Aqui, nós apresentamos um protocolo para dissociar e classificar uma população específica da pilha das glândulas acessórias masculinas de Drosophila (pilhas secundárias) para o sequenciamento do RNA e o RT-qPCR. A isolação da pilha é conseguida com a purificação de FACS de pilhas secundárias GFP-expressando após um processo multistep-dissociation que exige a dissecção, a digestão dos proteases e a dispersão mecânica.
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Artigo de método
Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila
Neste artigo
Resumo
Resumo
Para entender a função de um órgão, muitas vezes é útil entender o papel de suas populações de células constituintes. Infelizmente, a raridade de populações de células individuais muitas vezes torna difícil obter material suficiente para estudos moleculares. Por exemplo, a glândula acessória do sistema reprodutivo masculino de Drosophila contém dois tipos distintos de células secretoras. As células principais compõem 96% das células secretoras da glândula, enquanto as células secundárias (SC) compõem o restante 4% das células (cerca de 80 células por macho). Embora ambos os tipos da pilha produzam componentes importantes do líquido seminal, somente alguns genes são sabidos para ser específicos aos SCs. A raridade do SCs tem, até agora, dificultado o estudo da análise transcriptômica deste importante tipo de célula. Aqui, um método é apresentado que permite a purificação de SCs para extração de RNA e seqüenciamento. O protocolo consiste em primeiras glândulas dissecantes de moscas expressando um repórter GFP específico do SC e, em seguida, sujeitando essas glândulas à digestão da protease e dissociação mecânica para obter células individuais. Seguindo estas etapas, as pilhas individuais, vivas, GFP-marcadas são classificadas usando um classificador de célula ativado fluorescente (FACS) para a purificação do RNA. Este procedimento rende RNAs SC-específicos de ~ 40 machos por a condição para a jusante RT-qPCR e/ou o sequenciamento do RNA no curso de um dia. A rapidez e simplicidade do procedimento permite o transcriptoma de muitas moscas diferentes, de diferentes genótipos ou condições ambientais, a ser determinado em um curto período de tempo.
Introdução
Os órgãos são compo de tipos múltiplos da pilha, cada um com funções discretas e expressando às vezes vastamente jogos diferentes dos genes. Para obter uma compreensão precisa de como um órgão funciona, muitas vezes é crítico para estudar cada tipo de célula distinta que compõe este órgão. Um dos principais métodos utilizados para explorar a possível função é a análise do transcriptoma. Este método poderoso fornece um instantâneo da expressão de gene em uma pilha, para revelar processos e caminhos ativos. Entretanto, este tipo de análise é frequentemente difícil para as populações raras da pilha que devem ser purificadas das pilhas vizinhas distante mais-abundantes. P....
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Protocolo
linhas 1. Drosophila usadas e coleção dos machos
- Para este protocolo, use machos expressando GFP no SCs e não nas células principais. Aqui, um excitador de abdb-GAL4 (descrito na referência18), recombined com UAS-GFP (no cromossoma 2) é usado. Outros drivers apropriados também podem ser usados. Para a isolação de SCs circunstâncias diferentes do mutante, cruze a mutação nas linhas que contêm a linha SC-específica de GFP.
- Colete dois lotes de cerca de 25 homens saudáveis e virgens para cada genótipo e envelhecê-los a 25 ° c por 3-4 dias em frascos com comida de Drosophila recém-feita.
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Resultados
O protocolo aqui apresentado permite que um experimentador Isole as células secundárias das glândulas acessórias masculinas da Drosophila e EXTRAIA seu RNA no decorrer de um único dia (Figura 1).
Utilizamos a construção de Abd-B-GAL4 18 para rotular células secundárias (SC), mas não as células principais (MC) com GFP (Figura 2
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Discussão
Os métodos para a dissociação da pilha do tecido da Drosophila como discos imaginal são descritos já23. Nossas tentativas de simplesmente usar esses procedimentos em glândulas acessórias falharam, incentivando-nos a desenvolver este novo protocolo. A digestão da protease e a trituração mecânica foram passos críticos para o sucesso do procedimento e, assim, colocamos muitas anotações nas seções 2 a 5 para ajudar os experimentadores a obter resultados satisfatórios. Para que a dissociação s.......
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Divulgações
Os autores não têm divulgação.
Agradecimentos
Nós somos gratos aos membros do laboratório de Karch, ao plateform da genômica de iGE3, à facilidade do núcleo da citometria do fluxo da Universidade de Genebra, e ao Dr. Jean-Pierre Aubry-Lachainaye que ajustou o protocolo para FACS. Agradecemos Luca Stickley por sua ajuda com a visualização das leituras sobre IGV. Agradecemos-nos por uma gentil permissão para reutilizar figuras, e os editores para nos pedir para ser criativo com a escrita.
Esta pesquisa foi financiada pelo estado de Genebra (CI, RKM, FK), o fundo nacional suíço de pesquisa (www.snf.ch) (FK e RKM) e doações da Fundação Claraz (FK).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de tecidos de 24 poços | VWR | 734-2325 | |
| Microscópio binocular para dissecção | |||
| Binocular com fonte de luz para GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0,3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Microtubos de plástico 1,5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| dissecção fina | |||
| Soro bovino fetal | Gibco | 10270-106 | calor inativado antes do uso |
| Pratos de vidro para dissecação | |||
| Balde de | |||
| ImProm-II Sistema de Transcrição Reversa | Promega | A3800 | |
| Kit de Purificação de RNA MasterPure | Epicentre | MCR85102 | |
| Kit Nextera XT | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U / mL estoque | ||
| PBS | caseiro | ||
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15070-063 | |
| Primers PolydT Primers | |||
| hexâmeros aleatórios | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider' s Drosophila médio | Kit de | 21720-001 | |
| SMARTer | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix para CFX | aplicado biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μ Ponta graduada L | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μ Ponta chanfrada em L | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
Referências
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmen....
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Reimpressões e permissões
