Um protocolo de crio-pulverização para processar patas do rato para avaliar caminhos moleculares da inflamação do tecido em um modelo induzido da artrite do colágeno

Summary

Um método criogênico de pulverização para processar patas de urina usando um moinho congelador de nitrogênio líquido foi desenvolvido para melhorar o rendimento e a qualidade do RNA ou proteína extraído dos tecidos e permitir a análise de perfis moleculares associados a inflamatórios Respostas.

Abstract

O perfil de alterações moleculares nos tecidos locais é crucial para entender o mecanismo de ação dos candidatos terapêuticos in vivo. No campo da pesquisa da artrite, muitos estudos são focalizados nas junções inflamadas que são compostas de uma mistura complexa do osso, da cartilagem, do músculo, das pilhas estromais e das pilhas imunes. Aqui, estabelecemos um método mecânico confiável e robusto para interromper as patas inflamadas do rato em amostras pulverizadas homogêneas em um ambiente criogenicamente controlado. As lisatas proteicas e rna foram processadas para permitir desfechos proteômicos e transcricionais e caracterização molecular de vias de doenças relevantes no tecido local.

Introduction

A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória sistêmica crônica com sinofite simétrica persistente nas articulações e envolvimento articular extra de órgãos como a pele, coração, pulmões e olhos¹. Embora as manifestações sistêmicas da resposta imune sejam evidentes em pacientes humanos, uma das características da patologia da RA é a infiltração de células imunes no tecido sinovial e a proliferação de células fibroblastas sinoviais^2.

Semelhante ao AR humano, o modelo de artrite induzida por colágeno do rato (CIA) provoca forte inflamação do tecido com respostas imunes ativas em tecidos si....

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as políticas do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Janssen R&D.

1. Método de Pulverização baseado em fábrica de freezer criogênico

1. Na terminação do estudo do CIA, os ratos do sacrifício com isoflurane de 1.5% seguidos pela deslocação cervical.
2. No dia do processamento de tecidos, pré-chill todos os instrumentos (espátulas, frascos de moagem, etc) em gelo seco por um mínimo de 10 min. Use luvas térmicas para evitar danos ao congelamento.
3. Corte patas traseiras com uma tesoura na linha de pele como descrito na ....

Results

Aqui, nós mostramos uma visualização representativa da imagem do gel do RNA extraído das patas dianteiras de ratos do CIA na figura 2A. O rRNA 28S e a banda rRNA 18S indicam que todas as amostras têm quantidade suficiente de RNA intacto. Em seguida, mostramos um gráfico representativo de dispersão de concentrações totais de proteínas com base na análise de proteína BCA na Figura 2B. As concentraç.......

Discussion

Embora haja uma forte lógica científica para avaliar as vias moleculares nos tecidos sinoviais, muitos relatórios sobre o perfil imunológico do modelo da CIA murine foram focados no sangue periférico, enquanto os dados de análise de proteínas e RNA de patas inflamadas são bastante limitados. Existem várias razões possíveis para este viés: as articulações do tornozelo murine não são maiores do que ~ 2 cm; as áreas afetadas consistem em tecidos de pele, osso e conjuntivo, que muitas vezes são difíceis de homogeneizar usand.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grânulo de aço inoxidável de 5 mm	Qiagen	69989
beta-mercaptoetanol	Sigma	M6250	Agente redutor de amostra que inibe as enzimas RNASE
Kit Bioanalisador	Agilent	5067-1511	Kit de qualificação de RNA
b-mercaptoetanol	Sigma	M6250
Grau de Cultura de Células Água	Corning	25-055-CI	Solução
de estoque de lise de célula	Sinalização celular	9803
Eppendorf Tube	Eppendorf	22363204	Tubos de microfuga
Caixa centrífuga de tubo Eppendorf	Nalgene	5055	Caixa para segurar tubos eppendorf em arranjo de tubos horizontal
Everlast 247 Variable Speed Rocker	Benchmark Scientific	BR5000
Freezer Mill	Spex Sample Prep	6875	Freezer/Mill para processamento de patas em pó pulverizado
Frasco de moagem	Spex Sample Prep	6801	Frasco de policarbonato para processamento de patas em pó pulverizado
Kit Pierce BCA	Kit Pierce	23225	para quantificação de proteína total
de coquetel de inibidor de protease 1	Calbiochem	539131	Protease
Kit BCA de proteína	Pierce	23225
Kit Quantigene	Thermofisher	QP1013	Kit de análise de bDNA
Microcentrífuga refrigerada	de centrifugação	Eppendorf	5417R
Tampão	extração de RNA	Qiagen	79216
kit RNeasy	Qiagen	74104	incluindo coluna RNeasy, tampão RLT e tampão RW1
Espátula Shaker	Benchmark Scientific	BR5000	Rocker/Shaker
	VWR	10806-412	Espátula para transferência de pó
Conta de aço inoxidável	Qiagen	69989	Conta para misturar durante a extração de proteínas
Extrator de tubo	Spex Sample Prep	6884	Extrator para remover a parte superior do frasco de moagem
Vortexer	VWR	10153-838	Mistura de amostras