Padronizar um método não letal para caracterizar o estado reprodutivo e o desenvolvimento larval de mexilhões de água doce (Bivalvia: Unionida)

Summary

A conservação do mexilhão de água doce depende do monitoramento de padrões reprodutivos e processos de espécies. Este estudo padroniza um protocolo não letal para amostragem de conteúdo de brânquias, caracterizando o desenvolvimento larval e fornecendo um repositório digital para os dados coletados. Este pacote de protocolo-banco de dados será uma ferramenta importante para pesquisadores de mexilhão na recuperação de espécies imperadas.

Abstract

Monitorar ativamente o tempo, o desenvolvimento e os padrões reprodutivos de espécies ameaçadas de extinção é fundamental quando se gerencia para a recuperação da população. Os mexilhões de água doce estão entre os organismos mais imperados do mundo, mas as informações sobre o desenvolvimento larval precoce (glochidial) e períodos de ninhada ainda faltam para muitas espécies. Estudos prévios centraram-se no estágio de história de vida complexa quando os mexilhões femininos estão prontos para parasitar peixes hospedeiros, mas poucos estudos têm se concentrado no período de ninhamento e no tempo de desenvolvimento larval. O protocolo aqui descrito permite que os pesquisadores avaliem não-letalmente o estado de gravidez para os mexilhões femininos. Os resultados deste estudo mostram que este método não afeta a habilidade de um mexilhão fêmea de permanecer gravid ou se tornar gravid outra vez após a amostragem foi executada. A vantagem deste método pode permitir seu uso em espécies ameaçadas ou ameaçadas de extinção federalmente ou outras populações de alta preocupação de conservação. Este protocolo pode ser adaptado para uso em indivíduos preservados ou vivos e foi testado em uma variedade de espécies de mexilhões. A base de dados fornecida é um repositório para uma amplitude da informação no sincronismo de hábitos reprodutivos e facilitará a pesquisa futura do mexilhão de água doce, a conservação, e os esforços da recuperação.

Introduction

A persistência de populações em sistemas de água doce depende do sucesso da reprodução e do recrutamento. Para organismos parasitários, identificar os meandros do ciclo de vida (por exemplo, estágios de desenvolvimento larval e estratégias de atração de acolhimento) pode dar uma visão sobre os hábitos reprodutivos de um organismo e os processos críticos que influenciam o recrutamento. Tal informação torna-se importante quando as espécies são imperiled, e o recrutamento bem sucedido é necessário para sustentar populações permanecendo, ou se a recuperação necessitar o uso da propagação cativa para restabelecer populações extirpated.

Mexilhões de água doce (Bivalvia: unionida) são considerados um dos grupos mais imperados de organismos em todo o mundo e uma compilação de hábitos reprodutivos específicos de espécies poderia ajudar nos^{esforços de pesquisa 1,2,3 ,4,5}. Com mais de 800 espécies atualmente reconhecidas distribuídas em todo o mundo, os mexilhões de água doce têm hotspots de diversidade na América do Norte e do Sul, e sudeste da Ásia, mas a informação essencial da história de vida é desconhecida para muitas espécies^{2, 5,6,7}. As famílias dentro desta ordem caracterizam-se por ter estágios larvais parasitários que completam a metamorfose em juvenis de vida livre durante o apego a um hospedeiro^7,8. Esta fase de história de vida única contribui para a biodiversidade em sistemas de água doce, que estão atualmente em crise⁹. Altos níveis de imperilment podem ser atribuídos a muitas ameaças antropogênicas, incluindo poluição de vias navegáveis, alteração de habitat e destruição, reduções na abundância e diversidade de peixes hospedeiros, e introdução de espécies invasoras^1, a ¹⁰. Como alimentadores de filtro bentônicos, mexilhões toca no substrato e são suscetíveis a contaminantes e poluentes que drenam para a bacia hidrográfica¹¹. A recuperação de espécies de mexilhões é pertinente, pois proporcionam uma ampla variedade de serviços ecossistêmicos, incluindo sequestro de carbono, fonte de alimento e purificação de água por filtro de alimentação¹¹. Além disso, os mexilhões foram encontrados para indicar a saúde do ecossistema, promover a biodiversidade e, por sua vez, aumentar a resiliência de um ecossistema¹².

Muitos estudos de mexilhão de água doce têm focado na investigação de requisitos de história de vida precoce para melhor informar as avaliações de status de espécies e estratégias de gestão. As famílias de mexilhões de água doce relevantes para este estudo (por exemplo, Hyriidae, Margaritiferidae, Unionidae) têm uma estratégia de história de vida única, onde fêmeas ninhada larvas (glochidia) em suas guelras marsupiais⁸. Através de uma variedade de estratégias, o mexilhão fêmea expele a glochidia madura das guelras marsupiais para parasitar um hospedeiro vertebrado com glochidia¹³. A pesquisa sobre o desenvolvimento glochidial dentro das brânquias foi modificada a partir de uma técnica utilizando seringas hipodérmicas para amostra de fluido gonadal de mexilhões vivos e avaliar a produção de gametas^14,15,16. Como os pesquisadores validaram essa metodologia não letal para a amostragem de gônada, ela foi adaptada para amostragem de marsupial para avaliar o desenvolvimento de ninhada^15,16. Desenvolvimento de ninhada pode ser usado para decifrar as relações filogenéticas como algumas espécies de mexilhão pode ninhada glochidia em apenas as duas guelras exteriores (ectobranchus), apenas as duas brânquias internas (endobranchus), ou em todas as quatro brânquias (tetrabranchus), mas esta característica não é conhecida por cada espécie¹⁷. Os testes padrões de brooding foram usados previamente para classificar espécies do mexilhão por se os mexilhões fêmeas ninhada glochidia sobre o inverno (bradytictic) ou por um curto período no verão (tachytictic)¹⁸. O excesso de invernada de ninhadas do mexilhão foi apoiado quando o ciclo reprodutivo de anodonta foi estudado¹⁹. No entanto, a biologia reprodutiva básica foi estudada mais detalhadamente ao longo dos anos e constatou que essa dicotomia foi uma generalização bruta e períodos de brotamento de algumas espécies são muito mais complexos do que originalmente presumidos^20,21. Por exemplo, espécies do gênero hyridella (família Hyriidae), glebula e Elliptio (família Unionidae) têm sido observadas com mais de três ninhadas por época de reprodução^22,23, a ²⁴. A complexidade das espécies específicas, e às vezes até²⁰específicas da população, os hábitos reprodutivos levaram a uma lacuna no conhecimento sobre o tempo e a duração da ninhada, e o número de ninhadas que um mexilhão feminino pode produzir.

Embora as seringas hipodérmicas tenham sido usadas para extrair o conteúdo de brânquia, relatar os resultados é complicado devido à falta de padronização para garantir resultados comparáveis em todos os estudos. Anteriormente, quatro estágios de desenvolvimento de glochidia (ou seja, ovo, embrião, imaturo, totalmente desenvolvido) foram identificados em Unionidae, mas não foram adotados no procedimento padrão^16,25,26. Outros estudos observando membros de Margaritiferidae substituíram a classificação de ' glochidia imaturo ' com ' desenvolvimento de glochidia ', levando à confusão potencial^27,28. A falta de consistência na caracterização das diferentes fases de desenvolvimento larval deixou muitos pesquisadores descreverem, em geral, as fêmeas ninhadas como ' gravid ', o que não abrange os meandros do desenvolvimento larval. Estudos de história de vida realizando testes de hospedeiro-peixe têm priorizado a necessidade de fêmeas gravid com glochidia totalmente desenvolvida, mas esta informação está dispersa em toda a literatura publicada e inédita^29,30. Atualmente, faltam dados sobre os hábitos reprodutivos de muitas espécies de mexilhões, incluindo o momento da transição entre o ovo, a glochidia imaturo e a glochidia totalmente desenvolvida, prontas para o apego aos hospedeiros. Para a maioria das espécies, não está claro quanto tempo as fêmeas ninhada glochidia e como rapidamente fertilizado ovos desenvolver plenamente. As lacunas de conhecimento são muitas vezes mais amplas para as espécies de preocupação de conservação, que apresenta a necessidade de um método padronizado de extração de conteúdo de brânquias que foi testado para efeitos não-letais e pode ser promovido à comunidade científica para complementar metodologias de coleta de dados mainstream, sem uma ameaça para as populações protegidas^24,31,32.

Este estudo teve três objetivos: 1) formalizar uma técnica de amostragem de brânquias e testá-la para efeitos letais e não letais em mexilhões femininos in situ, 2) caracterizar diferentes estágios de desenvolvimento glochidial e descrever um método padronizado de identificação e relatórios de vários estágios larvares, e 3) criar um repositório público para os dados recolhidos. Pesquisas de campo, projetos de monitoramento de longo prazo e coleções de museus todos representam oportunidades para o protocolo descrito aqui a ser implementado e dados adicionais a serem coletados para um corpo mais amplo de interesse. O protocolo formalizado inclui visuais e descrições de caracteres para diferenciar cada estágio do desenvolvimento larval. Ao padronar as categorias, os resultados obtidos podem ser comparados entre todas as ocorrências e espécies. Depois que os dados são coletados, todos podem ser submetidos ao almanaque de gravidity de água doce (FMGA), que é um banco de dados para informações gravidity coletadas usando este protocolo. Um produto final para armazenar e compilar todas as informações de gravidity coletadas fornecerá uma ferramenta de pesquisa para facilitar futuros esforços de pesquisa, conservação e recuperação. A incorporação dessa metodologia em vários projetos de mexilhão e a submissão de dados à FMGA expandiriam-se sobre a amplitude do conhecimento sobre o status de gravidez das espécies de mexilhões ao longo do ano. Como um grupo altamente imperiled de organismos, este protocolo e base de dados resultante sobre os hábitos reprodutivos de mexilhões de água doce é essencial para a compreensão da dinâmica populacional e facilitando a conservação destas espécies.

Protocol

1. gravid coleção feminina

Nota: consulte o protocolo de pesquisa de água doce Mussel do Fish and Wildlife Service³³ para obter orientações sobre como examinar adequadamente um local de amostragem para espécies ameaçadas ou ameaçadas de extinção. As licenças federais apropriadas devem ser obtidas antes da coleção do campo de espécies protegidas e das autorizações do estado para todas as espécies atuais.

1. Colete mexilhões vivos do campo usando métodos tátil-visuais (etapa 1,2) ou utilize espécimes preservados de um museu (etapa 1,3).
   Nota: é importante manter os mexilhões vivos frescos e molhados após a coleção para impedir a dessecação e para reduzir o esforço, e a manipulação mínima de mexilhões gravid é importante evitar fêmeas que liberam prematuramente índices da brânquia³⁴.
2. Avalie a gravidez feminina por inspeção visual durante a coleta (por exemplo, presença de atração do manto, conglutinatos, etc.) ou pela inspeção visual após a coleta (por exemplo, curiosos suavemente válvulas abertas o suficiente para olhar para dentro e ver se as brânquias estão infladas, ver Figura 1).
   Nota: as espécies variam em como glochidia são chocada dentro das guelras marsupiais como às vezes apenas as duas guelras exteriores (ectobranchus), apenas as duas brânquias internas (endobranchus), ou todas as quatro guelras (tetragenous) são marsupial¹⁷. O protocolo pode ser pausado aqui, e as fêmeas gravid podem ser transportadas de volta ao laboratório para a amostragem da brânquia.

Figura 1: os indivíduos gentilmente curiosos abrem. Para verificar a gravidez de um mexilhão vivo, levante suavemente as válvulas com os polegares (a) ou use cautelosamente um espéculo ou um alicate reverso para erguer as válvulas (B). Examine a etapa 2,3 no protocolo de precauções associadas a esse método. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Realizar uma inspeção visual em espécimes preservados abrindo as válvulas e inspecionando as brânquias para determinar se o indivíduo é uma fêmea gravid (Figura 2).

Figura 2: como identificar uma fêmea gravid. As brânquias marsupiais do mexilhão fêmea aparecem infladas quando a fêmea é gravid e ninhada. As fotos A e C mostram guelras de uma perspectiva lateral, enquanto as fotos B e D proporcionam uma visão ventral das brânquias. As caixas vermelhas esboçam as guelras para destacar as diferenças entre um gravid (A/B) e não gravid (C/D) feminino Lampsilis straminea Mussel. Os comprimentos totais dos indivíduos são 79 mm (A/B) e 88 mm (C/D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. amostragem de conteúdo de Gill

Nota: Este protocolo pode ser adaptado se a amostragem ocorre em mexilhões vivos no campo e laboratório, ou em espécimes preservados.

1. Prepare um tubo de coleta de microcentrífuga de plástico de 1,5 mL com aproximadamente 1 mL de água estéril se o conteúdo de brânquias for avaliado dentro de 24 h de extração³⁵ ou etanol (EtOH) se a avaliação da amostra não puder ocorrer dentro de 24 h de coleta ou se a Brânquia conteúdo são de um espécime de Museu preservado no EtOH. Se glochidia são destinados para microscópio eletrônico de varredura (SEM) de imagem, use 70% EtOH, e se glochidia será usado para testes genéticos, use não-desnaturado 95% EtOH³⁶.
2. Retire a embalagem de papel para uma agulha de ponta chanfrada estéril de 20 G numa seringa de 10 mL. Desaparafuse a tampa para expor a agulha e prepare um tubo plástico de 1,5 mL para a coleção do índice da brânquia. Empurre a pega da seringa todo o caminho para baixo para que a rolha preta esteja na linha 0 mL/CC.
   Nota: uma seringa estéril deve ser utilizada cada vez que os conteúdos de brânquias são amostrados. Uma seringa usada pode ser esterilizada no campo mergulhando a ponta em uma solução do alvejante de 10%, a seguir enxaguando a seringa enchendo o com 1 mL da água estéril e deprimindo o atuador de volta a 0 mL/CC, e finalmente secando a seringa com um pano limpo.
3. Pegue a fêmea gravid e gentilmente erguer as duas válvulas usando as pontas dos polegares.
   Cuidado: tenha cuidado para não prejudicar o animal. Abrindo as válvulas demasiado largas ou demasiado rápidas pode extrapolar músculos adutor e causar a mortalidade. Espécimes de casca fina (por exemplo, espécies de anodonta, Leptodea, utterbackia, etc.) e indivíduos jovens são especialmente vulneráveis nesta etapa. A manipulação vigorosamente de espécies de casca frágil pode rachar as conchas e causar mortalidade. Em alguns casos, espremendo animais finos descascada das margens do escudo anterior e posterior, enquanto olhando para a superfície ventral, fará com que o escudo flexionar e gape ligeiramente, permitindo que se observe as brânquias ou erguer as conchas e evitar danificar o frágil margem do reservatório.
   Nota: as ferramentas podem ser usadas para ajudar nesta etapa, mas também podem causar mortalidade se não forem usadas com cuidado e devem ser evitadas sempre que possível. Por exemplo, um espéculo ou um conjunto modificado de alicates reversos podem ser usados para ajudar a erguer o indivíduo aberto e uma cunha pode ser usada para ajudar a sustentar as válvulas abertas. Estes instrumentos podem não ser necessários se uma outra pessoa está disponível para ajudar (isto é, uma pessoa prende o animal aberto quando outro manobra a seringa para a extração). Danificar ou separar o tecido do manto do perióstraco pode causar deformidades de crescimento e mortalidade³⁷; Portanto, é fundamental evitar a separação da conexão entre o tecido do manto e a margem externa do reservatório.
4. Use a ponta da agulha da seringa para penetrar suavemente em um único tubo de água da brânquia marsupial inflada. Em seguida, retire suavemente o conteúdo da brânquia, utilizando a ponta chanfrada da agulha.
   Nota: o conteúdo da brânquia geralmente tem uma consistência branco-leitosa, que deve ser visível na ponta chanfrada da agulha.
   1. Deposite o conteúdo da seringa diretamente em uma placa de Petri se um microscópio estiver prontamente disponível. Caso contrário, armazene o conteúdo em um tubo de microcentrífuga de plástico de 1,5 mL com líquido designado (consulte a etapa 2,1) para avaliação posterior.
      Nota: Minimize a perturbação e a manipulação de amostras de glochidia durante o transporte para evitar danos e viabilidade reduzida^32,35.
5. Registre informações sobre a identificação do gênero-espécie, status da gravidez, comprimento do feminino (mm), coletor e informações de contato, estado, concelho, drenagem, localização de coleta específica, latitude e longitude, um identificador único para a Brânquia amostra, um identificador único para o local da pesquisa e a data da coleta, se os conteúdos de brânquias foram extraídos (Figura 3). Registre um identificador exclusivo em cada vaso de coleta para garantir registros de dados precisos durante o transporte.
   1. Fotografe a válvula da parte externa direita do mexilhão para a validação da identidade e inclua o tubo etiquetado com o identificador original legível no retrato. Opcionalmente, colete outros parâmetros abióticos e bióticos para complementar as informações sobre o meio ambiente e a Comunidade em que o mexilhão foi encontrado (veja a Figura 3 para sugestões).

Figura 3: exemplo de uma folha de dados de gravidity de campo. O relatório de dados exato é necessário se uma amostra da brânquia é tomada para produzir a informação segura. Este é um exemplo de uma folha de dados de campo com os campos mínimos e os parâmetros extra abióticos a serem coletados junto com cada amostra de Gill. Para obter informações mais abrangentes, consulte a etapa 4,1 no protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. avaliação laboratorial do conteúdo de brânquias

1. Se o conteúdo da brânquia estiver em um tubo de 1,5 mL, transfira-os para uma placa de Petri e encha a parte inferior do prato com água. Gire suavemente o prato de Petri em um movimento circular para coletar conteúdo no centro do prato para uma visão mais concentrada da amostra.
   Nota: o tubo de 1,5 mL pode precisar de ser liberado usando uma garrafa de esguicho ou transferência de Pipet preenchido com água se os conteúdos de brânquias estão aderindo às paredes do tubo.
2. Coloque o prato de Petri um microscópio de dissecação para avaliar a amostra. Se possível, tire uma fotografia da amostra de brânquias o microscópio e rotule-a com o identificador exclusivo dessa amostra.
   1. Resultados de registro dos quais estágios de desenvolvimento estão presentes em cada amostra de brânquias. Use a Figura 4 como um guia para caracterizar cada estágio de desenvolvimento. Em alguns casos, as fêmeas podem ser larvas de ninhamento em estágios de desenvolvimento múltiplo; Portanto, relate cada estágio de desenvolvimento observado dentro de uma determinada amostra (por exemplo, ' EGG/DG/IMG/FDG '). Uma vez que os glochidia preservados foram avaliados, prossiga para a seção 4. Se os glochidia inteiramente desenvolvidos são identificados e o EtOH não foi usado para a preservação, prossiga ao passo 3,3.
      Nota: ovo, massas de ovo; DG, desenvolvimento de glochidia; IMG, glochidia imaturo; FDG, glochidia inteiramente desenvolvido.

Figura 4: representações para vários estágios de desenvolvimento de glochidia nas brânquias marsupiais. (A) massas de ovos (Egg) têm uma membrana que faz os ovos se amontoam. Dentro de cada membrana de ovo há uma massa esférica opaca de células diferenciantes. A massa esférica opaca pode ser dividida em múltiplas massas esféricas durante a divisão celular precoce, mas ainda deve ser registrada como EGG até que uma forma bivalvar distinta seja observada. (B) o glochidia imaturo (img) tem uma massa bivalve-dada forma distinta contida dentro da membrana do ovo. (C) desenvolver glochidia (DG) têm uma forma distinta bivalves, nenhuma membrana de ovo, e tecido não organizado no interior, muitas vezes Fuzzy na aparência. O desenvolvimento de glochidia (DG) não é reactivo quando exposto a NaCl e classificado como "DG (T)" quando os dados são registados. (D) glochidia inteiramente desenvolvido (FDG) têm a forma distinta do bivalves e o tecido óbvio do músculo do adutor permitindo que o glochidia feche. Os glochidia inteiramente desenvolvidos (FDG) são observados frequentemente como duas válvulas abertas após a preservação. Duas válvulas abertas geralmente estalam fechadas, ou estalam abertas e fechadas, quando expostas a NaCl e são classificadas como ' FDG (T) '. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Conduza um teste do cloreto de sódio (NaCl) para avaliar mais a viabilidade de todo o glochidia inteiramente desenvolvido adicionando um cristal de NaCl a uma gota do subconjunto da amostra da brânquia³⁵. Glochidia viável irá responder a NaCl fechando suas válvulas a partir de uma posição aberta. Relate qualquer glochidia com o sal testado com ' (T) ' no final da designação quando os dados forem gravados.
   Nota: glochidia totalmente desenvolvido também pode ser observado ativamente agarrando aberto e fechado sem exposição a NaCl.

4. reporte ao banco de dados

1. Acesse a Web da fmga (http://arcg.is/089uee), que foi desenvolvida usando programas de software online^38,39,40. A página FMGA fornece um link para o formulário de entrada de dados da área de trabalho e um download de aplicativo para dispositivos móveis. O aplicativo móvel permite a entrada de dados no campo e o georreferenciamento automatizado⁴¹.
   Observação: o calendário de gravidity e outros gráficos associados a eventos de história de vida de espécies de mexilhões de água doce também podem ser encontrados no painel do FMGA.
   1. Use o aplicativo móvel ou o site da área de trabalho para registrar os resultados no formulário de entrada de dados utilizando menus e campos de entrada de texto. Para conjuntos de dados grandes e pré-existentes, entre em contato com os autores para a planilha de modelo. Insira os dados gravados os cabeçalhos de coluna apropriados, tendo em mente que cada registro, ou linha na planilha, representa observações de uma amostra de Gill de um indivíduo gravid.
   2. Envie os resultados e eles serão adicionados ao banco de dados FMGA depois de ser validado por um administrador, que pode entrar em contato com o coletor para solicitar mais detalhes ou fotos.
      Nota: uma vez que os dados são validados e compilados no banco de dados FMGA, todos os calendários gravidity e outros gráficos interativos exibidos no painel FMGA serão atualizados.

Results

Este protocolo foi aplicado durante um estudo de captura-marca-recaptura que monitorava a comunidade de mexilhão de água doce dentro de um trecho de 750 m² de Bruce Creek (Condado de Walton, Flórida) de janeiro de 2015 a dezembro de 2015. A amostragem de campo foi programada para ocorrer a cada quatro semanas; no entanto, devido a eventos de alto fluxo, a amostragem não foi realizada em abril ou setembro de 2015. Agências estaduais e federais, incluindo E.U. Geological Survey, E.U. Fish and Wildlife Service, e Florida Fish e Wildlife conservação Comissão assistida em inquéritos de campo e amostragem de guelras. Cada fêmea gravid encontrada durante a pesquisa foi submetida a amostragem de conteúdo de brânquias no campo usando o protocolo descrito acima, marcado (ver tabela de materiais) e colocado de volta no substrato do rio. As amostras de brânquias foram armazenadas em 95% de EtOH e transportadas para o laboratório do centro de pesquisa aquática e Pantanal da pesquisa geológica dos EUA para avaliação de conteúdo de brânquias.

Ao marcar as fêmeas e recapturá-las em intervalos mensais ao longo do ano, avaliamos os impactos letais e não letais do protocolo de amostragem de brânquias em um total de 90 indivíduos. As seguintes sete espécies foram recapturadas durante este estudo : Elliptio Wikipédia (n = 5) , Fusconaia burkei (n = 1), hamiota australis (n = 19), Obovaria choctawensis (n = 1), Strophitus williamsi (n = 1), Villosa lienosa (n = 60) e villosa Wikipédia (n = 3). Nossa amostragem incluiu indivíduos variando de 24 mm a 80 mm de comprimento total e duas espécies (F. burkei e H. australis) protegidas pela lei de espécies ameaçadas dos EUA. Todos os dados utilizados neste estudo estão publicamente disponíveis nós fornecemos acesso ao nosso conjunto de dados em ScienceBase (https://doi.org/10.5066/P90VU8EN)⁴².

A sobrevivência foi avaliada por quantos indivíduos foram recapturados vivos após a coleta de amostras de brânquias. Observamos alta sobrevida (97%) durante o estudo com alguma mortalidade, possivelmente contribuível para predação, indicada por observações no local. Os resultados mostraram que cerca de 51% dos indivíduos (46 de 90) foram encontrados para permanecer gravid entre eventos de amostragem consecutivos. Outros 10% dos indivíduos (9 de 90) foram encontrados gravid, recapturados não gravid, e encontraram gravid outra vez. Cerca de 39% dos indivíduos (35 de 90) neste estudo foram encontrados gravid, uma amostra de brânquia foi tomado, mas quando recapturado novamente ao longo do ano, eles nunca foram encontrados gravid uma segunda vez. Os resultados indicam que o protocolo descrito aqui não é letal nem subletal e não perturba substancialmente o período de ninhada atual após a amostragem da brânquia.

Embora os tamanhos de amostra neste estudo sejam desiguais entre as espécies, os resultados deste estudo destacam as aplicações benéficas e práticas deste protocolo. O calendário gravidity para V. lienosa ilustra fêmeas gravid que ninhada FDG foi encontrado em quase cada mês do ano exceto agosto, quando somente as fêmeas que ninhada o ovo foram encontradas (Figura 5a). As fêmeas H. australis não foram encontradas gravid (NG) em julho, agosto e dezembro. Uma proporção maior de fêmeas estava ninhando FDG em Janeiro e fevereiro, mas também foram encontrados em outubro e novembro (Figura 5b). Nenhum indivíduo de E. Wikipédia foi encontrado ninhando FDG embora as fêmeas fossem ovo de brotamento de maio a junho, e uma fêmea gravid gravada (GFR) em junho (Figura 5C). A única fêmea gravid de F. burkei foi encontrada GFR em junho e RECAPTUROU ng em julho. O mesmo indivíduo o. choctawensis foi coletado FDG em fevereiro e RECAPTURADO ng em julho. Apenas um S. williamsi foi encontrado e foi recapturado três vezes. Esta fêmea foi encontrada FDG em março, NG em maio, GFR em junho, e EGG em agosto (Figura 5C). Fêmeas gravidas de V. Wikipédia ninhado FDG foram encontradas entre fevereiro e junho (Figura 5C).

Figura 5: resultados do estudo em Bruce Creek, FL exibido em um formato de calendário gravidity. (A) calendário de gravidity para villosa lienosa captura/recapturas. (B) calendário gravidity para capturas/recapturas de hamiota australis . (C) calendários de gravidity para todas as espécies com menos de 10 indivíduos amostrados. O eixo y inclui abreviaturas para os meses janeiro (ja), fevereiro (F), março (Sr), maio (meu), junho (Jn), julho (JL) agosto (A), outubro (O), novembro (N) e dezembro (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Significado

A conservação de espécies imperiled depende do recrutamento bem-sucedido dentro das populações existentes. Em alguns casos, a propagação artificial pode ser necessária para aumentar o recrutamento dessas populações em risco. Isso exige que os pesquisadores sejam informados sobre o momento da reprodução ativa de cada espécie e, possivelmente, aplicando diferentes metodologias ou práticas de manejo para mitigar o impacto no recrutamento. Como um grupo de organismos imperiled, é primordial estabelecer uma abordagem padronizada e não letal para o estudo dos hábitos reprodutivos, e para fornecer uma plataforma na qual Compilar e Visualizar dados para informar a comunidade científica com o mais up-to-date informações disponíveis. Este estudo fornece um protocolo passo a passo para garantir a tomada de precauções, e o conteúdo de brânquias pode ser adequadamente amostrado e avaliado a partir de mexilhões femininos. Este protocolo foi testado para efeitos letais e não letais, permitindo que pesquisadores e gerentes implementem essa metodologia de forma responsável. Também desenvolvemos um conjunto de ferramentas de gerenciamento de banco de dados e aplicativos para facilitar a compilação de informações de gravidity em um painel acessível publicamente, de fácil utilização. Estudos sobre epidemiologia, morfologia glochidia, história de vida, filogenetics, propagação e translocações podem beneficiar e utilizar este repositório de informações de gravidez temporal para todas as espécies de mexilhões de água doce.

Este estudo apoiou, isoladamente, os achados de alguns hábitos reprodutivos de algumas espécies, mas também revelou novas informações sobre outros. Embora a v. Wikipédia tenha sido coletada em menos de v. lienosa, podem ser encontradas semelhanças entre os dois com base nos dados de gravidez. Ambas as espécies de villosa parecem ninhada glochidia inteiramente desenvolvida durante uma grande parcela do ano, que os caracteriza como um brooder hibernação. Isso é consistente com estudos prévios sobre outras espécies de villosa ^43,44,45. Os resultados deste estudo sugerem que H. australis pode ser encontrado gravid de outubro e invernada em junho, exceto que nenhuma captura foi encontrada gravid em dezembro. Um estudo publicado previamente identificou o congénere H. altilis com um período de gravidity de quatro meses, março até junho^46,47. Este achado ilustra um período de gravidity mais longo do que pensado previamente e agrupa geralmente H. australis como um brooder hibernação. Como espécies protegidas federalmente, variando períodos de ninhamento para h. altilis e h. australis poderiam impactar as decisões de manejo para melhor proteger as populações durante os tempos reproductivamente ativos. Elliptio Wikipédia só foram encontrados gravid com ovo em maio e junho, o que corresponde à sua caracterização como uma espécie taquítica com um período de ninhamento muito curto^{24,48,49, 50}. À medida que os dados são compilados em espécies Elliptio usando este protocolo, informações detalhadas podem tornar os esforços de campo mais eficientes quando determinados estágios de desenvolvimento glochidial são direcionados, desde glochidia são encontrados apenas alguns meses fora do ano. A inferência das outras espécies com menores tamanhos de amostra é limitada, mas à medida que os dados são compilados no banco de dados, maiores tamanhos de amostra darão uma visão dos hábitos reprodutivos de espécies de mexilhões adicionais.

Comentários processuais

Mexilhões de água doce e seus glochidia são conhecidos por serem suscetíveis a estressores antropogênicos^10,35. Durante a inspeção da gravidez, as válvulas do mexilhão não podem ser fáceis de abrir, e forçar descuidadamente as válvulas abertas pode causar dano involuntário e resultar no stress ou na mortalidade. Algumas espécies frágeis-descascadas (por exemplo, espécies de anodonta, Leptodea, utterbackia, etc.) e indivíduos de tamanho menor podem ter conchas muito frágeis e músculos adutores fracos que podem quebrar e rasgar facilmente. A amostragem de brânquias pode ser considerada um estressor se o manuseio não for feito de forma responsável e com cautela. Um estudo anterior constatou que o manuseio e A exposição aérea de mexilhões durante os tempos reprodutivamente ativos podem causar vários estresses fisiológicos, incluindo liberação prematura de conteúdo de brânquias³⁴. No entanto, um estudo que utiliza uma metodologia semelhante, como descrito aqui, encontrou o manuseio de mexilhões femininos gravid durante a amostragem de brânquias não interrompeu a ninhada atual ou causa liberação prematura em ambas as espécies de curto e longo prazos¹⁶. Além disso, uma seringa estéril precisa de ser usada durante este protocolo para impedir toda a infecção não intencional ou a contaminação transversal ao perfurar brânquias de indivíduos múltiplos. Além disso, glochidia são frágeis e ninhadas pode ser amadurecido e estressado, mas não expulso. Glochidia maduro na saúde pobre pode resultar em menos indivíduos que reagem aos testes de sal³⁵. Ao fazer a distinção entre DG (T) e FDG (T) é importante para o teste de sal com um grande tamanho amostral, fazer anotações sobre as observações para identificar cuidadosamente as distinções entre a DG e FDG glochidia usando as descrições fornecidas neste estudo. Quando o cuidado apropriado é tomado, o esforço mínimo induzido por este procedimento pode permitir que os mexilhões fêmeas continuem a ninhamento glochidia naturalmente e reduzam impactos no recrutamento na população.

Dados adicionais podem ser gravados para complementar o banco de dados e fornecer amplo contexto para os hábitos reprodutivos de mexilhões de água doce. Algumas espécies (por exemplo, espécies de Fusconaia), têm sido observadas para ter guelras de cores diferentes com base na fase de desenvolvimento da glochidia⁵¹. Durante uma verificação inicial da gravidez da fêmea, uma descrição da cor do Gill pode ser incluída nos dados relatados para permitir a investigação futura. Além disso, neste ponto do protocolo, os pesquisadores podem notar se a fêmea da ninhagem foi encontrada com glochidia nas duas guelras exteriores (ectobranchus), duas brânquias internas (endobranchus), ou todas as quatro brânquias (tetragenosas)¹⁷. Essas informações podem ser adicionadas à FMGA e ajudam a preencher lacunas de dados em relação à ninhada para cada uma das espécies investigadas. As condições ambientais, especificamente a temperatura da água, podem ser coletadas e registradas no campo para uma observação mais abrangente do status da gravidez e do sincronismo das espécies em várias escalas latitudinais. A pesquisa mostra que os parâmetros ambientais, tais como temperatura, fotoperíodo, vazão e disponibilidade de alimentos, podem induzir eventos reprodutivos em mexilhões de água doce^{52,53,54,55 ,56}. Campos adicionais podem ser adicionados ao banco de dados à medida que são submetidos para promover pesquisas futuras sobre fatores abióticos influenciando a gravidez. Uma modificação da captura-marca-recaptura modelada depois que nosso estudo pode igualmente ser adicionado a este protocolo, que permitiria que os investigadores monitorem hábitos reprodutivos de um mexilhão específico e revelem a informação em ninhadas múltiplos por o ano.

A exatidão da informação no FMGA depende da fonte. Por exemplo, a identificação da misidentificação de mexilhões de água doce é comum devido a muitas espécies com características externas semelhantes que dificultam a distinção entre as espécies⁵⁷. Uma amostra de brânquia de um indivíduo mal identificada poderia criar confusão e informações falsas para o período de uma espécie ' ninhada. Se uma amostra de brânquias for tirada, as fotografias devem ser tiradas dentro de ambas as válvulas (se o indivíduo não estiver vivo), fora da válvula direita, e o umbo (dobradiça onde duas válvulas se conectam) e submetido com dados de gravidez através do site da área de trabalho ou da aplicação móvel. Também Congratulamo-nos com fotos do conteúdo da brânquia. Dentro dos formulários de submissão há um menu suspenso que permite ao coletor indicar seu nível de confiança em relação à identificação de espécies. Antes que o registro seja validado, essas informações serão levadas em consideração ao verificar a identificação do coletor contra distribuição plausível, etc. Devido ao alto grau de variação morfológica intraespecífica em espécies de Unionidae, a submissão de amostras de tecido é incentivada e pode ser necessária para facilitar a identificação molecular.

Implicações futuras

Como um método não-letal, este protocolo pode ser aplicado a espécies comuns e imperiled. Os calendários de gravidez para espécies imperfeitas podem ajudar os gestores de conservação envolvidos com a legislação de espécies ameaçadas e planejamento de recuperação, fornecendo informações sobre os períodos de tempo quando as espécies são reproductivamente ativo. As agências estaduais e federais que gerenciam as espécies de risco podem aconselhar melhor as alocações de licenças para ocasiões em que a espécie não é vulnerável e a reprodução, e até mesmo limitar a colheita de peixes hospedeiros durante os tempos mexilhões são glochidia totalmente desenvolvido. Além disso, pesquisas de campo podem direcionar espécies durante períodos não reprodutivos para minimizar o impacto nos processos de recrutamento. A base de dados acessível publicamente, FMGA, fornece uma ferramenta para que os investigadores e os gerentes obtenham a informação reprodutiva importante em toda a espécie fresca do mexilhão do alvo. O banco de dados também destacará lacunas de dados, incentivando novas pesquisas sobre padrões de ninhagem específicos de espécies. Como a compreensão de um padrão reprodutivo de espécies permite a implementação de decisões de gestão adequadas, esperamos que nosso protocolo e banco de dados facilitem a futura pesquisa, conservação e recuperação de mexilhões de água doce.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de centrífuga de tampa de pressão de 1,5 mL USA	Scientific	1615-5510	tubos de tampa de pressão são importantes no campo para que a tampa de rosca solta não seja perdida.
Agulha de 20 G em seringa descartável de 10 mL	Exelint International	26255	seringa descartável estéril de 10 mL com agulha Modelo: 10ml Ponta Luer Lock W/20G X 1 1/2"
Microscópio de Dissecção	qualquer	Caneta
de Marcação	Fisher Scientific	13-379-4	Isso é o que usamos, mas qualquer marcador que possa escrever em pequenos tubos de plástico serve. Este é bastante à prova de etanol e água.
Etanol de grau molecular	qualquer		Necessário se preservar o conteúdo branquial. 95% não desnaturado é necessário para o trabalho genético, 70% é necessário para o trabalho de imagem SEM.
Papel	qualquer	Necessário	para registrar informações sobre amostras coletadas.
Caneta / lápis	qualquer	Se	estiver no campo, é melhor escrever em papel à prova d'água com lápis para não manchar. Se estiver no museu / laboratório, qualquer utensílio de escrita está bom.
Placa de Petri	DWK Life Sciences (Kimble)	23000-9050	Isso é o que usamos, mas qualquer placa de Petri disponível está bem. É melhor ter as paredes mais altas no caso de muita água ser usada.
Cloreto de sódio	qualquer	necessário	para o teste de NaCl para glochídios reativos. Amostras preservadas não precisam disso.
Espéculo	qualquer	qualquer Só	é necessário se você quiser ajuda para abrir as válvulas de um mexilhão vivo.
Água estéril	qualquer	Qualquer	adicionado às amostras branquiais para ser avaliado quanto à reatividade dentro de 24 horas após a coleta.
Super cola	Gorilla	Gel de super cola Gorilla	Usado para aplicar etiquetas e só é necessário se estiver realizando um estudo de captura-marca-recaptura.
Tags	Hallprint	FPN 8x4	Necessário apenas se estiver conduzindo um estudo de captura-marca-recaptura.
Tubo de transferência	Thermo Scientific Samco	225	Isso é o que usamos, mas qualquer tubo de transferência ou garrafa de esguicho é aplicável.
Pinças	qualquer		necessário para mover cristais de NaCl para teste de sal. Amostras preservadas não precisam disso.
Papel impermeável	RainWriter	qualquer	Necessário apenas se estiver realizando trabalhos em campo. Isso permite que você registre informações sobre cada conteúdo individual das guelras extraído.
Escolha de madeira	qualquer	qualquer Só	é necessário se você quiser ajuda para abrir as válvulas de um mexilhão vivo.