Prospecção de cepas microbianas para desenvolvimento de bioremediação e probióticos para pesquisa e preservação de metaorganismos

Summary

A poluição afeta todos os biomas. Os ambientes marinhos têm sido particularmente impactados, especialmente os recifes de corais, um dos ecossistemas mais sensíveis da Terra. A bioremediação é a capacidade dos organismos para degradar contaminantes. Aqui, descrevemos metodologias para isolar e testar micróbios que apresentam capacidade de bioremediação e potenciais características probióticas para corais.

Abstract

A poluição afeta todos os biomas. Os ambientes marinhos têm sido particularmente impactados, especialmente os recifes de corais, um dos ecossistemas mais sensíveis da Terra. Globalmente, 4,5 bilhões de pessoas dependem economicamente do mar, onde a maior parte de seus meios de subsistência é fornecida por recifes de corais. Os corais são de grande importância e, portanto, sua extinção leva a consequências catastróficas. Existem várias soluções possíveis para remediar poluentes marinhos e contaminação local, incluindo a bioremediação. A bioremediação é a capacidade dos organismos para degradar contaminantes. A abordagem apresenta várias vantagens, como sustentabilidade, custo relativamente baixo e o fato de que ela pode ser aplicada em diferentes ecossistemas, causando impactos mínimos ao meio ambiente. Como uma vantagem extra, a manipulação de microbiomas endógenos, incluindo microorganismos benéficos putativos para corais (pBMCs), pode ter efeitos probióticos para animais marinhos. Nesse contexto, o uso das duas abordagens, bioremediação e inoculação pBMC combinadas, poderia ser promissor. Esta estratégia promoveria a degradação de poluentes específicos que podem ser prejudiciais aos corais e outros metaorganismos, aumentando também a resistência e a resiliência dos hospedeiros para lidar com a poluição e outras ameaças. Este método centra-se na seleção de pBMCs para degradar dois contaminantes: o estrogênio sintético 17a-ethinylestradiol (EE2) e petróleo bruto. Ambos foram relatados para impactar negativamente animais marinhos, incluindo corais, e seres humanos. O protocolo descreve como isolar e testar bactérias capazes de degradar os contaminantes específicos, seguido por uma descrição de como detectar algumas características benéficas putativas desses micróbios associados ao seu hospedeiro de coral. As metodologias descritas aqui são relativamente baratas, fáceis de executar e altamente adaptáveis. Quase qualquer tipo de composto alvo solúvel pode ser usado em vez de EE2 e óleo.

Introduction

A poluição é uma questão importante que afeta a saúde humana, animal e vegetal em todo o mundo. Embora a poluição possa ser natural, como cinzas vulcânicas^1,as atividades humanas são a principal causa da maior parte da poluição. As atividades antropogênicas estão contaminando o solo, a água e o ar, que levam direta ou indiretamente a quase 20 milhões de mortes humanas prematuras² e dizimam bilhões de outras formas de vida anualmente. Os poluentes estão presentes mesmo nas áreas mais remotas do planeta. Por exemplo, metais pesados e compostos orgânicos persistentes foram detectados em invertebrados do mar profundo e mamíferos polares, respectivamente^3,4.

Os ambientes marinhos têm sido especialmente afetados pela poluição. Por um longo tempo, assumiu-se que o oceano permaneceria inalterado e forneceria uma fonte infinita de bens por causa de seu volume maciço de água^5. Por esta razão, todos os tipos de indústria e instituições liberaram livremente resíduos em corpos d'água por séculos^6,7. Vários contaminantes de todos os tipos, como plástico⁸, hormônios sintéticos⁹, pesticidas¹⁰, óleo¹¹, nutrientes^12,metais pesados^3,e resíduos radioativos¹³ têm sido relatados como impactando ecossistemas oceânicos. Neste contexto, os recifes de coral estão entre os ecossistemas mais importantes e sensíveis em ambientes marinhos¹⁴. Os recifes são protetores costeiros, cruciais para o desenvolvimento de milhares de espécies marinhas, desempenhando papéis essenciais no ciclismo de nutrientes e no controle climático. Os recifes também contribuem para a economia, fornecendo peixe, bens e turismo, entre outros^15. Por exemplo, 4,5 bilhões de pessoas dependem de peixes do oceano como sua principal fonte de alimento¹⁶, que são muito apoiadas por recifes de coral.

Independentemente da sua importância ecológica, social e económica, os recifes de coral estão a ser dizimados^17,18. As atividades antropogênicas são as principais responsáveis por contribuir para as três principais causas da morte dos corais: mudanças climáticas, sobrepesca e poluição da água¹⁹. Mesmo que seja importante trabalhar na mitigação do aquecimento global, também é importante trabalhar na minimização da contaminação local, incluindo a poluição da água, que pode contribuir criticamente para o declínio dos corais²⁰. Assim, há uma necessidade urgente para o desenvolvimento de estratégias para aumentar a vida útil dos corais, o que poderia proporcionar-lhes tempo extra para se adaptar e sobreviver.

A este respeito, é extremamente importante encontrar soluções para minimizar a contaminação e desenvolver estratégias para aumentar a aptidão dos corais. As estratégias para remediar os poluentes marinhos são altamente diversas e podem ser agrupadas em abordagens físicas, químicas e biológicas. Abordagens físicas são úteis. No entanto, nem sempre são eficientes. Por exemplo, os resíduos plásticos podem ser minimizados pela remoção física, enquanto os compostos solúveis em água precisam de outras metodologias para serem eliminados. Exemplos de tais compostos são o petróleo bruto, liberado pelas atividades e derramamentos da indústria do petróleo, bem como outros micropoluentes, como hormônios sintéticos, normalmente usados como componente estrogênioico em contraceptivos orais e presentes no esgoto^{21, 22}. O uso de substâncias químicas para diminuir a contaminação pode resolver um problema específico, mas também pode representar uma fonte extra de poluição. Este é o caso dos dispersantes químicos para mitigar a contaminação por óleo, que têm sido descritos como ainda mais tóxicos para os ecossistemas marinhos do que a contaminação por óleo em^{si 23}. Por estas razões, as abordagens biológicas apresentam várias vantagens quando comparadas aos outros métodos. A bioremediação é a capacidade dos organismos vivos, ou seus produtos metabólicos, de transformar contaminantes em formas menos tóxicas ou não tóxicas^24. As principais vantagens do uso de métodos biológicos são a sustentabilidade, o baixo custo relativo, o fato de serem ecologicamente amigáveis e que podem ser aplicadas em diferentes ecossistemas, causando impactos mínimos ou menores ao meio ambiente^{21, 25,26,27.}

Além disso, a manipulação da comunidade microbiana presente em um ambiente permite uma vantagem potencial extra. Existem microbiomas associados aos hospedeiros e essenciais para a sua saúde. É sabido que esses microbiomas simbióticos associados são necessários para manter a homeostase hospedeira^19. A manipulação desses microorganismos associados tem sido bem explorada para hospedeiros como plantas e mamíferos^28,29,mas o uso de probióticos de corais ainda é novo^15. Corais também hospedar, interagir com, e dependem de grandes e específicas populações de microorganismos para sobreviver¹⁹. O papel dessas comunidades microbianas na saúde e disbiose dos corais está estudo ativo, mas ainda está longe de ser totalmente compreendido³⁰. Uma das hipóteses mais populares é chamada de hipótese probiótica coral. Sugere a existência de uma relação dinâmica entre microorganismos simbióticos e condições ambientais que provoca a seleção dos metaorganismos de corais mais vantajosos^31. Com base nestainformação, foram propostos mecanismos probióticos potenciais fundamentais, bem como as estratégias de isolamento, manipulação e entrega de microrganismos benéficos para corais (BMCs) para vários fins, foram propostos³² e testados^33. Essas características benéficas potenciais incluem resistência ao aumento da temperatura, proteção contra espécies reativas de oxigênio (ROS), fixação de nitrogênio, resistência a contaminantes e controle biológico contra patógenos, entre outros^32.

Este estudo centra-se na seleção de BMCs e microorganismos de vida livre que apresentam a capacidade de degradar dois contaminantes comumente encontrados em ambientes marinhos: o estrogênio sintético 17a-ethinylestradiol (EE2) e petróleo bruto. Poluentes contendo agentes ativos hormonais estão frequentemente presentes nos corpos d'água^{34,35,36,37,38,39,40, 41,42.} Entre eles, compostos sintéticos estrogênicos eendócricos disruptores (EDCs) imitam a ação de estrogênios em células-alvo, causando vários impactos sobre os animais, incluindo câncer de mama, infertilidade e hermafrodita⁹. EE2 é excretado por seres humanos por causa do uso de contraceptivos orais. Não é retirado do esgoto pelas estações tradicionais de tratamento de águas residuais e tem efeitos negativos mesmo em concentrações muito baixas (por exemplo, ng/L ou μg/L)^43,44,45. Pouco se sabe sobre os efeitos dos estrogênios na fisiologia dos corais^46,47. No entanto, em outros invertebrados marinhos, como esponjas, crustáceos e moluscos, os estrogênios foram relatados para causar vários efeitos negativos relacionados principalmente à reprodução, como desenvolvimento e/ou estimulação de gametas, alteração em ações proteicas, problemas em processos embrionários, e outros^{48,49,50,51,52.} As consequências negativas causadas pela contaminação pelo EE2 realçam a necessidade de desenvolver abordagens sustentáveis para remover este composto do ambiente sem afetar a vida marinha.

Paralelamente, com o petróleo atualmente representando quase 40% das fontes de energia consumidas no mundo^53,contaminação crônica e derramamentos de óleo geralmente ocorrem perto das áreas de recife^11. A contaminação por óleo foi relatada para causar efeitos negativos em várias espécies de animais marinhos, aves, plantas e seres humanos^54,55,56,57. Nos corais, causa branqueamento, reduz a resistência das larvas ao estresse térmico^58,interrompe as comunidades microbianas associadas^21,e causa necrose do tecido. Além disso, dispersantes químicos, uma técnica de remediação de óleo comumente usada por empresas petrolíferas para corrigir derramamentos, são ainda mais tóxicos para os corais do que o próprio óleo²³. Microorganismos benéficos isolados de corais, em contraste, são conhecidos por desempenhar papéis cruciais na saúde do hospedeiro. No entanto, a manipulação desses probióticos potenciais deve ser melhor explorada, a fim de investigar possíveis efeitos colaterais negativos e as capacidades metabólicas que podem ser rastreadas para melhorar a aptidão do metaorganismo. Neste contexto, características como a atividade antimicrobiana contra patógenos corais, a produção de catalase para combater o estresse oxidativo, a capacidade de degradar a urea (que pode ter papéis importantes no processo de calcificação) e a presença de genes que conferem potenciais características benéficas, entre outras, deve ser o foco da investigação. Aqui, mostramos como a bioremediação e os probióticos podem ser usados para mitigar concomitantemente os impactos da poluição e melhorar a saúde dos corais. O desenvolvimento de abordagens inovadoras que podem ser usadas como intervenções para aumentar a persistência de espécies marinhas representa um passo em direção a um planeta mais sustentável e saudável.

Protocol

1. Coleta e armazenamento de água e corais para isolamento microbiano

NOTA: É essencial tomar as coordenadas e a temperatura dos locais de amostragem. Se possível, metadados como salinidade, pH, profundidade e intensidade de luz também podem ajudar a encontrar abordagens de cultivo afinadas e interpretação futura dos dados. Para obter resultados confiáveis, mantenha as amostras armazenadas pelo período mínimo possível. Os microbiomas de água/coral podem mudar consideravelmente se as amostras não forem mantidas na temperatura certa e/ou forem armazenadas por longos períodos. Se a etapa de isolamento não for realizada instantaneamente após a coleta, é crucial manter amostras a 4 °C até o processamento. Quanto mais tempo as amostras forem armazenadas, mesmo a 4 °C, mais a comunidade microbiana mudará.

1. Prove e armazene a água do mar.
   1. Coletar 500 amostras de mL de água em pelo menos triplicado de cada local de amostragem alvo. De preferência, use garrafas estéreis com tampas de rosca.
   2. Se processar a água instantaneamente após a coleta, mantenha as garrafas no RT por um curto intervalo. Se o processamento de amostras estiver acontecendo mais tarde, mantenha as garrafas a 4 °C.
2. Prove e guarde o coral.
   1. Use um par estéril de alicates para cortar fragmentos de corais do mesmo local de amostragem das amostras de água. Para evitar a contaminação, toque corais apenas com luvas estéreis.
   2. Lave o fragmento de coral amostrado usando a solução soro fina estéril do soro -sânse (3% NaCl na água destilada) ou na água do mar artificial para começ livrada das bactérias livre-vivas frouxamente unidas do seawater.
   3. Usando fórceps, coloque cada fragmento de coral em um recipiente estéril de 250 a 500 mL com uma tampa de rosca contendo solução sorino estéril.
   4. No laboratório, usando fórceps e alicates estéreis, pesa 5 g de fragmentos de corais usando pratos estérils de Petri de 100 mm x 20 mm em uma escala de pesagem.
   5. Transfira o 5g de amostra de coral para uma argamassa estéril e macerar-lo usando um pilão estéril.
   6. Usando uma espátula estéril, transfira a amostra macerada para um frasco de cultura estéril contendo 45 mL de solução estéril naCl de 3% e 10 a 15 contas de vidro de 5 mm. Use algumas das soluções sais estéreis de 45 mL para lavar a argamassa e recuperar a quantidade máxima do macerado.
   7. Mantenha os frascos agitação constante (150 x g)por 16 h na temperatura da água do local da amostragem.
      NOTA: Para corais de águas rasas, a temperatura ideal variará de 24 a 28 °C. Esta etapa irá separar microorganismos de diferentes compartimentos de coral, como os ligados às células hospedeiras, ou os que vivem dentro do tecido e do esqueleto. Após esta etapa, os macerados corais não devem ser armazenados, e a etapa da isolação deve imediatamente ser executada.

2. Isolamento de bactérias degradantes de EE2 da água do mar e/ou corais

1. Selecione bactérias.
   NOTA: Após os passos 1.1.2 e 1.2.7, a concentração de microorganismos na água do mar que se separaram dos diferentes macerates de corais será desconhecida e variável. A fim de garantir o isolamento de colônias microbianas individuais em placas de Petri contendo mídia ágara, diluições em série são necessárias.
   1. Realize diluições em série de até^10-9 em solução sisina estéril para amostras de corais e até^10-6 para amostras de água. Diluições pipette para cima e para baixo 5x antes de descartar a ponta. Vortex amostras para 5 s cada vez antes de realizar a próxima diluição em série.
   2. Pipette 100 μL de cada diluição em placas de Petri contendo 3% de caldo de lysogeny NaCl (LB) médio ágar, e placa-los.
      NOTA: Use ágar marinho (MA) como um meio alternativo. Triplicados de cada diluição são necessários para resultados confiáveis.
   3. Incubar as placas por 1 a 3 dias na temperatura alvo (por exemplo, 26 °C). Verifique os pratos uma vez por dia.
   4. Selecione e isole as colônias que apresentam morfologias distintas do crescimento em placas novas usando a técnica da placa da raia. Repita este passo quantas vezes for necessário para ter colônias puras crescendo nas placas.
   5. Se o procedimento não for imediatamente continuado a pisar 2.3.1, armazenar isola a 4 °C ou em glicerol, conforme descrito na seção 2.2.
2. Prepare os estoques de glicerol.
   NOTA: Esta etapa é opcional e pode ser usada para o armazenamento de estoques bacterianos a longo prazo.
   1. Escolha colônias individuais da placa fresca ou das placas armazenadas a 4 °C e inocule-as de forma independente em 2 mL de meio LB estéril.
   2. Coloque os tubos em constante agitação (150 x g)a 24 a 28 °C durante a noite (ON).
   3. Adicione 1 mL das culturas bacterianas do passo 2.2.2 e glicerol estéreo a uma concentração final de 20% aos 2 mL crioviais.
   4. Deixe os crioviais em 4 °C.
   5. Coloque os estoques bacterianos de glicerol em -80 °C até que seja necessário.
3. Realize o teste de habilidade de degradação do EE2.
   1. Ativar os isolados em caldo LB ou mídia alternativa. Para isso, escolha uma única colônia das placas frescas ou da placa armazenada a 4 °C e inocule 2 mL de meio LB estéril. No caso de ser um estoque de glicerol, primeira raia-lo em placas de ágar LB e incubar a 24-28 ° C ON para ter colônias individuais crescendo. Coloque o tubo contendo LB médio inclinado agitação constante (150 x g)em 24-28 °C ON.
   2. Após o crescimento bacteriano, pelotas as células por centrífuga-los em 8.000 x g para 8 min à temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatant e, delicadamente tubulação para cima e para baixo, resuspender as células em um volume igual (2 mL) de água shinhosa para lavar o caldo LB restante.
   3. Repita o passo 2.3.2 duas vezes para garantir que não há vestígios de fonte de carbono, resuspendendo as células em um volume igual de solução salina. Por exemplo, se foi iniciado com uma cultura de 2 mL, resuspender as células em um volume final de 2 mL solução saline.
   4. Inocular as células lavadas e resuspensas no mínimo Bushnell Haas meio de cultura (CALdo BH) contendo EE2 como a única fonte de carbono⁵⁹.
      NOTA: EE2 é dissolvido em etanol em uma concentração final de 5 mg/L no meio da cultura. Faça alterações no tipo de poluente e/ou concentração, se necessário.
   5. Avalie o crescimento bacteriano por densidade óptica em 600 nm e/ou colônias formando unidades (CFU) no lb ágar médio³³, para 16-72 h de incubação.
      NOTA: Alternativamente, os microorganismos podem ser diretamente isolados em meios mínimos contendo EE2, ou outros compostos, como a única fonte de carbono. Esta etapa dirigiria a seleção e evitaria o crescimento indesejável.

3. Isolamento de bactérias que degradam o petróleo da água do mar e/ou corais

1. Prepare a mídia mínima contendo uma fração solúvel em água de óleo (oWSF) e fração insolúvel em água de óleo (oWIF) como a única fonte de carbono²¹.
   1. Adicione 1 a 2% de petróleo bruto a 500 mL de água destilada estéril. Use um frasco de filtro aberto na parte inferior para tirar a fração solúvel sem perturbar a camada superior da fração insolúvel.
   2. Mantenha a mistura agitação constante em 24-28 °C a 150 x g por 48 h.
   3. Coloque o frasco de filtro contendo as frações de petróleo bruto em uma superfície estável e espere 10 a 20 min para permitir a separação de fração solúvel e insolúvel.
   4. Transfira o oWSF para um novo frasco estéril, salvando o oWIF abrindo o frasco de filtro inferior e tirando a fração solúvel.
   5. Usando todo o oWSF recuperado na etapa precedente (~400 mL), prepare 1 L do meio mínimo do agar de BH que contem oWSF como a única fonte de carbono.
   6. Usando o oWIF restante no frasco da etapa 3.1.4, prepare 1 L do meio mínimo do agar de BH que contem oWIF como a única fonte de carbono.
2. Isolar bactérias oWSF e oWIF-degradantes.
   1. Usando água e coral macerar a partir dos passos 1.1.2 e 1.2.7, respectivamente, diluir as amostras até^10-6 em solução salina estéril, conforme descrito na etapa 2.1.1.
   2. Pipette 100 μL de cada diluição em placas de Petri contendo BH-oWSF e BH-oWIF agar media e placa-los.
   3. Repita os procedimentos descritos do passo 2.1.3 para o passo 2.1.5.

4. Seleção de membros do consórcio

1. Extraia e sequencie o DNA para identificação taxonômica.
   1. Ative os isolados estocados em glicerol, conforme descrito na etapa 2.3.1.
   2. Extraia o DNA usando um kit de extração de DNA (ver Tabela de Materiais).
   3. Use primers 27f (5′-AGA GTT TGA TGA TGG CTC AG-3′) e 1492r (5′-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) para amplificação do gene rRNA 16S.
   4. Realize 50 μL PCR reações de acordo com o seguinte protocolo: 5 μL de 10x polymerase buffer, 2 mM MgCl_2,0,2 mM dNTPs, 5 mM de cada cartilha, 10 ng de DNA genômico e 2,5 U de Taq DNA polymerase. Adicionar controles negativos (ou seja, extrações de DNA em branco e reações pcr sem dna modelo) para garantir que não haja contaminação.
   5. Configure os seguintes passos de ciclismo térmico: um primeiro ciclo de desnaturação a 94 °C por 4 min; 35 ciclos a 94 °C por 1 min, seguidos por 50 °C por 1 min e 72 °C por 2,5 min; um ciclo de extensão final de 10 min a 72 °C.
   6. Verifique a integridade amplicon em 1,2% de gel agarose usando 80 V.
   7. Gel purificar as amostras usando um kit de purificação de gel (ver Tabela de Materiais).
   8. Quantificar os produtos PCR usando um flódromo.
   9. Envie o produto para sequenciamento.
      NOTA: Para melhores classificações taxonômicas, o método Sanger é recomendado^60,porque fornece longas seqüências. As primers universais 27f e 1492r podem ser usadas para amplificar quase todo o comprimento do gene rRNA 16S⁶¹. Se os contigs não puderem ser montados usando um par de primers, um par extra no meio da seqüência deve ser considerado.
2. Determinar a curva de crescimento.
   1. Ative os isolados em estoques de glicerol a partir do passo 2.2.5 como descrito na etapa 2.3.1 mas usando 5 mL em vez de 2 mL.
   2. Adicionar 1% (v/v) da cultura cultivada 5 mL a partir do passo 4.2.1 em triplicados, para um frasco de 250 mL contendo 100 mL de 3% LB mídia. Certifique-se de preparar triplicados de um controle negativo (sem inóculo) também.
   3. Coloque os frascos em uma incubadora em constante agitação (150 x g)a 24 a 28 °C.
   4. Tome 1 mL aliquots cada 4 h para 48 h. Se as cepas apresentarem uma alta taxa de crescimento, diminua o intervalo de 4 h.
   5. Medir a estimativa de densidade óptica (OD) em 600 nm comprimento de onda e unidades formadoras de colônias (CFU) contadas a partir de diluições em série banhadas em placas de mídia ricas (100 μL devem ser inoculadas em cada placa e normalizadas para o volume de 1 mL).
   6. Trace as curvas de OD e CFU e analise a correlação de OD/CFU de cada cepa individual. A partir de agora, calcule o número de células com base nos valores do OD.
3. Realizar teste de antagonismo.
   1. Ative os isolados, conforme descrito na etapa 2.3.1.
   2. Inocular uma cepa de cada vez ao longo do meio de placas contendo mídia ágar e os outros perpendiculares ao central. Repita até que cada cepa microbiana selecionada seja testada contra todas as outras.
   3. Incubar as placas a 24 a 28°C e monitorá-las diariamente para observar potenciais halos indicando atividade antagônica. Se os halos são observados indicando atividade antagônica entre duas cepas, uma delas deve ser excluída.
4. Realizar a montagem do consórcio.
   1. Ative os isolados, conforme descrito na etapa 2.3.1.
   2. Pelotas as células em 3.500 x g e lave-os suavemente 2x em um volume igual de solução shinhosa. Resuspenda as células em um volume igual (ou seja, se o volume final foi de 2 mL de células, lave-as usando 2 mL de solução sorino e resuspendê-las em um volume final de 2 mL).
   3. Inocular 1 mL cultura em 100 mL 3% NaCl LB médio e incubar ON em 150 x g.
   4. Repita o passo 4.5.2, inocule os 100 mL cultivados, lavados e resuspendidos culturas em culturas 10 L. Incubar ON em biorreatores estéreis de ar-elevador, recebendo ar filtrado de uma bomba. Se for necessária mais cultura, inocular sempre 1% da cultura adulta em novas mídias.
   5. Centrífugas cultivadas culturas em 8.000 x g para 8 min em 4 °C. Descarte supernatant após centrífuga.
   6. Lave a pelota, resuspendendo delicadamente as pilhas em 500 mL da solução shinhoe estéril.
   7. Repita os passos 4,5,5 e 4,5,6.
   8. Resuspenda cada cultura individual em 100 mL de solução saline e mede o OD para estimar o número de células.
   9. Calcule o volume de cada cultura necessária para atingir uma concentração final de 10⁷ células mL^-1.
   10. Realizar CFU conta com mídia rica para uma confirmação final de viabilidade celular e concentração.
   11. Misture um volume igual de cada cultura individual em frascos estéreis e aquot o consórcio em tubos estéreis de 50 mL.
   12. Mantenha-se em 4 °C até a inoculação.
       NOTA: Prepare a montagem do consórcio o mais fresco possível para garantir que as células ainda serão viáveis. Alternativamente, as contagens de CFU podem ser realizadas antes da inoculação. Para montar um consórcio ideal, é necessário usar isolados apresentando diferentes e complementares capacidades metabólicas. Normalmente, 6 a 10 isolados são usados para formar consórcios, mas esse número variará dependendo das características e propósitos dos membros.

5. Detecção de características benéficas putativas para corais

1. Ative os isolados dos estoques de glicerol, estrias-los em placas de ágar LB e incubar-los em 24-28 °C ON para ter colônias individuais crescendo. Escolha uma única colônia das placas e inocule-a em 2 mL do meio estéril do LB. Coloque o tubo contendo lb médio inclinado agitação constante (150 x g)em 24-28 °C ON.
2. Realize a extração de DNA descrita na seção 4.1 para detecção de genes potencialmente benéficos por PCR.
   NOTA: As condições de reação pcr e primers vai depender do gene alvo. Metodologias para testar características BMC de cepas individuais e detecção de PCR para genes potencialmente benéficos são descritas na Tabela 1.

Results

Com base nos métodos descritos aqui, foi possível isolar microorganismos de diferentes fontes de água e nubbins de corais apresentando características putativas de BMC e capazes de degradar diferentes classes de contaminantes (Figura 1). Utilizando amostras de água coletadas em uma estação de tratamento de esgoto, obtidas da CESA-UFRJ (Centro Experimental de Saneamento Ambiental da Universidade Federal do Rio de Janeiro), e com base no procedimento apresentado aqui, 33 cepas bacterianas capazes de degradar o EE2 uma concentração final de 5mg/L foram isoladas(Figura 2A). Além disso, usando a técnica para a seleção de bactérias degradantes de óleo, 20 cepas capazes de degradar tanto oWSF (Figura 2B) e oWIF (Figura 2C)foram isoladas.

Características putativas de BMC foram selecionadas em microorganismos isolados de diferentes espécies de corais diversas condições. Entre eles, uma cepa que apresenta forte atividade antagônica contra o patógeno coral Vibrio coralliilyticus (Figura 3A),cepas capazes de degradar a ureia (Figura 3B), um bom produtor catalase (Figura 3 C),e microorganismos apresentando genes potencialmente benéficos(Figura 3D)foram encontrados.

Empregando as duas abordagens combinadas (ou seja, bioremediação e inoculação BMC), foi possível proteger os corais dos impactos da exposição ao petróleo. Para isso, um consórcio de biomídia de petróleo pBMC, isolado do coral Mussismilia harttii,foi inoculado em nubbins de coral expostos a 1% de óleo em^{triplicados 21}. Os tratamentos expostos ao óleo apresentaram diminuição progressiva da Fv/Fm a partir do quarto dia, atingindo valores próximos de zero até o décimo dia. Fluorescência variável/fluorescência máxima (Fv/Fm) forneceu uma medida de eficiência fotoquímica máxima do sistema fotológico II (PSII) das zooxanthellae, representando uma medida indireta da saúde dos corais. Por outro lado, os nubbins de coral presentes nos aquários inoculados com o consórcio mostraram uma capacidade fotoquímica mais bem preservada (Figura 4).

Figura 1: Resumo dos principais passos de uma seleção e montagem do consórcio bioremediador-pBMC. Esquema de degradantes de poluentes microrganismos etapas de seleção (em cinza) e etapas finais utilizadas para a seleção microbiana do consórcio (sequenciamento de DNA, curva de crescimento, teste de antagonismo e montagem de consórcio em vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Seleção de bactérias degradantes de poluentes. (A)Isolados bacterianos que crescem em placas mínimas de mídia contendo EE2 como a única fonte de carbono. (B) Colônias de bactérias que crescem em placas de mídia mínimas contendo oWSF como a única fonte de carbono. (C)Colônias de bactérias que crescem em placas de mídia mínimas contendo oWIF como a única fonte de carbono. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: Detecção de características do pBMC. (A) Manchas em triplicados de cepa apresentando atividade antagônica contra o patógeno coral Vibrio coralliilyticus (em preto) e uma cepa de controle (em verde). Tensõesque crescem na mídia contendo urea como a única fonte de carbono. (C)Tensão produzindo catalase (+) e uma estirpe produtor catalase ruim (-). (D)Exemplo de detecção de PCR do gene nirK (pista 1 = escada 1kb; pista 2 = controle negativo de extração de DNA em branco; pista 3 = detecção de nirK; pista 4 = reações pcr sem DNA modelo). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Fv/Fm medições de M. harttii nubbins dark-adapted at 5 PM, using a diving-PAM chlorophyll fluorometer. As medições fv/fm do consórcio de controle de tratamentos, petróleo e petróleo com consórcio foram realizadas em triplicados todos os dias durante 10 dias. O desvio padrão é mostrado. As características do gráfico foram modificadas com permissão dos resultados anteriores^21,disponíveis em https://www.nature.com/articles/srep18268 uma atribuição Creative Commons 4.0. Termos completos em http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Moa	Microorganismo	Técnica de detecção	Referências
Regulamentação climática; surfur ciclismo; compostos antimicrobianos; aumentar a proteção antioxidante das células.	Aspergillus sydowii Aspergillus sydowii	PCR para gene dddP	81
	Pseudovibrio sp. P12	Meio de cultura com DMSP	82
	Pseudoalteromonas sp.	PCR para o gene dmdA	33
Regulação biológica de patógenos.	Microbioma do muco do palmata de Acropora	Zona clara de inibição	83
	Extratos de corais	Ensaio de inibição do crescimento	84
	Marinobacter sp.	Swarming ensaios	85
	Pseudoalteromonas sp.	Placa de ágar cruz-estrias	86
	Pseudoalteromonas sp.	Método de difusão de ágar	33
Benefício para o processo de calcificação; fonte de nitrogênio para corais scleractinian.	Symbiodinium spp.	Método colorimétrico	87
	Microbioma do muco de Stylophora pistillata	___	88
	Microbioma da Acropora alciminata	Método por Bolland et al.80	89
Ciclo de nitrogênio; aumentar a fixação de nitrogênio.	Comunidade microbiana	qPCR QPCR	90
	Comunidade microbiana	Pcr	91
	Comunidade microbiana	qPCR QPCR	92
	Comunidade microbiana	Técnica de redução de acetileno adaptado (C2H2)	93
	Pseudoalteromonas sp. e Halomonas taeanensis	Pcr	33
Ciclo de nitrogênio; diminuição da concentração de amônio.	Pseudoalteromonas sp.	Pcr	33
	Microbioma de Tubastraea coccinea	Pcr	94
	Microbioma de Xestospongia testudinaria	Análise preditiva do metagenoma	95
Proteção holobionte contra espécies reativas de oxigênio (ROS).	Pseudoalteromonas sp., Marina de Cobetia e Halomonas taeanensis	Teste catalase	33
	Symbiodinium spp.	Amplex vermelho	96
	Vibrio pelagius e Sync-chococcus sp.	Método de peroxidase-escopoletin a rábano	97
	Vibrio Fischeri Vibrio fischeri	Múltiplos métodos	98

Tabela 1: Detecção de características putativas de BMC, mecanismo de ação (MOA), microorganismos relatados apresentando o potencial e a técnica utilizada s detectando a característica.

Discussion

As abordagens de bioremediação têm sido exploradas maciçamente nos últimos 50 anos. Por exemplo, mais de 200 micróbios entre bactérias, cianobactérias, microalgas e fungos em vários habitats diferentes, foram designados como capazes de indicar a presença e/ou degradar hidrocarbonetos de petróleo^62,63,64 . Além disso, outras classes de compostos que causam impactos ao meio ambiente e aos seres humanos, como plástico, bisfenol A, desreguladores endócrinos e metais pesados, são alvos para o desenvolvimento da técnica de bioremediação^{65,66, 67.} Por outro lado, o desenvolvimento probiótico marinho tem sido limitado aos campos que têm um impacto óbvio sobre a economia, como probióticos de peixes na aquicultura^68,69. No entanto, o isolamento e caracterização de microrganismos benéficos para proteger os recifes de coral, ecossistemas marinhos que apoiam a pesca, o turismo e outras atividades lucrativas, estão começando a ser valorizados¹⁵. Aqui, um protocolo barato, fácil e acessível para selecionar microorganismos que degradam poluentes que também podem apresentar características potencialmente benéficas para os ecossistemas marinhos locais, especialmente microorganismos benéficos para corais (pBMCs), é Descrito.

Além disso, o método demonstrado aqui é altamente adaptável a vários compostos e diversos tipos de fontes microbianas. É possível visar diferentes poluentes, substituindo a única fonte de carbono adicionada aos meios de comunicação mínimos. Para isso, em vez de óleo ou EE2, outros compostos devem ser adicionados na concentração desejada. Esta seria a pressão seletiva para isolar degraders para os poluentes alvejados. Por exemplo, microorganismos capazes de degradar outras classes de desreguladores endócrinos já foram selecionados e testados usando a mesma metodologia^70. Além disso, outros organismos marinhos e terrestres, como esponjas e plantas^71,72,bem como tipos distintos de amostras ambientais, como solo, combustível e rochas podem ser usados como as fontes degradantes microbianas^{25, 73,74.} Por exemplo, foi possível detectar e isolar bactérias degradantes de hidrocarbonetos de diferentes amostras de solo e sedimentos^{25,54,63,64,75.} Finalmente, realizando pequenas modificações na mídia, microorganismos que não sejam bactérias podem ser facilmente selecionados como micróbios degradantes. Por exemplo, uma cepa de microalgas com a capacidade de degradar eficientemente compostos de estrogênio foi relatado⁷⁶.

Idealmente, consórcios bioremediação-probióticos devem ser montados para cada composto ou área específica. Micróbios que crescem em um ambiente específico podem não crescer tão bem em novos locais em comparação com suas condições nativas. Como os pesquisadores não encontraram um produto que possa ser aplicado de forma eficiente em todas as diferentes condições ambientais, a nova montagem de consórcios deve ser realizada para cada situação específica. Isso seria semelhante à medicina personalizada para recuperação adaptada ao meio ambiente. Por esta razão, a criação de um banco central de cepas microbianas com potenciais características probióticas e capacidade de degradação é um passo crucial para o progresso deste campo. Esta iniciativa pouparia tempo e trabalho, contribuindo para a montagem de novos consórcios específicos em todo o mundo.

Microorganismos associados a corais (ou seja, microalgas, bactérias, arqueias, fungos e vírus) têm um papel complexo e intrincado na manutenção da homeostase hospedeira¹⁹. Estressores ambientais, como a poluição, também podem desestabilizar o microbioma coral, resultando em disbiose, que pode causar doenças e mortalidade^30. Os mecanismos pelos quais o microbioma coral pode suportar a saúde dos corais estão começando a ser revelados. Esses mecanismos são a chave para a compreensão da resistência e resiliência dos corais aos estressores ambientais e, consequentemente, para promover a persistência e preservação dos recifes. Além disso, os achados na área ajudarão a entender as interações gerais de hospedeiro-microbioma, o que pode contribuir para o desenvolvimento de melhores probióticos e estratégias de promoção da saúde em outras áreas. Também é importante investigar melhor como essas inoculações de probióticos podem interferir na saúde do metaorganismo durante eventos de estresse. Por exemplo, o trabalho que mostra que o aumento no desempenho coral é devido aos probióticos e não simplesmente o coral usando bactérias como uma fonte de alimento é ainda necessário.

Paralelamente, o desenvolvimento de novas abordagens de entrega de consórcios e a melhoria dos já existentes são de grande importância. Métodos alternativos para a imobilização de consórcios, bem como abordagens inovadoras, como a inoculação de alimentos de coral (ou seja, artemia e rotifers) e usá-los como vetores, são promissores. Estes sistemas de entrega também podem ser modificados para atingir outros organismos marinhos e serão essenciais para o sucesso do campo dos probióticos marinhos.

Mitigação da poluição e persistência de recifes de coral são atualmente dois dos principais tópicos destacados em conferências ambientais regularmente. A Agenda 2030, um documento publicado pelas Nações Unidas que descreve os objetivos globais que a sociedade deve alcançar para permitir um futuro sustentável, dedica metas específicas para cada questão. Enquanto a Meta 6 destaca a importância da melhoria da qualidade da água, reduzindo a poluição, o Objetivo 14 reforça a relevância da conservação e do uso sustentável dos oceanos, mares e recursos marinhos^77. Neste contexto, a conservação dos recifes de coral depende de mudanças que devem ser alcançadas em um futuro próximo, incluindo a mitigação da poluição. Isto é de grande importância, porque a maioria das perdas maciças de corais ocorreu quando outros fatores foram adicionados aos eventos climáticos, como a destruição do habitat local e contaminação^78,79. Este artigo demonstrou que é possível combinar bioremediação e inoculação de pBMC para degradar poluentes específicos, enquanto pode aumentar a resistência e a resiliência dos corais para lidar com poluentes e outras questões. A otimização dos protocolos existentes e/ou o desenvolvimento de métodos inovadores, combinados ou aplicados de forma independente, será crucial para determinar o futuro dos ecossistemas marinhos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Garrafa de Armazenamento de Mídia PYREX de 500 mL	thomas scientific/Corning	1743E20/1395-500	Usada para amostragem de água.
Garrafas de Aspirador de 500 mL	thomas scientific/Corning	1234B28/1220-2X	Usado para separar as frações de óleo.
Alicate de corte de fio de 6 polegadas	thomas scientific/Restek	1173Y64/23033	Usado para cortar fragmentos de coral.
17a-Etinilestradiol	LGC Padrões	DRE-C13245100	Usado como a única fonte de carbono para fazer o meio seletivo.
Agar	Himedia	PCT0901-1KG	Usado para fazer mídia sólida.
Caldo Bushnell	Haas Himedia	M350-500G	Usado como meio mínimo para ser suplementado com fontes de carbono.
Frasco Erlenmeyer	Thomas Scientific/DWK Life Sciences (Kimble)	4882H35/26500-125	Usado para incubar coral macerado com contas de vidro.
Kit de purificação de DNA e banda de gel GFX PCR	GE Healthcare	28903470	Usado para purificar produtos de PCR antes de enviá-los para sequenciamento.
Contas de vidro	MP Biomedicals	1177Q81 / 07DP1070	Usado para separar os microrganismos das estruturas de coral.
		de fluxo laminar	Necessário para trabalhar em condições estéreis.
Caldo Luria Bertani, Miller (Caldo Miller Luria Bertani)	Himedia	M1245-1KG	Usado como meio rico para cultivar bactérias.
Ágar marinho 2216 (ágar marinho Zobell)	Himedia	M384-500G	Usado como meio rico para cultivar bactérias.
		Orbital-Shaker	Usado para incubar meios líquidos e óleo.
Incubadora			Usado para incubar placas.
Almofariz e pilão de porcelana	Thomas scientific/United Scientific Supplies	1201U69/JMD150	Usado para macerar fragmentos de coral.
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen		Usado para quantificação de ácidos nucleicos de produtos de DNA e PCR.
Centrífuga			Usado para centrifugar culturas bacterianas.
Espectrofotômetro			Usado para medir a densidade óptica de culturas bacterianas.
Kit de purificação de DNA genômico	Wizard Promega	A1120	Usado para extração de DNA de cepas microbianas.