É descrito aqui um protocolo para caracterizar os módulos de miRNAs biologicamente sinérgica e seu conjunto em transgenes curtos, que permite o superexpressão simultâneo para aplicações da terapia de Gene.
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Artigo de método
Caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma e sua engenharia em clusters artificiais para terapia gênica
Neste artigo
Resumo
Resumo
A relevância biológica de microRNAs (miRNAs) na saúde e na doença depende significativamente de combinações específicas de muitos miRNAs desregulados simultaneamente ao invés da ação de um único miRNA. A caracterização desses módulos miRNAs específicos é um passo fundamental para maximizar seu uso na terapia. Isso é extremamente relevante porque seus atributos combinatoriais podem ser praticamente explorados. É descrito aqui um método para definir uma assinatura específica de Mirna relevante ao controle de repressores oncogênico do cromatina no glioblastoma. A aproximação define primeiramente um grupo geral de miRNAs que são desegulated nos tumores em comparação ao tecido normal. A análise é ainda mais refinada por condições de cultura diferencial, ressaltando um subgrupo de miRNAs que são coexpressos simultaneamente durante Estados celulares específicos. Finalmente, os miRNAs que satisfazem estes filtros são combinados em um transgenes polycistronic artificiais, que seja baseado em um andaime de genes naturalmente existentes dos conjuntos de Mirna, usado então para o superexpressão destes módulos de Mirna em pilhas de recepção.
Introdução
miRNAs oferecer uma oportunidade ímpar para o desenvolvimento de uma abordagem de terapia gênica ampla para muitas doenças1,2,3, incluindoo cancro4,5. Isto é baseado em diversas características originais destas moléculas biológicas, incluindo seu tamanho pequeno6, biogênese simples7, e tendência natural funcionar na associação8. Muitas doenças são caracterizadas por padrões específicos de expressão de miRNA, que muitas vezes convergem para a regul....
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Protocolo
1. caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma
- Análise da expressão diferencial ampla de miRNA em glioblastoma versus cérebro
- Primeiramente, determine os miRNAs o mais significativamente desregulamentado no tumor. Isso pode ser conseguido usando pelo menos três métodos diferentes:
- Mine o Atlas do genoma do cancro, encontrado em https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, para arranjar em seqüência dados11.
- Realize análises de Microarray a partir de um espécime operativo fresco12.
- Use os con....
- Primeiramente, determine os miRNAs o mais significativamente desregulamentado no tumor. Isso pode ser conseguido usando pelo menos três métodos diferentes:
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Resultados
Este método permitiu a caracterização de um módulo de três miRNAs que são consistentemente regulamentados em tumores cerebrais, que são coexpressos especificamente durante a diferenciação neuronal (Figura 1) e envolvidos na resposta de sobrevida tumoral após terapêutica (Figura 2). Isto é conseguido regulando um caminho repressivo oncogênico complexo da cromatina. Esse padrão de coexpressão sugeriu uma forte atividade sinergístic.......
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Discussão
Este protocolo baseia-se na noção de que, em vez de funcionar isoladamente, os miRNAs são biologicamente relevantes por trabalharem em grupos, e esses grupos são determinados transcripcionalmente por contextos celulares específicos26. Para justificar essa abordagem a partir de uma perspectiva translacional, um protocolo de acompanhamento que permite a recriação deste padrão de multi-miRNA em células/tecidos é introduzido. Isto é possível aproveitando-se da biosgênese relativamente simples de miRNA.......
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Divulgações
Os autores relatam não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores desejam agradecer aos membros do laboratório de Oncologia neuro de Harvey Cushing por apoio e críticas construtivas. Este trabalho foi apoiado pelo NINDS concede K12NS80223 e K08NS101091 a P. P.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,4% de baixa temperatura de fusão agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0,45 µ Unidade de filtro estéril M | Merck Millipore | SLH033RS | |
| tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| placas de 6 poços | Camundongos Atímicos Greiner Bio-One | 657160 | |
| (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Suplemento | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Greiner Bio-One | 660175 | ||
| Raspador de células, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiador | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Clorofórmio | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, glicose alta, piruvato | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato | Solução | Gibco 14190144 | |
| Eosina Y | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Soro Fetal Bovino | Solução de formalina Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Suplemento Sigma-Aldrich | HT501128 | ||
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Solução de hematoxilina | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Células-tronco de glioma primário humano (GBM62) | Fornecido pelo Dr. EA Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA) | ||
| Células-tronco primárias de glioma humano (MGG4) | Fornecido pelo Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Vetor lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrífuga refrigerada | Eppendorf | modelo no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Meio de montagem | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene Tubos de Centrífuga de Fundo Redondo de Policarbonato de Alta Velocidade | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Células progenitoras neurais (NPC) | Fornecido pelo Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA) | ||
| Médium Neurobasal | de | Thermo Fisher Scientific | |
| Nikon eclipse Ti | Nikon, Japão | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| Tubos de PCR | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicilina-Estreptomicina | 15140122 | Thermo Fisher Scientific | |
| 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poli-D-Lisina | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| EGF Humano Recombinante | PeproTech | AF-100-15 | |
| FGF humano recombinante-básico | PeproTech | AF-100-18B | |
| Ácido Retinóico | Gibco | 12587-010 | |
| Kit de Minipreparação RNA | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Termociclador | Bio-Rad | 1852196 | |
| Micro Irradiador Guiado por Imagem de Pequenos Animais | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | ||
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne | Applied Biosystems | ||
| Armário de biossegurança SterilGARD | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Kit de Transcrição Reversa | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomida | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek temperatura de corte ótima | de TRIzol NC9636948 | Fisher Scientific | |
| lise | de 15596026 | científica Thermo Fisher | |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| Sistema de Expressão Lentivector ViraPower | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Água, grau HPLC | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
Referências
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Gene....
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Reimpressões e permissões
