Exposição bacteriana do peptide para a seleção de enzimas Biotinylating novas

Resumo

Aqui nós apresentamos um método para selecionar para variantes novas do ligase BirA da biotina-proteína de E. coli que biotinylates um peptide específico do alvo. O protocolo descreve a construção de um plasmídeo para a exposição bacteriana do peptídeo alvo, geração de uma biblioteca BirA, seleção e caracterização de variantes de BirA.

Resumo

A biotina é uma modificação pós-translacional atraente de proteínas que fornece uma etiqueta poderosa para o isolamento e detecção de proteínas. A biotinilação enzimática pelo e. coli biotina-proteína ligase Bira é altamente específica e permite a biotinilação de proteínas-alvo em seu ambiente nativo; no entanto, o uso atual da biotinilação mediada por BirA requer a presença de um peptídeo aceptor sintético (AP) na proteína alvo. Conseqüentemente, sua aplicação é limitada às proteínas que foram projetadas para conter o AP. O objetivo do presente protocolo é usar a exposição bacteriana de um peptídeo derivado de uma proteína alvo não modificada para selecionar para variantes de BirA que biotinylates o peptídeo. O sistema é baseado em um único plasmídeo que permite a coexpressão de variantes de BirA juntamente com um andaime para o indicador de peptídeo na superfície bacteriana. O protocolo descreve um procedimento detalhado para a incorporação do peptídeo alvo no andaime de exposição, a criação da biblioteca de BirA, a seleção de variações ativas de BirA e a caracterização inicial das variações isoladas de BirA. O método fornece um sistema altamente eficaz da seleção para o isolamento de variantes novas de BirA que podem ser usadas para a evolução dirigida mais adicional de ligases da biotina-proteína que biotinylate uma proteína nativa em soluções complexas.

Introdução

A biotinilação de uma proteína cria uma etiqueta poderosa para seu isolamento e detecção de afinidade. A biotinilação de proteínas enzimáticas é uma modificação pós-translacional altamente específica catalisada por ligases de biotina-proteína. A ligase de proteína de E. coli Bira é extremamente específica e covalentemente biotinylates apenas um número restrito de proteínas que ocorrem naturalmente em resíduos específicos de lisina¹. As vantagens da biotinilação catalisada pelo BirA são atualmente aproveitadas pela fusão da proteína-alvo com um pequeno peptídeo aceitador de biotina de 15 aminoácidos sintéticos (AP) que é efetivamente biotinilado² e permite o altamente específico e biotinilação in vivo e in vitro eficiente por coexpressão ou adição de Bira^3,4,5. Embora a ligadura de biotina-proteína catalisada in vivo e in vitro seja uma estratégia de rotulagem atrativa, sua aplicação é limitada a amostras que contenham proteínas fundidas por AP. O objetivo deste método é o desenvolvimento de novos mutantes de ligases de biotina-proteína que seletivamente biotinylate proteínas nativas não modificadas e, assim, ampliar o número de aplicações em que a estratégia de biotinilação enzimática pode ser usada.

A função protéica pode ser evoluída através de rodadas iterativas da mutação genética, seleção e amplificação de variantes genéticas com a função desejada. Uma estratégia de seleção forte e eficiente é crucial para a evolução dirigida e a atividade da ligase da biotina-proteína é prontamente selecionada devido à forte ligação entre a biotina e a streptavidina e seus homólogos⁶. As tecnologias de display phage permitem a seleção de fagos que exibem peptídeos biotinilados^7,8. Desde que a amplificação de fagos isolados exige a infecção de um anfitrião bacteriano, entretanto, a seleção do fago com estreptavidina cria um gargalo que a ligação da elevado-afinidade da biotina ao estreptavidina é virtualmente irreversível não-desnaturando Condições. Para assegurar a ligação reversível de phages biotinylated, os avidins monoméricas com mais baixa afinidade foram usados que conduziram a um enriquecimento modesto de ~ 10 vezes⁷. Nós desenvolvemos recentemente um método bacteriano da exposição para o isolamento de variantes novas de BirA que elimina a necessidade para a eluição da matriz da afinidade e remove desse modo um gargalo dos sistemas precedentes da seleção de BirA⁹. Na verdade, nosso sistema de exibição bacteriana permite um enriquecimento de > 1, 000, 000 vezes de clones ativos em uma única etapa de seleção⁹, proporcionando assim um sistema de seleção eficaz para a evolução dirigida de novas variantes Bira.

Nosso sistema bacteriano da exposição consiste em dois componentes, BirA com um Tag do C-terminal 6xHis e uma proteína do andaime que permita a exposição de superfície de um peptide do alvo. Utilizou-se a proteína de membrana externa reforçada circularmente permutada de proteínas de andaime X (eCPX), uma vez que a exposição efetiva de peptídeos pode ser observada tanto no N-e C-Termini^10,11. A fusão da sequência peptídica alvo para o C-Terminus de eCPX assegura a biotinilação de bactérias expressando variantes de BirA ativas. As bactérias permitem a seleção efetiva de streptavidina como o peptídeo biotinilado agora é exibido na superfície (Figura 1a).

A finalidade deste método é selecionar para variantes novas de BirA que as seqüências do peptide dos biotinylates atuais em proteínas nativas. O sistema é codificado por genes presentes no plasmídeo pBAD-BirA-eCPX-AP, que contém um promotor de arabinose-inducible controlando BirA (araBAD), e um promotor T7 controlando eCPX⁹ (Figura 1b). O presente protocolo descreve o procedimento detalhado para 1) incorporação de um peptídeo derivado de uma proteína alvo para o C-terminal de eCPX, 2) criação de uma biblioteca mutacional de BirA por PCR propenso a erros, 3) seleção de bactérias ligantes de streptavidina por classificação de células ativadas por magnético (MACS), 4) quantificação do enriquecimento de bactérias e 5) caracterização inicial de clones isolados.

Protocolo

1. inserção da seqüência de sequenciamento de peptídeos em pBAD BirA-eCPX-AP

Nota: Para selecionar para variantes BirA que biotinylate uma proteína alvo nativa, começar por identificar uma seqüência de peptídeo de 15 aminoácidos na seqüência primária de proteínas que contém pelo menos um resíduo de lisina (K).

1. Vá para a suíte de manipulação de sequências¹².
2. Cole a seqüência de peptídeo identificado 15 aminoácidos na caixa de entrada no formato FASTA e pressione Submit.
3. Selecione e copie a tradução reversa do nucleotide 45 da seqüência do peptide.
4. Baixe o arquivo GenBank para pBAD-BirA-eCPX-AP em http://n2t.net/addgene:121907.
5. Carregue o arquivo em um editor de plasmídeo (por exemplo, ApE) e, na janela do recurso, selecione a sequência AP designada "avitag (TM)".
6. Clique com o botão direito do mouse na sequência AP destacada na janela de sequência de DNA e selecione colar Rev-com no menu contextual.
   Nota: A sequência de codificação do eCPX está na direção inversa e a sequência de codificação peptídica deve, portanto, ser colada como um complemento reverso.
7. Clique com o botão direito do mouse na sequência destacada e selecione novo recurso.
8. Adicione um nome descritivo da sequência inserida e pressione OK.
9. Selecione salvar como no menu arquivo para salvar o arquivo modificado.
10. Projete o primer dianteiro para incluir os últimos 30 nucleotídeos do complemento reverso da seqüência de codificação do peptídeo e adicione a seqüência de nucleotídeo de ligação de plasmídeo (3 '-GCGGCCGCCTGC-5 ') a sua extremidade 5 '.
11. Projete a primeira demão reversa para incluir os primeiros 30 nucleotídeos do complemento reverso da seqüência de codificação do peptide e adicione a seqüência de ligação do nucleotide do plasmídeo (3 '-cttaagtaatgtttaaacgaattcgag-5 ') a sua extremidade 5 '.
12. Configure uma reação de PCR de 20 μL em um tubo de PCR com paredes finas, adicionando os reagentes listados na tabela 1.
13. Transfira o tubo para um termociclador e realize a PCR usando um programa com uma desnaturação inicial a 98 ° c por 30 s, 30 ciclos de [15 s a 98 ° c, 15 s a 60 ° c e 3 min a 72 ° c], extensão final de 2 min a 72 ° c e preensão a 4 ° c.
14. Execute 5 μL da reacção de PCR num gel de agarose a 1% para confirmar a amplificação de um produto de PCR ~ 6 KB.
    Nota: Se nenhum produto de PCR for observado, otimize a condição de PCR de acordo com as instruções do fabricante. O protocolo pode ser pausado aqui.
15. Adicionar 1 μL de DpnI à reacção de PCR e incubar durante 1 h a 37 ° c
16. Transforme a e. coli competente com 2 μL de reação de PCR digerida por DPNI e placa em placas de caldo lisogênico (lb)/amp. Incubar durante a noite a 37 ° c.
17. Inocular 5 mL LB contendo 100 μg/mL de ampicilina com uma única colônia. Incubar durante a noite a 37 ° c com agitação em 200 rpm.
    Nota: Recomenda-se testar pelo menos 6 colônias.
18. Faça estoques de congelamento de 850 μL de cada cultura durante a noite, adicionando glicerol a uma concentração final de 15% para a cultura. Conservar a-80 ° c.
19. Extraia o DNA plasmídeo da cultura remanescente de 4 mL por mini-Prep kit de extração de DNA.
20. Confirme a inserção correta da seqüência de codificação de peptídeo por sequenciamento de DNA usando o primer de terminal T7 (GCTAGTTATTGCTCAGCGG).

2. geração de uma biblioteca BirA

Nota: A biblioteca mutacional inicial do Bira (Figura 1c, etapa 1) é criada por PCR propenso a erros. Outros métodos para gerar a biblioteca mutacional do BirA provavelmente funcionarão também.

1. Sintetizar os megaprimers mutantes com BirA-6xHis Forward (ATGAAGGATAACACCGTGCC) e Reverse (TCAATGATGATGATGATGATGTTT) primers usando 1 ng de pBAD-BirA-eCPX com a seqüência peptídeo alvo (preparado e confirmado na etapa 1,20) como um modelo e 35 ciclos de PCR com uma temperatura de recozimento de 60 ° c de acordo com a instrução do fabricante.
2. Executar 5 μL da reacção de amplificação num gel de agarose a 1% para verificar a amplificação de um produto de PCR de 984 BP.
3. Purify o produto do PCR dos 45 μl permanecendo da reação da amplificação usando um jogo comercial da purificação do PCR e use um espectrofotômetro para quantificar o rendimento do ADN.
   Nota: A purificação de uma única reacção de amplificação de 45 μL produz geralmente um rendimento suficiente (> 250 NG).
4. Prepare a reação da amostra em um tubo de PCR com paredes finas, adicionando os reagentes listados na tabela 2.
5. Transfira a mistura de reacção para um ciclador térmico e execute o PCR com os megaprimers mutantes preparados no passo 2,3 utilizando os seguintes parâmetros: 1 min a 95 ° c e 25 ciclos de 50 s a 95 ° c, 50 s a 60 ° c e 12 min a 68 ° c. Conservar a reacção a 4 ° c.
6. Adicione 1 μL de enzima de restrição DpnI diretamente à reacção de amplificação e misture suavemente.
7. Gire para baixo a mistura da reação e incubar para 2 h em 37 ° c.
8. Transforme as células de E. coli competentes de T7 Express Lysy/IQ com 2 μl da reacção DPNI.
9. Inocular 100 mL LB contendo 100 μg/mL de ampicilina com as células transformadas e incubar durante a noite a 37 ° c com agitação a 200 rpm.
10. Faça estoques de freezer com 10 mL da cultura overnight em LB com 15% de glicerol e armazene a-80 ° c.

3. seleção das bactérias que expressam o peptide de biotinylated

Nota: Esta parte do protocolo abrange a etapa 2-5 da Figura 1c. É altamente recomendável que a abordagem de seleção seja a configuração usando pBAD-BirA-eCPX-AP e pBAD-BirA-eCPX-AP (K10A) como controles positivos e negativos.

1. Inocular 100 mL de LB contendo 1% de glicose e 100 μg/mL de ampicilina com 1 mL de biblioteca de BirA e incubar durante a noite a 37 ° c com agitação a 200 rpm.
2. Inocular 5 mL de LB contendo 1% de glicose e 100 μg/mL de ampicilina com 100 μL de cultura overnight.
3. Incubar por 2 h e 30 min até que a cultura atinja um OD₆₀₀ de aproximadamente 0,5.
4. Induzir a expressão de eCPX e BirA com 0,2% w/v L-arabinose, 100 μM isopropílico β-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG) e 100 μM de biotina e agitar a cultura em 200 rpm por 1 h a 37 ° c.
5. Centrifugue a cultura por 10 min a 5.000 x g e retire o sobrenadante.
6. Ressuscita as células em 1 mL da PBS gelada e Centrifugue a 5.000 x g durante 5 min.
7. Descartar o sobrenadante e ressuscita as células em 400 μL de PBS gelada e armazenar células no gelo.
8. Retire 10 μL de células resrepfinadas e guarde no gelo num tubo de 1,5 mL rotulado como "Input".
9. Lave 20 μL de grânulos magnéticos de estreptavidina em 1 mL de PBS gelado e coloque o tubo em um separador de partículas magnéticas de bancada antes de remover cuidadosamente o sobrenadante.
10. Ressuscita os grânulos magnéticos do estreptavidina em 20 μL de PBS Ice-Cold e transfere-o ao μl 390 de pilhas ressuspenso da etapa 3,8.
11. Misture suavemente com pipetagem e, em seguida, incubar durante 30 min a 4 ° c.
    Nota: Não vórtice como este pode lyse as células. A agregação de grânulos é freqüentemente observada com uma alta abundância de bactérias que exibem um peptídeo biotinilado.
12. Coloque uma coluna com esferas ferromagnéticas em um separador de partículas magnéticas e lave com 5 mL de PBS gelada.
13. Transfira as células e os grânulos magnéticos de estreptavidina para a coluna anexada no separador.
14. Uma vez que o reservatório da coluna está vazio, adicione 500 μL de PBS gelado e repita até que a coluna tenha sido lavada com um volume total de 5 mL de PBS gelado.
15. Retire a coluna do separador e coloque-a num tubo de 1,5 mL.
16. Pipetar 1 ml da PBS gelada para a coluna e eluir as células rotuladas magneticamente aplicando o êmbolo fornecido com a coluna.
17. Transfira o tubo de 1,5 mL para um separador de bancada e lave a célula magneticamente rotulada com 1 mL de PBS gelada.
18. Resuspender suavemente as células rotuladas magneticamente em 1 mL do PBS gelado antes de remover e armazenar 10 μL da ressuscipensão em um tubo de 1,5 mL rotulado como "output".
19. Inocular 100 mL de LB contendo 1% de glicose e 100 μg/mL de ampicilina com as células rotuladas magneticamente e incubar durante a noite a 37 ° c com agitação a 200 rpm.
20. No dia seguinte, use 10 mL da cultura overnight para fazer estoques de freezer com células em LB com 15% de glicerol e armazenar a-80 ° c e 1 mL da cultura overnight para a próxima rodada de seleção, ou seja, etapa 3,2.
    Nota: Geralmente, 3-5 rodadas de seleção são recomendadas para o enriquecimento de bactérias ligantes estreptavidina.

4. quantificação do enriquecimento

Nota: A quantificação das bactérias ao vivo nas amostras de "Input" e "output" é realizada após cada rodada de seleção por chapeamento de diluições seriadas das amostras e contagem subsequente de unidades formadoras de colônias (CFUs).

1. Adicione 990 μL de PBS gelo-frio à entrada (da etapa 3,8) e saída (da etapa 3,18) amostras e Rotule os tubos "entrada 10^-2" e "saída 10^-2", respectivamente.
2. Faça 10 vezes diluições seriais das amostras "Input 10^-2" e "output 10^-2" na PBS gelada até que uma diluição final de 10^-10 seja alcançada na amostra de entrada e 10^-4 na amostra de saída.
3. Placa 100 μL de amostras de "entrada 10-⁶", "entrada 10-⁸", "entrada 10^-10", "saída 10-²", "saída 10^-3" e "saída 10^-4" nas placas lb/amp e incubar durante a noite a 37 ° c.
4. Conte o número de colônias nas placas com colônias claramente separadas. Multiplicar a contagem de colônias com o fator de diluição para obter a concentração bacteriana Count/100 μL.
5. Calcule a contagem bacteriana total nas amostras de entrada e saída multiplicando a concentração de células com a entrada (400 μL) e o volume de saída (1 mL), respectivamente, e estimar o enriquecimento dividindo a saída com a contagem de células de entrada.
   Nota: Um enriquecimento significativo deve ser visível após 3-5 rodadas de seleção

5. Caracterização da variante BirA selecionada

Nota: A caracterização pode ser realizada após a seleção das variantes do BirA a partir da primeira biblioteca BirA; no entanto, as variantes do BirA geralmente têm baixa atividade em relação ao peptídeo. Portanto, uma rodada adicional de mutação e seleção também pode ser realizada antes da caracterização. Normalmente, 10 clones da rodada de seleção final são isolados para maior caracterização.

1. Inocular 5 mL LB contendo 100 μg/mL de ampicilina com clones selecionados da rodada de seleção final. Além disso, inocular 5 mL LB contendo 100 μg/mL de ampicilina com T7 Express lysY/IQ E. coli transformada com Pbad-Bira-ECPX-AP, que será usado como um controle positivo para o borrão ocidental descrito abaixo.
2. Incubar durante a noite a 37 ° c com agitação em 200 rpm.
3. Faça estoques de congelamento de 850 μL de cada cultura durante a noite, adicionando glicerol a uma concentração final de 15% para a cultura. Conservar a-80 ° c.
4. Inocular 5 mL de LB contendo 100 μg/mL de ampicilina com 100 μL de cultura overnight e incubar a 37 ° c com agitação a 200 rpm por 2 h.
5. Extraia o DNA plasmídeo da cultura restante de 4 mL por s kit de extração de DNA de mini-Prep comercialmente. Execute a seqüência do ADN em sentidos para diante e reversos das variantes de BirA com pBAD (ATGCCATAGCATTTTTATCC) e pTrcHis Rev (CTTCTGCGTTCTGATTTAATCTG) primers.
6. Adicionar 0,2% w/v L-arabinose e 100 μM IPTG e 100 μM de biotina a culturas da etapa 5,4 e agitar a cultura a 200 rpm por 1 h a 37 ° c para induzir a expressão de variantes de eCPX e BirA.
7. Transferir 65 μL da cultura para 1,5 mL de tubos contendo 25 μL do tampão de carga da amostra e 10 μL do agente redutor.
8. Incubar a 95 ° c durante 5 min.
9. Carregue a amostra (incluindo o controle positivo) em um gel do SDS-polyacrylamide de 12% junto com um marcador do tamanho e realize a electroforese do gel em 200 V por aproximadamente 45 minutos até as 20, 25 e 37 faixas padrão de kDa são separadas claramente.
10. Libere o gel da gaveta e monte o sanduíche para blotting do gel em uma membrana de PVDF.
11. Electroblot a 35 V por 2 h no gelo.
12. Retire a membrana de PVDF e incubar no tampão de obstrução [PBS, 0, 5% Tween-20, pó de leite desnatado de 3%] para 1 h na temperatura ambiente com agitação.
13. Prepare a solução de detecção de biotina diluindo streptavidin-HRP 1:1000 em PBST.
    Nota: O tampão de bloqueio contém biotina e, portanto, não deve ser usado como tampão de diluição para streptavidin-HRP.
14. Descarte o tampão de bloqueio, lave a membrana rapidamente em PBST [PBS, 0, 5% Tween-20] e adicione a solução de detecção de biotina. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente com agitação.
15. Descarte a solução de detecção de biotina e lave a membrana cuidadosamente em PBST por 5 min duas vezes e 10 min uma vez com agitação suave à temperatura ambiente.
16. Descarte o PBST, adicione 2 mL de mistura ECL e incubar por 1 min com agitação.
17. Seque a membrana rapidamente em um papel de tecido e desenvolva a imagem em uma película de raio X ou em um sistema digital da imagem latente do gel.
    Nota: Na pista carregada com o controle positivo, duas bandas distintas de reação à streptavidina devem ser claramente visíveis: uma proteína de 30 kDa biotinylated endogenamente expressa e a faixa de ~ 22 kDa eCXP-AP. Se as 10 colônias selecionadas podem biotinylate o peptide indicado, uma faixa em ~ 22 kDa deve ser visível. A intensidade dessas bandas é geralmente menor do que o controle positivo e pode, portanto, exigir tempos de exposição mais longos.

Resultados

Western blot de pBAD-BirA-eCPX-AP expressando bactérias produz um ~ 22 kDa streptavidin-reagindo banda consistente com o peso molecular de eCPX (Figura 2a). Ao contrário de Bira-6xhis, o ecpx-AP biotinylated estava atual em culturas não induzidas e induzidas (Figura 2a) devido a um grau pequeno de atividade do promotor T7 mesmo em culturas não induzidas e em biotinilação subseqüente do AP pelo Bira endógeno. No BirA-eCPX-AP (K10...

Discussão

Quanto a todos os métodos de seleção, a rigor dos passos de lavagem é de extrema importância. Uma vez que as bactérias não precisam ser eluidas dos grânulos antes da amplificação dos clones selecionados, a ligação de alta afinidade entre a biotina e a streptavidina pode ser usada em vez de usar avidinas de menor afinidade, como anteriormente feito com o sistema de exibição de fago, para a seleção das variantes do Bira^7,8. Isto assegura-se de que os clones raros e...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gel de poliacrilamida pré-moldado a 10%	Bio-Rad	4561033
Ampicilina	Sigma-Aldrich	A1593
ApE - Um editor de plasmídeo v2.0	NA	NA	baixado de http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Biotina	Sigma-Aldrich	B4501
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
DPBS (10x), sem cálcio, sem magnésio	ThermoFischer Scientific	14200083
Enzima de restrição DpnI	New England BioLabs	R0176
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	ThermoFischer Scientific	65001
GenElute Plasmid Miniprep Kit	Sigma-Aldrich	PLN350
GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit	Agilent Technologies	200552
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Immobilon-P PVDF Membrana	Millipore	IPVH15150
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
LS Colunas	Miltenyi Biotec	130-042-401
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NEB 5-alfa Competente E. coli	New England BioLabs	C2987
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	ThermoFischer Scientific	NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x)	ThermoFischer Scientific	NP0009
pBAD-BirA-eCPX-AP	Addgene	121907	Usou um modelo e controle positivo
pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A)	Addgene	121908	controle negativo
Q5 DNA Polimerase de Alta Fidelidade	New England BioLabs	M0491	Para inserção de sequência de peptídeos em pBAD-BirA-eCPX-AP, qualquer polimerase de alta fidelidade servirá
Separador QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
Leite Desnatado Pó	Sigma-Aldrich	70166
Streptavidin-HRP	Agilent Technologies	P0397
T7 Express lysY/Iq Competente E. coli	New England BioLabs	C3013
Triptona	Millipore	T9410
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL103001EA
Extrato de levedura	Sigma-Aldrich	Y1625