As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) transitam de um estado quiescente para um estado de diferenciação devido à sua plasticidade metabólica durante a formação sanguínea. Aqui, apresentamos um método otimizado para medir a respiração mitocondrial e a glicolíse dos HSPCs.
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Artigo de método
Análise do metabolismo hematopoiético da pilha do progenitor da haste
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células progenitoras de tronco hematopoiético (HSPCs) têm plasticidade metabólica distinta, o que lhes permite fazer a transição de seu estado quiescente para um estado de diferenciação para sustentar as demandas da formação sanguínea. No entanto, tem sido difícil analisar o estado metabólico (respiração mitocondrial e glicolíse) dos HSPCs devido aos seus números limitados e à falta de protocolos otimizados para HSPCs frágeis não aderentes. Aqui, fornecemos um conjunto de instruções claras e passo a passo para medir a respiração metabólica (taxa de consumo de oxigênio; OCR) e glicolyse (taxa de acidificação extracelular; ECAR) de murine osso medula-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. Este protocolo fornece uma maior quantidade de HSPCs LSK da medula óssea da urina, melhora a viabilidade dos HSPCs durante a incubação, facilita análises de fluxo extracelular de HSPCs não aderentes e fornece protocolos de injeção otimizados (concentração e tempo) para medicamentos que visam a fosforilação oxidativa e vias glicolíticas. Este método permite a previsão do estado metabólico e da saúde dos HSPCs durante o desenvolvimento do sangue e doenças.
Introdução
Uma vez que a vida útil da maioria dos glóbulos maduros é curta, a homeostase do sangue depende da auto-renovação e diferenciação de uma população de longa duração, mas rara de células-tronco hematopoiéticas (HSPCs)1. HSPCs são quiescentes, mas eles são rápidos a proliferar e sofrer diferenciação após a estimulação para sustentar as demandas do sistema sanguíneo. Como cada estado celular HSPC requer uma demanda bioenergética única, as mudanças metabólicas são os principais impulsionadores das decisões de destino HSPC. Portanto, a perda da plasticidade metabólica, alterando o equilíbrio entre quiescência, autorenovação e diferenciação de HSPCs, ....
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Protocolo
Este protocolo foi aprovado pelo Nationwide Children's Hospital Animal Care and Use Committee (IACUC).
Nota: O protocolo é descrito em ordem cronológica que se estende ao longo do período de dois dias. Use novos reagentes, conforme descrito no protocolo abaixo.
1. Preparação de reagentes no dia anterior ao ensaio
-
Hidrate o cartucho do sensor.
- Incubar 5 mL do calibrante(Tabela de Materiais)em uma incubadora não CO2 37 °C durante a noite.
- Abra o kit de ensaio de fluxo(Mesa de Materiais)e separe o cartucho ....
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Resultados
Nosso método de extração nos permitiu colher até ~ 80.000 HSPCs LSK por mouse. A viabilidade e o número de células LSK foram melhorados com o nosso método, porque nós: (1) medula óssea combinada dos membros superiores e inferiores, ossos do quadril, esterno, caixa torácica e coluna vertebral(2) evitado o uso de tampão de lyse de células vermelhas que teria aumentado a morte celular e aaglomeração, (3) usou a separação média de gradiente de densidade de células mononucleadas, e (4) evitou o uso de tampão pré-refrigerado q.......
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Discussão
Aqui, demonstramos o isolamento de uma quantidade máxima de população de HSPCs lspcs de urina pura e viável, bem como a medição de sua glicolíse e respiração mitocondrial com um analisador de fluxo extracelular. Especificamente, o protocolo supera as seguintes questões técnicas para o uso de LSK HSPCs : i) a baixa frequência de LSK HSPCs na medula óssea de urina14, ii) baixa atividade metabólica basal de LSK HSPCs26, iii) a fragilidade dos LSK HSPCs27
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho é, em parte, apoiado pelo apoio financeiro dos Institutos Nacionais de Saúde (HL131645, CA016058), da Fundação St. Baldrick e da Fundação Pelotonia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,01% (p/v) solução de poli-L-lisina | Sigma | P8920 | Usado para fixação LSK |
| 40 µ filtro de células m | Fisher Scientific | 22-363-547 | Usado para filtração celular após esmagamento ósseo |
| Anti-Biotina MicroBeads | Miltenyi | 130-090-485 | Usado para separação de linha |
| Biotina Rato Anti-Rato CD45R/B220 Clone RA3-6B2 | BD Biosciences | 553086 | Usado para separação de |
| linha Biotina Rato Anti-Rato CD5 Clone 53-7.3 | BD Biosciences | 553019 | Usado para Lin- separação |
| Biotina Rato Anti-Rato CD8a Clone 53-6.7 | BD Biosciences | 553029 | Usado para Lin- separação |
| Biotina Rato Anti-Rato Ly-6G e Ly-6C Clone RB6-8C5 | BD Biosciences | 553125 | Usado para Lin- separação |
| Biotina Rato Anti-Rato TER-119/Células Eritróides Clone TER-119 | BD Biosciences | 553672 | Usado para Lin- separação |
| CD117 (c-Kit) Anticorpo Monoclonal (2B8), APC | eBioscience | 17-1171-83 | Usado para classificação LSK |
| Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Usado no isolamento celular |
| Falcon 50 mL Tubos de Centrífuga Cônicos | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Usado no isolamento celular |
| Falcon Tubos de Polipropileno de Fundo Redondo | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-11A | Usado para LSK classificando |
| Fetal bovino | Serum Neuromics | FBS001-HI | Usado em FACS buffer |
| Histopaque-1083 | Sigma | 10831 | Usado para separação de gradiente de ficoll |
| L-glutamina 100x | Fisher Scientific | 25-030-081 | Usado para os meios de ensaio |
| LS Column | Miltenyi | 130-042-401 | Usado para separação de linha |
| Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Anticorpo (D7), PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-5981-82 | Usado para classificação LSK |
| Fator de células-tronco murinas (SCF) | PeproTech | 250-03-100UG | Usado para o meio de ensaio |
| Trombopoetina murina (TPO) | PeproTech | 315-14-100UG | Usado para o meio de ensaio |
| PBS 1% | Fisher Scientific | SH3002802 | Usado para tampão FACS |
| Penicilina-Estreptomicina ( 10.000 U/mL) | Fisher Scientific | 15140122 | Usado para o meio de ensaio |
| Iodeto de propídio | Fisher Scientific | P1304MP | Usado para classificação LSK Cavalo-marinho |
| Miniplaca de cultura de células XFp Agilent | Technologies | 103025-100 | Usado para semeadura LSK |
| Piruvato de sódio (100 mM) | ThermoFisher | 11360070 | Usado para o meio de ensaio |
| Estreptavidina eFluor 450 Conjugado | eBioscience | 48-4317-82 | Usado para classificação LSK |
| XF Calibrant | Agilent Technologies | 100840-000 | Usado para equilíbrio de cartucho |
| Meios XF | Agilent Technologies | 103575-100 | Usado para o meio de ensaio |
| Kit de teste de estresse de glicólise XFp | Agilent Technologies | 103017100 | Medicamentos para teste de estresse de glicólise |
| XFp Mitocondrial Drogas | do 103010100 | das tecnologias de Agilent | para o teste de esforço mitocondrial |
| 103022-100 | XFp | Agilent do | usadas para a glicólise e o teste de esforço mitocondrial |
Referências
- Dharampuriya, P. R., et al. Tracking the origin, development, and differentiation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 108-115 (2017).
- Wilkinson, A. C., Yamazaki, S. The hematopoietic stem cell diet. Internationa....
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Reimpressões e permissões
