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Artigo de método

Caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma e sua engenharia em clusters artificiais para terapia gênica

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DOI:

10.3791/60215

⸱

4 de outubro de 2019

 , 
1Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

Neste artigo

Resumo

É descrito aqui um protocolo para caracterizar os módulos de miRNAs biologicamente sinérgica e seu conjunto em transgenes curtos, que permite o superexpressão simultâneo para aplicações da terapia de Gene.

Resumo

A relevância biológica de microRNAs (miRNAs) na saúde e na doença depende significativamente de combinações específicas de muitos miRNAs desregulados simultaneamente ao invés da ação de um único miRNA. A caracterização desses módulos miRNAs específicos é um passo fundamental para maximizar seu uso na terapia. Isso é extremamente relevante porque seus atributos combinatoriais podem ser praticamente explorados. É descrito aqui um método para definir uma assinatura específica de Mirna relevante ao controle de repressores oncogênico do cromatina no glioblastoma. A aproximação define primeiramente um grupo geral de miRNAs que são desegulated nos tumores em comparação ao tecido normal. A análise é ainda mais refinada por condições de cultura diferencial, ressaltando um subgrupo de miRNAs que são coexpressos simultaneamente durante Estados celulares específicos. Finalmente, os miRNAs que satisfazem estes filtros são combinados em um transgenes polycistronic artificiais, que seja baseado em um andaime de genes naturalmente existentes dos conjuntos de Mirna, usado então para o superexpressão destes módulos de Mirna em pilhas de recepção.

Introdução

miRNAs oferecer uma oportunidade ímpar para o desenvolvimento de uma abordagem de terapia gênica ampla para muitas doenças1,2,3, incluindoo cancro4,5. Isto é baseado em diversas características originais destas moléculas biológicas, incluindo seu tamanho pequeno6, biogênese simples7, e tendência natural funcionar na associação8. Muitas doenças são caracterizadas por padrões específicos de expressão de miRNA, que muitas vezes convergem para a regulação de funções biológicas complexas9. O objetivo deste método é primeiro definir uma estratégia para identificar grupos de miRNAs que são sinergicamente relevantes para funções celulares específicas. Consequentemente, fornece uma estratégia para o restabelecimento de tais combinações de miRNA em estudos e aplicações a jusante.

Este método permite a análise funcional de vários miRNAs de uma só vez, aproveitando a sua segmentação simultânea de um grande número de mRNAs, recapitulando assim as paisagens complexas de doenças. Esta abordagem tem sido recentemente empregada para definir um grupo de três miRNAs que 1) são simultaneamente desregulado no cancro do cérebro e 2) mostram um forte padrão de coexpressão durante a diferenciação neural, bem como em resposta ao stress genotóxico por radiação ou um Agente alquilantes do ADN. A reexpressão combinatória deste módulo de três miRNAs pelo método de agrupamento descrito abaixo resulta em profunda interferência com a biologia das células cancerosas e pode ser facilmente utilizada como estratégia de terapia gênica para estudos pré-clínicos10. Este protocolo pode ser de particular interesse para os envolvidos na pesquisa de miRNA e suas aplicações translacionais.

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Protocolo

1. caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma

  1. Análise da expressão diferencial ampla de miRNA em glioblastoma versus cérebro
    1. Primeiramente, determine os miRNAs o mais significativamente desregulamentado no tumor. Isso pode ser conseguido usando pelo menos três métodos diferentes:
      1. Mine o Atlas do genoma do cancro, encontrado em https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, para arranjar em seqüência dados11.
      2. Realize análises de Microarray a partir de um espécime operativo fresco12.
      3. Use os conjuntos de dados publicados anteriormente13.
        Nota: Seja qual for o método escolhido, a saída fornece um conjunto em massa de miRNAs cuja expressão é estatisticamente correlacionada (direta ou inversamente) com a biologia tumoral. Este grupo inicial constitui o conjunto de miRNAs que são analisados para a identificação de um subconjunto de miRNAs exibindo a associação funcional mais rigorosa, realizando uma análise mais dinâmica das alterações de expressão, como discutido abaixo.
  2. Análise de expressão de miRNA específica da condição
    1. Indução da diferenciação celular:
      1. Use pratos plásticos pré-revestidos de poli-D-lisina (PDL) para favorecer a formação de uma cultura monocamada. Para o revestimento do prato, dissolva PDL na água em uma concentração de 100 μg/mL. Utilize 1 mL de solução por superfície de 25 cm2 . Enxague 2x com PBS 6 h após a aplicação da solução PDL.
      2. Placas de células-tronco neurais humanas em quantidades iguais (100.000 células/5 mL) em meio de células-tronco (meio neurobasal + suplemento B27 + 20 ng/mL EGF/FGF), meio de diferenciação astrocítica (DMEM + 10% FBS) ou meio de diferenciação neuronal (meio neurobasal + B27 suplemento, + 2 μM de ácido retinóico)14. O protocolo de diferenciação Oligodendrócito requer adição de IGF-1 (200 ng/ml) após a remoção de EGF/FGF14,15.
      3. Após o chapeamento de pilha, coloc na incubadora para 1 semana em 37 ° c, 5% CO2.
    2. Extração de RNA:
      1. Após 7 dias, retire as células da incubadora e retire o meio.
      2. Lave as células com PBS (5 mL). Em seguida, adicione 1 ml de reagente de lise (ver tabela de materiais) para lyse as células e raspar as células em 1,5 ml microcentrífuga tubo usando um raspador de células. Mantenha os tubos contendo as células lisadas à temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
      3. Proceder ao isolamento total do RNA seguindo as instruções do fabricante.
    3. análise de expressão de miRNA:
      1. Quantificar a expressão diferencial de miRNAs específicos identificados na etapa 1,1 entre os três padrões de diferenciação por PCR em tempo real, utilizando sondas TaqMan e seguindo os protocolos do fabricante para transcrição reversa e amplificação de PCR ( Figura 1).
  3. Validação de clusters de miRNA por desafios específicos ao stress
    1. Cultura G34 glioblastoma células tronco-like em meio neurobasal + B27 suplemento + 20 ng/mL EGF/FGF. Comece com 1 x 106 células em 5 ml em um balão de fixação de 25 cm2 baixo.
    2. Começando 48 h após o chapeamento, adicione a duplicação de concentrações de temozolomida do agente alquilantes do ADN (TMZ) cada 5 dias, como segue:
      1. Comece com 5 μM durante 5 dias. Após 5 dias, retire o meio e substitua-o por meio fresco sem temozolomida, para permitir que as células sobreviventes se recuperem. Após 48 h, adicionar 10 μM TMZ e incubar por mais 5 dias.
      2. Repita a etapa 1.3.2.1, dobrando a concentração de TMZ cada vez, até que uma concentração pelo menos de 100 μM esteja alcangada e as pilhas se tornem resistentes à droga10.
    3. Em um experimento paralelo, irradiar células G34 da seguinte maneira:
      1. Começando 48 h após o chapeamento 1 x 106 células em 5 ml em um 25 cm2 baixo frasco de fixação, irradiar células com 2 GY de energia (qualquer irradiador fornecendo emissão de fóton é aceitável). Devolva as células à incubadora e não perturbe. Após 48 h, irradiar as pilhas outra vez com 2 GY adicionais da energia.
      2. Repita o passo 1.3.3.1 4x até que um total de 10 GY de energia é administrado.
      3. Retorne as pilhas à incubadora e deixe-as recuperar no meio fresco por pelo menos 5 dias antes da análise a jusante.
    4. Após a indução da resistência, as pilhas do lyse que usam o reagente do lysis e extraem o RNA total de acordo com o protocolo do fabricante.
    5. Analise a expressão dos miRNAs específicos identificados nas secções 1.1-1.2, conforme descrito no passo 1.2.1 (Figura 2).
  4. Caracterização da convergência funcional de miRNAs clusterizadas
    1. Obtenha o targetome previsto de cada miRNAs definido nas seções 1.2-1.3 obtidas usando ferramentas de predição de segmentação de miRNA.
      Nota: Nós geralmente recorrem ao TargetScan, pois seu algoritmo é atualizado periodicamente16. As ferramentas de predição adicionais são miRanda17, mirdb18e Diana-mirpath19. Todos esses programas são aplicativos gratuitos e baseados na Web.
      1. Na primeira página do Targetscan, selecione o miRNA de interesse do menu suspenso pré-preenchido. Clique no botão Enviar .
      2. Baixe a lista de alvos resultante como uma planilha usando o link baixar tabela (complementar Figura 1).
      3. Para diminuir as chances de previsões falsas positivas, inclua somente alvos dentro da coluna de sites conservados em análises downstream. Também, mais rigor pode ser obtido usando programas adicionais da predição de Mirna (veja acima) e somente including os alvos que são comuns a todos os algoritmos.
    2. Classifique os targetomes resultantes de acordo com as categorias de ontologia gênica usando o ToppGene Suite20 para avaliar o enriquecimento de caminhos comuns a cada Mirna.
      1. Cole a lista de alvos obtidos da etapa 1.4.1 na janela "conjunto de genes de treinamento", usando o símbolo HGNC como o tipo de entrada. Clique em enviar > Iniciar. O programa fornecerá uma tabela de saída mostrando as categorias "Go" mais significativas para a lista de genes inseridos (Figura complementar 2).
    3. Para finalmente estabelecer a contribuição de cada miRNA para a regulação de um caminho comum ou processo celular (neste caso, a regulação da cromatina), verificar cada targetome obtido na etapa 1.4.1 contra a lista completa de genes envolvidos no processo celular específico ( ou seja, regulação da cromatina), utilizando a função de diagrama de Venn fornecida no site de bioinformática e genômica evolutiva http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
      Nota: Este programa permite a interseção de vários grupos ao mesmo tempo (Figura 3). Os alvos únicos específicos fornecidos por cada miRNA são anotados então e selecionados para experimentos funcionais a jusante.
      1. Na primeira página do programa, carregue ou copie/cole a lista se o mRNAs de destino para cada miRNA ou interesse nas respectivas janelas. Nomeie cada lista com um identificador exclusivo.
      2. Clique em Submit. O programa fornecerá uma saída Visual de um diagrama de Venn com números de genes em cada setor, bem como uma lista completa de mRNAs para cada subconjunto e combinações de interseção.

2. montagem de módulos de miRNA em um aglomerado transgênico Policístrônico

  1. Preparação de andaime transgênico baseado no locus de agrupamento miR-17-92
    1. Obtenha a sequência de nucleotídeo do cluster miR-17-92 do navegador do genoma do Ensemble21. Selecione o ~ 800 par base "Core" seqüência abrangendo todos os seis codificado Mirna grampos do locus e pelo menos 200-nucleotídeo flanqueando sequências de upstream (5 ') e downstream (3 ') da seqüência de núcleo.
    2. Cole a seqüência acima em qualquer programa de edição de palavras.
    3. Defina a sequência de cada um dos seis grampos de cabelo nativos, recuperando-os no miRBase22. Marque cada uma dessas sequências dentro do intervalo da seqüência "núcleo" identificada anteriormente. Todas as seqüências entre cada hairpin representam as seqüências do espaçador, que são importantes para o processamento correto do transgene.
    4. Remova as sequências de hairpin nativas da sequência "Core", com exceção de 3-5 nucleotídeos em ambos os 5 ' e 3 ' extremidades de cada hairpin, que servirá como um aceitador para os grampos de cabelo novo.
  2. Construindo um novo transgene codificando vários miRNAs de escolha
    1. Obter seqüências de hairpin de miRNAs destinados a ser superexpressos no transgene de miRBase. Anote com cuidado os nucleotídeos específicos que são os locais da clivagem do microprocessador.
    2. Substitua os grampos de cabelo removidos (passo 2.1.4) com as sequências de hairpin dos miRNAs desejados obtidos na etapa 2.2.1.
    3. Adicionar seqüências de restrição desejadas em ambas as regiões flanquear do transgene para facilitar a subclonagem em vetores de entrega de escolha. Verifique se as sequências de restrição escolhidas não estão presentes dentro da própria sequência.
    4. Para controles negativos, use sequências de 20 nucleotídeo mexidos para substituir a seqüência natural de 20 nucleotídeo de cada miRNA maduro. Gere essas sequências embaralhadas usando uma ferramenta online como https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
  3. Verificando a estrutura bidimensional do transgene
    1. Copie a seqüência transgênica completa para o programa de software de predição de estrutura de RNA RNAweb Fold23.
    2. Usando as configurações padrão do programa, clique em continuar.
    3. Analise a saída gráfica, particularmente para a presença de grampos de cabelo bem definidos e a presença de estruturas de haste dobro-encalhadas pelo menos 11 nucleotídeos proximal ao local do clivagem do microprocessador. Além disso, procure a ausência de pontos de ramificação dentro das sequências de hairpin (Figura 4).

3. obtendo transgenes por síntese de DNA

  1. Após o projeto e na validação do silico do conjunto quimérico de Mirna, obtenha a seqüência de funcionamento usando a síntese do ADN dos vendedores comerciais24 e prossiga com a clonagem a jusante em vetores e na entrega do transgene. Utilizamos vetores lentivirais para entrega in vitro10 e vírus adeno-associados (AAV) para parto intracraniano in vivo25.

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Resultados

Este método permitiu a caracterização de um módulo de três miRNAs que são consistentemente regulamentados em tumores cerebrais, que são coexpressos especificamente durante a diferenciação neuronal (Figura 1) e envolvidos na resposta de sobrevida tumoral após terapêutica (Figura 2). Isto é conseguido regulando um caminho repressivo oncogênico complexo da cromatina. Esse padrão de coexpressão sugeriu uma forte atividade sinergístic...

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Discussão

Este protocolo baseia-se na noção de que, em vez de funcionar isoladamente, os miRNAs são biologicamente relevantes por trabalharem em grupos, e esses grupos são determinados transcripcionalmente por contextos celulares específicos26. Para justificar essa abordagem a partir de uma perspectiva translacional, um protocolo de acompanhamento que permite a recriação deste padrão de multi-miRNA em células/tecidos é introduzido. Isto é possível aproveitando-se da biosgênese relativamente simples de miRNA...

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Divulgações

Os autores relatam não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer aos membros do laboratório de Oncologia neuro de Harvey Cushing por apoio e críticas construtivas. Este trabalho foi apoiado pelo NINDS concede K12NS80223 e K08NS101091 a P. P.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,4% de baixa temperatura de fusão agarose IBI ScientificIB70058
0,45 µ Unidade de filtro estéril MMerck MilliporeSLH033RS
tubo de microcentrífuga de 1,5 mLEppendorf22431081
placas de 6 poços Camundongos Atímicos Greiner Bio-One657160
(FoxN1 nu/nu)Envigo069(nu)/070(nu/+)
B-27 Suplemento Thermo Fisher Scientific12587010
Greiner Bio-One660175
Raspador de células, 16cmSarstedt83.1832
Cesium 137 irradiador JL Sheperd and AssociatesCore Facility (Harvard Medical School)
ClorofórmioSigma-Aldrich439142-4L
DMEM, glicose alta, piruvato Thermo Fisher Scientific11995040
Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato SoluçãoGibco 14190144
Eosina Y Sigma-AldrichE4009
Soro Fetal BovinoSolução de formalina Sigma-AldrichF9665
Suplemento Sigma-AldrichHT501128
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific35050061
HEK-293American Type Culture CollectiATCC CRL-1573
Solução de hematoxilinaSigma-Aldrich1051750500
Células-tronco de glioma primário humano (GBM62)Fornecido pelo Dr. EA Chiocca (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Células-tronco primárias de glioma humano (MGG4)Fornecido pelo Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Vetor lentiviral pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPSystem BiosciencesCD511B-1
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific11668019
Microcentrífuga refrigeradaEppendorfmodelo no. 5424 R, cat. no.5404000138
Meio de montagem Thermo Fisher Scientific4112APG
Nalgene Tubos de Centrífuga de Fundo Redondo de Policarbonato de Alta Velocidade Thermo Fisher Scientific 3117-0380PK
NanoDropThermo Fisher Scientific2000c
Células progenitoras neurais (NPC)Fornecido pelo Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women' s Hospital, Boston, MA)
Médium Neurobasal deThermo Fisher Scientific
Nikon eclipse TiNikon, Japão14314
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985088
Tubos de PCR Sigma-AldrichCLS6571-960EA
Penicilina-Estreptomicina 15140122Thermo Fisher Scientific
94/16 Greiner Bio-One632180
Poli-D-Lisina Sigma- AldrichP4707
EGF Humano Recombinante PeproTech AF-100-15
FGF humano recombinante-básico PeproTech AF-100-18B
Ácido RetinóicoGibco12587-010 
Kit de Minipreparação RNADirect-zolR2050
S1000 Termociclador Bio-Rad1852196
Micro Irradiador Guiado por Imagem de Pequenos Animais Xstrahal Life Sciences, UKCore facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 
StemPro Accutase Thermo Fisher ScientificA1110501
StepOneApplied Biosystems 
Armário de biossegurança SterilGARDThe Baker CompanySG403A-HE
SucroseSigma-AldrichS9378
T98-GAmerican Type Culture CollectiATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Kit de Transcrição Reversa Thermo Fisher Scientific4366596
TaqMan Universal PCR Master MixThermo Fisher Scientific4324018
TemozolomidaTocris Bioscience2706
Tissue-Tek temperatura de corte ótima de TRIzol NC9636948Fisher Scientific
 lisede 15596026científica Thermo Fisher
U251-MGAmerican Type Culture CollectiATCC HTB-17
U87-MG American Type Culture CollectiATCC HTB-14
Sistema de Expressão Lentivector ViraPower Thermo Fisher ScientificK4970-00
Água, grau HPLCFisherW54
Xylene Sigma-Aldrich534056
Garrafa de cultura de células Sistema microscópio fluorescente motorizado 21103049 Placas de Petri 75000100Sistema de PCR em Tempo Real 4376357Reagente Reagente de

Referências

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