inferior do molde de incorporação para empurrar o bloco de OCT fora do molde. Aplique o suficiente OCT médio ao suporte do bloco para aderir o bloco a ele. Aguarde até que o meio OCT esteja totalmente congelado.
4. Coloque o suporte do bloco no suporte do objeto e aperte-o no lugar. Ajuste a posição da lâmina e apare o bloco usando incrementos de corte de 15 μm para remover a OCT cobrindo a amostra. Se a amostra foi cortada mais cedo e a superfície expor ao ar, descarte as primeiras 2 − 3 seções do tecido do bloco.
5. Ajuste o criostat para gerar seções de 8 μm e corte 2 − 3 criosecções que serão descartadas (os primeiros serão tipicamente mais grossos que 8 μm). Coloque a película adesiva no bloco e utilize uma ferramenta de encaixe para aderir ao bloco. Faça o corte lentamente e em uma velocidade constante segurando a seção pelo filme.
6. Coloque o filme (amostra virada para cima) imediatamente em uma corrediça de vidro pré-arrefecida (no criobar dentro do criostat) para evitar a descongelar da amostra. Use a fita para fixar a película à corrediça de vidro para uma mancha mais fácil. Prossiga imediatamente com o protocolo de coloração.

3. protocolo de coloração rápida

1. Prepare 40 mL das seguintes soluções em tubos de 50 mL e coloque-os no gelo: 95% de etanol, água sem RNase, 100% de etanol, 100% de etanol e 100% de xileno. Realize todas as etapas no gelo (exceto a coloração). Para cada dia experimental, Prepare todos os reagentes aquosos frescos com água RNase-livre.
   Atenção: Trabalhe no capô para evitar a intoxicação por xileno.
2. Incubar seções para 30 s em 95% etanol, em seguida, mergulhar seções 30 s em água RNase livre para remover OCT com cuidado e completamente que podem interferir com o LCM e aplicações a jusante.
3. Dispensar 50 μL de mancha de seção congelada comercial de LCM (tabela de materiais) na seção, incubar por 10 s no RT e drená-la coloc a borda da corrediça no papel de tecido absorvente. Remova o excesso de manchas enxaguando 30 s em 100% de etanol.
4. Mergulhe os cortes ósseos em um segundo tubo com 100% de etanol por 30 s e transfira-os para 100% de xileno por 30 s.
5. Põr a película adesiva (a amostra que enfrenta acima) na corrediça de vidro seca como um apoio. Tome cuidado para que o filme não é impactado e colocado tão plana quanto possível. Não permita que a amostra seque completamente.
6. Coloque uma corrediça do frame da membrana do animal de estimação nela. Em breve Pressione um dedo enluvado na membrana para anexá-lo ao filme. A amostra é então imprensada entre a membrana e a película adesiva. O filme adesivo não deve ser dobrado ou enrugado e não deve haver bolhas de ar entre o filme e a membrana. Prossiga imediatamente com o LCM.

4. microdissecção da captação do laser

1. Limpe o estágio e o suporte do tampão do RNase usando o solvente de superfície (tabela dos materiais). Coloque o slide e as tampas no porta-lâmina e no suporte da tampa, respectivamente.
2. Ajuste o foco e adquira a visão geral do slide com o objetivo 1.25 x. Mude para o objetivo de 40x e ajuste o foco. Escolha a área de interesse usando a visão geral do slide. Ajuste os parâmetros do laser como segue: abertura, 7; poder do laser, 60; velocidade, 5; freqüência de pulso, 201; contrapeso da amostra, 20. Otimize esses parâmetros para cada objetivo.
3. Se o laser não conseguir cortar a amostra, aumente a potência do laser. Alternativamente, o laser pode ser aplicado mais de uma vez. Além disso, inspecione o alvo para manchas de cortes incompletos e redesenhada a linha nesses pontos usando a opção mover e recortar . Guarde as definições do laser para a dissecção dos diapositivos subsequentes.
4. Selecione osteoblastos, osteócitos e células do forro ósseo no osso femoral distal esponjoso ou cortical com base em critérios morfológicos. Desenhe uma linha para o caminho do laser mais longe das células alvo para minimizar os danos causados pelo laser UV. Realize todas as microdissecções em menos de 1 h após a coloração.
5. Colete cada tipo de célula em uma tampa separada de um tubo de 0,5 mL.
   Nota: A captura a seco em vez da recuperação líquida pode evitar a degradação do RNA. Além, os volumes muito pequenos do amortecedor contidos na tampa do tubo do microcentrifugador podem evaporar ou cristalizar (dependendo de sua composição) durante o LCM.
6. Confirme o sucesso da captação pela observação da tampa do tubo da coleção após o LCM onde aplicável. Proceder imediatamente com a extração do RNA.

5. extração de RNA

1. Dispensar 50 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol na tampa do tubo de recolha e lyse a amostra introduzindo a pipetagem para cima e para baixo na tampa durante 1 min. Gire o lisado e adicione 300 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol no tubo. Se várias tampas vão ser agrupadas, tome cuidado para que o volume total de buffer é como recomendado para o kit de extração de RNA (tabela de materiais).
   Atenção: o β-Mercaptoetanol deve ser adicionado para proteger o RNA da degradação, mas é considerado tóxico. Use roupas e luvas protetoras e trabalhe no capô.
2. Além disso, para cada slide Prepare um rotulado 1,5 mL tubo de microcentrífuga com 350 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol. Use as seções restantes após o LCM para extrair o RNA. Separe cuidadosamente o filme da membrana e lyse a amostra, introduzindo lentamente o tampão de lise na secção várias vezes.
   Nota: A quantidade total de tampão de Lise deve ser 350 μL. Não use tudo de uma vez para a digestão como ele vai fluir fora do slide.
3. Coloque as amostras de lisado em gelo seco e guarde-as em-80 ° c.
   Observação: o protocolo pode ser pausado aqui.
4. Descongelar os lisados em RT. Transfira lisados de células colhidas de LCM de tubos de coleta para os tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Se mais de uma tampa foi usada para colher a amostra, a associação de vários lisados.
5. Extraia o RNA de acordo com as instruções do fabricante. Trate colunas com DNase I para remover o DNA genómico. RNA de elute com 14 μL de água RNase-livre, tendo por resultado um eluate de 12 μL. Armazene o RNA em-80 ° c.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

6. medida do rendimento e da integridade do RNA

1. Thaw RNA em gelo molhado. Meça o rendimento e a integridade do RNA isolado usando a electroforese microcapilar. Carregue o RNA total (1 μL por a amostra) em um chip (tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.

Um protocolo de LCM foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso de femurs do rato. No protocolo otimizado, as secções de osso congelado de 8 μm de espessura foram cortadas numa película adesiva e manchadas utilizando um protocolo rápido para uma mancha de secção congelada comercial de LCM. A amostra foi imprensada entre a membrana PET e a película adesiva. As células ósseas do rato foram microdissecadas utilizando um sistema de LCM que utiliza a gravidade para a recolha de amostras. Um método de extração de RNA baseado em coluna foi usado para obter um RNA de alta qualidade de rendimento suficiente. O rendimento e a integridade do RNA isolado foram medidos por meio de eletroforese microcapilar (Figura 1).

A diferença na qualidade e na quantidade do RNA obtidas usando protocolos diferentes do lysis pode ser considerada no gel representativo e nos electropherograms. Quando a amostra foi lisada por pipetagem para cima e para baixo na tampa por 1 min, foi possível isolar aproximadamente 8,5 ng de RNA de 1 mm2 tecido ósseo microdissecado (seção de 8 μm de espessura). O valor de RIN foi 8,60 (Figura 2).

Alternativamente, o LCM foi executado usando um sistema de LCM que use o pulso de laser de-Focused, que catapulta o material na tampa de adesivo pendendo. A qualidade e a quantidade do RNA podem ser estimadas no gel representativo e nos electropherograms. Para os ossos frescos congelados, foi possível isolar aproximadamente 1,6 ng de RNA de 1 mm2 tecido ósseo microdissecado (seção de 8 μm de espessura). O valor de RIN foi 1 (Figura 3).

Figura 1: fluxograma do protocolo de microdissecção de captura a laser para ossos frescos e congelados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: gel representativo (parte superior) e eletroferogramas (parte inferior) de amostras do RNA. O LCM foi realizado por meio de um sistema de LCM que utiliza gravidade para coleta de amostras. Amostras de RNA foram recuperadas do tecido colhido por LCM (amostras 1, 3, 5, 7 e 9) e seções de controle correspondentes (amostras 2, 4, 6, 8 e 10, respectivamente). Uma amostra de RNA foi recuperada da seção de controle que foi manchada mas não foi usada para o LCM (amostra 11). Uma área total de 1 mm2 foi microdissecada, e diferentes protocolos de Lise foram utilizados. Foram adicionadas amostras de 1:350 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol no tubo. O tampão foi fechado com cuidado, e o tubo invertido. As células colhidas com LCM foram lisadas por vortexing 1 min, incubando em RT por 10 min e vortexing 1 min. amostra 3:350 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol foi adicionado no tubo de coleta, a tampa foi cuidadosamente fechada, e o tubo invertido. As células colhidas com LCM foram lisadas pela incubação de tubos de coleta de cabeça para baixo por 30 min na RT. amostra 5:50 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol foi adicionado na tampa do tubo de coleta e a amostra foi lisada por pipetagem para cima e para baixo na tampa por 1 min. O lisado foi centrifugado e 300 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol foi adicionado no tubo. A amostra 7:350 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol foi adicionada ao tubo. O tampão foi fechado com cuidado, e o tubo invertido. As células colhidas com LCM foram lisadas por vortexing e invertendo várias vezes. A amostra 9:50 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol foi adicionada na tampa do tubo de coleta, e a amostra foi lisada por incubação por 5 min na RT na tampa. O lisado foi centrifugado, e 300 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol foi adicionado ao tubo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: gel representativo (parte superior) e eletroferogramas (parte inferior) de amostras do RNA. O LCM foi realizado usando um sistema de LCM que usa o pulso de laser de-focalizado, que catapulta o material na tampa adesiva posicionada acima da seção. Amostras de RNA foram recuperadas do tecido colhido com LCM (amostras 5 e 6) e seção de controle correspondente (amostra 7). Uma amostra de RNA foi recuperada da seção de controle que foi manchada mas não foi usada para o LCM (amostra 8). Uma área total de 0,5 mm2 ou 1 mm2 foi microdissecada (amostras 5 e 6, respectivamente). 350 μL do tampão de Lise contendo β-Mercaptoetanol foi adicionado no tubo de coleta, a tampa foi cuidadosamente fechada e o tubo invertido. As células colhidas com LCM foram lisadas pela incubação de tubos de coleta de cabeça para baixo por 30 min em RT. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.