Exposição bacteriana do peptide para a seleção de enzimas Biotinylating novas

Resumo

Aqui nós apresentamos um método para selecionar para variantes novas do ligase BirA da biotina-proteína de E. coli que biotinylates um peptide específico do alvo. O protocolo descreve a construção de um plasmídeo para a exposição bacteriana do peptídeo alvo, geração de uma biblioteca BirA, seleção e caracterização de variantes de BirA.

Resumo

A biotina é uma modificação pós-translacional atraente de proteínas que fornece uma etiqueta poderosa para o isolamento e detecção de proteínas. A biotinilação enzimática pelo e. coli biotina-proteína ligase Bira é altamente específica e permite a biotinilação de proteínas-alvo em seu ambiente nativo; no entanto, o uso atual da biotinilação mediada por BirA requer a presença de um peptídeo aceptor sintético (AP) na proteína alvo. Conseqüentemente, sua aplicação é limitada às proteínas que foram projetadas para conter o AP. O objetivo do presente protocolo é usar a exposição bacteriana de um peptídeo derivado de uma proteína alvo não modificada para selecionar para variantes de BirA que biotinylates o peptídeo. O sistema é baseado em um único plasmídeo que permite a coexpressão de variantes de BirA juntamente com um andaime para o indicador de peptídeo na superfície bacteriana. O protocolo descreve um procedimento detalhado para a incorporação do peptídeo alvo no andaime de exposição, a criação da biblioteca de BirA, a seleção de variações ativas de BirA e a caracterização inicial das variações isoladas de BirA. O método fornece um sistema altamente eficaz da seleção para o isolamento de variantes novas de BirA que podem ser usadas para a evolução dirigida mais adicional de ligases da biotina-proteína que biotinylate uma proteína nativa em soluções complexas.

Introdução

A biotinilação de uma proteína cria uma etiqueta poderosa para seu isolamento e detecção de afinidade. A biotinilação de proteínas enzimáticas é uma modificação pós-translacional altamente específica catalisada por ligases de biotina-proteína. A ligase de proteína de E. coli Bira é extremamente específica e covalentemente biotinylates apenas um número restrito de proteínas que ocorrem naturalmente em resíduos específicos de lisina¹. As vantagens da biotinilação catalisada pelo BirA são atualmente aproveitadas pela fusão da proteína-alvo com um pequeno peptídeo aceitador de biotina de 15 aminoácidos sintéticos (AP) que é efetivamente bi....

Protocolo

1. inserção da seqüência de sequenciamento de peptídeos em pBAD BirA-eCPX-AP

Nota: Para selecionar para variantes BirA que biotinylate uma proteína alvo nativa, começar por identificar uma seqüência de peptídeo de 15 aminoácidos na seqüência primária de proteínas que contém pelo menos um resíduo de lisina (K).

1. Vá para a suíte de manipulação de sequências¹².
2. Cole a seqüência de peptídeo identificado 15 aminoácidos na caixa de entrada no formato FASTA e pressione Submit.
3. Selecione e copie a tradução reversa do nucleotide 45 da seqüência do peptide.
<....

Resultados

Western blot de pBAD-BirA-eCPX-AP expressando bactérias produz um ~ 22 kDa streptavidin-reagindo banda consistente com o peso molecular de eCPX (Figura 2a). Ao contrário de Bira-6xhis, o ecpx-AP biotinylated estava atual em culturas não induzidas e induzidas (Figura 2a) devido a um grau pequeno de atividade do promotor T7 mesmo em culturas não induzidas e em biotinilação subseqüente do AP pelo Bira endógeno. No BirA-eCPX-AP (K10.......

Discussão

Quanto a todos os métodos de seleção, a rigor dos passos de lavagem é de extrema importância. Uma vez que as bactérias não precisam ser eluidas dos grânulos antes da amplificação dos clones selecionados, a ligação de alta afinidade entre a biotina e a streptavidina pode ser usada em vez de usar avidinas de menor afinidade, como anteriormente feito com o sistema de exibição de fago, para a seleção das variantes do Bira^7,8. Isto assegura-se de que os clones raros e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gel de poliacrilamida pré-moldado a 10%	Bio-Rad	4561033
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A1593
ApE - Um editor de plasmídeo v2.0	NA	NA	baixado de http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Biotina	Sigma-Aldrich	B4501
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
DPBS (10x), sem cálcio, sem magnésio	ThermoFischer Scientific	14200083
Enzima de restrição DpnI	New England BioLabs	R0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	ThermoFischer Scientific	65001
GenElute Plasmid Miniprep Kit	Sigma-Aldrich	PLN350
GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit	Agilent Technologies	200552
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Immobilon-P PVDF Membrana	Millipore	IPVH15150
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
LS Colunas	Miltenyi Biotec	130-042-401
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NEB 5-alfa Competente E. coli	New England BioLabs	C2987
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	ThermoFischer Scientific	NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)	ThermoFischer Scientific	NP0009
pBAD-BirA-eCPX-AP	Addgene	121907	Usou um modelo e controle positivo
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)	Addgene	121908	controle negativo
Q5 DNA Polimerase de Alta Fidelidade	New England BioLabs	M0491	Para inserção de sequência de peptídeos em pBAD-BirA-eCPX-AP, qualquer polimerase de alta fidelidade servirá
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
Leite Desnatado Pó	Sigma-Aldrich	70166
Streptavidin-HRP	Agilent Technologies	P0397
T7 Express lysY/Iq Competente E. coli	New England BioLabs	C3013
Triptona	Millipore	T9410
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL103001EA
Extrato de levedura	Sigma-Aldrich	Y1625