Artigo de método

Um protocolo da microdissecção da captação do laser que rende o RNA da alta qualidade dos ossos frescos-congelados do rato

DOI:

10.3791/60197

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16 de setembro de 2019

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1Department of Biomedical Research, University of Veterinary Medicine Vienna

Neste artigo

Resumo

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Um protocolo da microdissecção da captação do laser (LCM) foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso. O estudo atual centra-se em seções do fêmur do rato. Entretanto, o protocolo de LCM relatado aqui pode ser usado para estudar a expressão de gene nas pilhas de todo o tecido duro.

Resumo

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O rendimento e a integridade do RNA são decisivos para a análise do RNA. Entretanto, é frequentemente desafiante tecnicamente manter a integridade do RNA durante todo o procedimento inteiro da microdissecção da captação do laser (LCM). Desde que os estudos de LCM trabalham com baixas quantidades de material, as preocupações sobre rendimentos limitados do RNA são igualmente importantes. Conseqüentemente, um protocolo de LCM foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso. Avaliou-se o efeito do protocolo de coloração, da espessura dos criossecções, da quantidade de tecido microdissecado, do kit de extração de RNA e do sistema de LCM utilizado no rendimento de RNA e na integridade Obtida de células ósseas microdissecadas. As seções congeladas oito-μm-grossas do osso foram feitas usando uma película adesiva e manchadas usando um protocolo rápido para uma mancha comercial de LCM. A amostra foi imprensada entre uma membrana de polietileno tereftalato (PET) e a película adesiva. Um sistema de LCM que usa a gravidade para a coleção da amostra e um método coluna-baseado da extração do RNA foi usado para obter o RNAs da alta qualidade do suficiente rendimento. O estudo atual centra-se em seções do fêmur do rato. Entretanto, o protocolo de LCM relatado aqui pode ser usado para estudar a expressão de gene in situ nas pilhas de todo o tecido duro em circunstâncias fisiológicas e em processos da doença.

Introdução

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Os tecidos são compo de tipos heterogêneos e espacialmente distribuídos da pilha. Diferentes tipos de células em um determinado tecido podem responder de forma diferente ao mesmo sinal. Portanto, é essencial ser capaz de isolar populações de células específicas para a avaliação do papel de diferentes tipos de células em condições fisiológicas e patológicas. A microdissecção de captura a laser (LCM) oferece um método relativamente rápido e preciso para isolar e remover células especificadas de tecidos complexos1. Os sistemas de LCM usam o poder de um feixe de laser para separar as pilhas do interesse das seções histológicas do tecido sem a neces....

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Protocolo

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O tecido ósseo de camundongos foi usado em estrita conformidade com as diretrizes vigentes para o cuidado dos animais e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais.

1. animais e congelamento de incorporação

  1. Animais da casa em condições de temperatura ambiente constante (RT; 24 ° c) e um ciclo de 12 h de luz/12 h escuro com acesso gratuito à comida e água.
    Nota: os tecidos ósseos deste estudo foram obtidos de camundongos machos selvagens de 3 meses, tipo C57Bl/6.
  2. Na necropsia, exsanguinar camundongos da veia cava abdominal anestesia geral (cetamina/xilazina, 100/6 mg/kg intra....

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Resultados

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Um protocolo de LCM foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso de femurs do rato. No protocolo otimizado, as secções de osso congelado de 8 μm de espessura foram cortadas numa película adesiva e manchadas utilizando um protocolo rápido para uma mancha de secção congelada comercial de LCM. A amostra foi imprensada entre a membrana PET e a película adesiva. As células ósseas do rato foram microdissecadas utilizando um sistema de LCM que.......

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Discussão

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Tanto a qualidade quanto a quantidade de RNA podem ser afetadas negativamente em todas as etapas da preparação da amostra, como manipulação tecidual, processo de LCM e extração de RNA. Conseqüentemente, um protocolo de LCM foi desenvolvido para obter suficiente quantidade de RNA de alta qualidade para a análise subseqüente da expressão de Gene.

Para a LCM, a maioria dos laboratórios utiliza secções 7 − 8 μm de espessura2. Seções mais grossas permitiria que mais material fosse colhid.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Os autores agradecem a UTE Zeitz e a Nikole Ginner por sua excelente ajuda técnica, bem como a Vetcore e a equipe de cuidados com animais para seu apoio.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-MercaptoetanolSigma63689-25ML-F
Etanol absoluto EMPLURAMerck Millipore8,18,76,01,000
Filme adesivo (filme LMD)Section-LabC-FL001
Agilent 2100 Sistema Bioanalisador Agilent TechnologiesAgilent
RNA 6000 Pico Chip KitAgilent Technologies5067-1513
Solução de coloração Arcturus HistoGeneApplied Biosystems12241-05
Ferramenta de encaixe de criofilmeSeção-LaboratórioC-FT000
Criostato Leica CM 1950Leica Biosystems
Lâminas de microscópio de vidro, cor cortada laranja foscoVWR Life Science631-1559
Moldes de tecido de histologia PVCMEDITE48-6302-00
LMD7  Laser  Mikrodissektion  SistemaLeica Microsystems
Lâminas de micrótomo de baixo perfil Leica DB80 XLLeica Biosystems14035843496
Água sem nucleaseVWR Life ScienceE476-500ML
Lâminas de membrana PET 1.4 μ mMáquinas Moleculares & Industries GmbH50102
RNase Descontaminante de superfície MolecularBioProduct7002
RNeasy Micro KitQiagen74004
Composto de temperatura de corte ideal (OCT) Tissue-TekSakura Finetek4583
XilenoVWR Ciências da Vida2,89,73,363

Referências

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  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  2. Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Ca....

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Etiquetas

Laser Capture MicrodissectionRNA ExtractionMouse Bone SectionsCryosection PreparationStaining ProtocolGravity based LCM SystemColumn based RNA ExtractionMicrocapillary ElectrophoresisRIN Value AnalysisBone Cell Isolation

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