Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

Resumo

Os efeitos de inibidores migrastatic na migração da pilha do cancro do glioma em ensaios tridimensionais da invasão (3D) usando um inibidor do do histone do histona (HDAC) são caracterizados pela microscopia confocal de alta resolução.

Resumo

Descoberta de drogas e desenvolvimento em pesquisa de câncer está sendo cada vez mais baseado em telas de drogas em um formato 3D. Os inibidores novos que visam o potencial migratório e invasor de pilhas de cancro, e conseqüentemente a propagação metastática da doença, estão sendo descobertos e considerados como tratamentos complementares em cancros altamente invasores tais como gliomas. Assim, é necessário gerar dados que permitam a análise detalhada das células em um ambiente 3D após a adição de uma droga. A metodologia descrita aqui, combinando ensaios de invasão esferóide com captura de imagem de alta resolução e análise de dados por microscopia de varredura por laser confocal (CLSM), permitiu a caracterização detalhada dos efeitos do potencial inibidor antimigratório MI-192 em células de glioma. Os spheroids foram gerados das linhas de pilha para ensaios da invasão em placas 96-well aderentes baixas e preparadas então para a análise de CLSM. O fluxo de trabalho descrito foi preferível em relação a outras técnicas geradoras de spheroóides comumente usadas, devido à facilidade e reprodutibilidade. Isto, combinado com a definição aumentada da imagem alcançada pela microscopia confocal comparada às aproximações convencionais do largo-campo, permitiu a identificação e a análise de mudanças morfológicas distintas em pilhas migratórias em um ambiente 3D que segue tratamento com a droga migrastatic MI-192.

Introdução

As tecnologias esferóide tridimensionais para a descoberta pré-clínica da droga e o desenvolvimento de drogas cancerosas potenciais estão sendo favorecidas cada vez mais sobre telas convencionais da droga; assim, há mais desenvolvimento de migração migrastatic-e prevenção de invasão-drogas. A lógica subjacente a esses desenvolvimentos no tratamento do câncer são claras: ensaios de esferóide 3D representam uma abordagem mais realista para a triagem de drogas anti-câncer potenciais como eles imitam a arquitetura do tumor 3D mais fielmente do que as culturas monocamada celular, recapitular interações do droga-tumor (cinética) mais exatamente, e permita a caracterização da atividade da droga em um ajuste tumor-relacionado. Além disso, o aumento da resistência a medicamentos quimiotóxicos em muitos tipos de câncer e altas taxas de mortalidade entre pacientes oncológicos devido à metástase potenciada pela capacidade das células cancerosas de migrar para sítios tumorais distantes suporta a inclusão de agentes quimioterapêuticos visando o potencial migratório das células cancerosas como tratamento adjuvante em futuros ensaios clínicos de câncer¹. Este é particularmente o caso em cânceres altamente invasivos, tais como glioblastomas de alto grau (GBM). A gerência de GBM inclui a cirurgia, a radioterapia, e a quimioterapia. No entanto, mesmo com o tratamento de combinação, a maioria dos pacientes recaída dentro de 1 ano do diagnóstico inicial com uma sobrevida mediana de 11-15 meses^2,3. Enormes avanços no campo da tecnologia 3D foram feitos ao longo dos últimos anos: sistemas rotativos, estruturas microfabricadas e scaffolds 3D, e outros ensaios individuais estão sendo continuamente melhorados para permitir testes de rotina em uma grande escala^{4, 5,6,7}. No entanto, os resultados obtidos desses ensaios devem ser analisados de maneira significativa, pois a interpretação dos dados é muitas vezes dificultada pelas tentativas de analisar dados gerados em 3D com sistemas de análise de imagem 2D.

Apesar de ser preferível em termos de velocidade de aquisição de imagem e redução de foto-toxicidade, a maioria dos sistemas de campo largo permanecem limitados pela resolução⁸. Assim, além dos dados lidos-outs relacionados à eficácia da droga, os efeitos detalhados da ação da droga em estruturas celulares 3D de células migratórias são inevitavelmente perdidos se imaged usando um sistema de campo largo. Por outro lado, a microscopia de varredura a laser confocal (CLSM) captura imagens de alta qualidade, opticamente seccionadas que podem ser reconstruídas e renderizadas em 3D pós-aquisição usando software de computador. Assim, o CLSM é prontamente aplicável às estruturas celulares 3D complexas da imagem latente, assim permitindo a interrogação dos efeitos de inibidores antimigrastatic em estruturas 3D e em análises detalhadas de mecanismos da migração da pilha. Isto indubitavelmente guiará o desenvolvimento migrastatic futuro da droga. Aqui, um fluxo de trabalho combinado da geração do esferóide, do tratamento da droga, do protocolo de mancha, e da caracterização pela microscopia confocal de alta resolução é descrito.

Protocolo

1. geração de spheroids da pilha

Dia 1

1. Prepare o meio de cultura padrão conforme exigido pela linha de célula investigação.
2. Realize todas as etapas associadas à cultura tecidual em uma capa de cultura tecidual usando técnicas de manuseio estéril.
3. Trypsinize e contagem de células cancerosas. Use 20 mL de suspensão celular por placa. Mantenha as suspensões da pilha em tubos universais estéreis claramente etiquetados.
4. Adicione um número predeterminado de células a cada poço. Tanto o número inicial de células quanto o tamanho de esferóide final exigido dependem da taxa de proliferação da linha celular que está sendo investigada.
   Nota: Para linhas celulares de glioma estabelecidas como U251 e KNS42^9,10, 5 x 10³ células/ml produzirá um esferóide microscopicamente visível (200 ou 800 μm) após 4 dias de incubação.
5. Ressuscitar as células em tubos universais por inversão suave para evitar aglutina celular. Pipete 200 μL da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços. Se todos os poços não são exigidos, é aconselhável adicionar 200 μL de 1X PBS a cada poço vazio para evitar a evaporação.
6. Incubar as células em uma incubadora como normal em 37 ° c.
   Nota: As linhas celulares, como linhas de células de câncer de glioma, formarão esferóides dentro de 24 h. permita que a arquitetura celular 3D se forme incubando o esferoide por 72 h.

Dia 2

7. Verifique as células por microscopia de campo brilhante após 24 h. dependendo da linha celular, as células podem ter formado um esferóide detectável na parte inferior do poço.
   Nota: Linhas de células de câncer de glioma estabelecidas prontamente formam esferóides dentro de 24 h. as linhas celulares de câncer de glioma derivado do paciente podem levar até 1-2 semanas.

2. ensaio de invasão de colágeno

Dia 3

1. Coloc o colagénio, meio de cultura 5x, 1 M NaOH, e 1 20 mL de tubo no gelo.
2. Cuidadosamente e lentamente adicionar 10,4 mL de colágeno frio em um tubo de cultura refrigerada. Evite bolhas. Esta quantidade de colágeno é suficiente para 1 96-bem placa. O upscaling é possível, mas recomenda-se que o tubo de 1 20 mL por a placa esteja preparado em um momento.
3. Adicione suavemente 1,52 mL de meio de cultura de 5x estéril frio. Evite bolhas.
4. Pouco antes de usar, adicione delicadamente 72 μL de NaOH estéril frio de 1 M. Mantenha a solução no gelo.
5. Misture suavemente com pipetagem. Evite bolhas. A mistura eficiente conduz a uma mudança da cor (do vermelho ao alaranjado-vermelho (pH 7,4) no meio. Deixe a mistura no gelo até o uso.
6. Etapa crucial: Remova 190 μL do sobrenadante da placa 96-well preparada no dia 1. Tenha muito cuidado para não perturbar os esferóides que se formaram no fundo do poço. Use a pipeta em um ângulo para o lado, não o centro, do poço.
7. Adicione delicadamente 100 μL da mistura do colagénio a cada poço. Para evitar qualquer distúrbio esferóide, pipeta a mistura para baixo do lado do poço. Evite bolhas. Mantenha toda a mistura restante do colagénio no tubo de 20 mL na temperatura ambiente para avaliar a polimerização.
8. Incubar a placa na incubadora por pelo menos 10 minutos para permitir que o colagénio polimerize. Como um Guideline, se o colagénio restante ajustou-se, tornando-se semi-sólido e esponja-como, os esferoides estão prontos para ser tratados com o inibidor.
9. Adicione os fármacos ou inibidores na concentração de 2x para o meio de cultura. Adicione o meio suavemente a cada poço (100 μL por poço). Outra vez, pipeta o meio para baixo o lado do poço para evitar o distúrbio esferóide.
10. Observe e imagem cada esferóide por microscopia de campo brilhante às vezes T = 0 h, 24 h, 48 h e 72 h para avaliar a atividade medicamentosa. Em seguida, devolva a placa para a incubadora.
    Nota: Dependendo do comportamento invasivo da linha celular, a migração para longe do núcleo esferóide original pode ser observada a partir de 24 h em diante.

3. preparação de colágeno embutido spheroids e células migratórias para microscopia confocal

1. Coloc a placa em uma capa da cultura do tecido e remova delicadamente o sobrenadante (200 μL). Mais uma vez, tome cuidado para não perturbar o esferóide e evitar tocar o colágeno, pois isso pode interferir com o plugue de colágeno.
2. Substitua o sobrenadante por 100 μL de 1X PBS. Repita este passo de lavagem 3x.
3. Retire a lavagem final e substitua por 4% de formaldeído em 1X PBS (100 μL por poço).
   Atenção: O formaldeído é um potencial carcinógeno. Manuseie com cuidado de acordo com as diretrizes de saúde e segurança.
4. Coloc a placa 96-well em um banco do laboratório, cubra com a folha, e deixe-a para 24 h na temperatura ambiente.
5. Retire cuidadosamente o formaldeído e substitua por 1X PBS. Repita este 1X PBS lavagem 3x.
6. Prepare 0,1% Triton X-100 em 1X PBS. Retire a lavagem de 1X PBS e substitua-a por 100 μL da solução Triton X-100. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Enquanto isso, prepare a solução de bloqueio com 1X PBS e 0, 5% de leite em pó desnatado e misture completamente.
7. Remova Triton X-100 e lave 3x com 1X PBS. Adicionar 100 μL de solução de bloqueio a cada poço e incubar durante 15 min.
8. Diluir o anticorpo primário requerido no bloqueio do tampão na concentração predeterminada. Aqui, use anticorpo anti-rato IgG acetilado tubulina (1:100).
9. Centrifugue a mistura principal do amortecedor do anticorpo-bloqueio por 5 minutos em 15.682 x g. Retire cuidadosamente a solução de bloqueio e adicione o sobrenadante (25 − 50 μL) a cada poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente por 1 h.
10. Retire a solução de anticorpos e lave 3x com 1X PBS (100 μL por poço).
11. Diluir o anticorpo secundário no tampão de obstrução na concentração recomendada ou predeterminada além do que todas as manchas fluorescentes adicionais. Aqui, use 1:500 anticorpo conjugado fluorophore-488 do anti-rato, Phalloidin-594 (1:500) para a mancha do actina, e a mancha do ADN (DAPI).
12. Mais uma vez, centrifugue a solução secundária do anticorpo por 5 minutos em 13.000 rpm.
13. Remova a solução de obstrução de cada poço e adicione 25 − 50 μL da mistura secundária do anticorpo/Phalloidin/DAPI. Incubar no escuro para 1,5 h em temperatura ambiente.
14. Remova a solução secundária do anticorpo-corante e lave 3x com 1X PBS (100 μL por o poço).
15. Levante com cuidado plugues individuais do colagénio pela sucção com uma pipeta plástica (200 μL) no centro de uma corrediça de vidro Lisa de alta qualidade.
16. Adicione uma gota de um lamínula apropriado ao plugue do colagénio, assegurando-se de que a tomada esteja coberta completamente. Evite bolhas.
17. Aplique a lamínula da espessura óptima para o objetivo do microscópio que será usado para a imagem latente e permita ajustar durante a noite. Guarde as lâminas à temperatura ambiente no escuro.

4. microscopia de fluorescência

1. Capture imagens fluorescentes usando um microscópio confocal apropriado.

Resultados

A tecnologia de esferóide tridimensional está avançando a compreensão de interações do droga-tumor porque é mais representativa do ambiente cancro-específico. A geração de esferóides pode ser alcançada de várias maneiras; as placas da baixa aderência 96-well foram usadas neste protocolo. Depois de testar vários produtos de diferentes fabricantes, as placas usadas aqui foram escolhidos porque eles consistentemente realizada melhor em termos de produção de esferóide bem sucedida e uniformid...

Discussão

Uma maneira nova de criar esferoides da pilha de cancro para a identificação da atividade migrastatic da droga usando a microscopia confocal de alta resolução é descrita. O uso de placas aderentes baixas sobre outras técnicas, como gotas suspensas¹⁵, facilitou um meio de gerar esferóides reprodutíveis e uniformes para uso nos ensaios de migração e invasão de colágeno. Os pontos críticos neste protocolo são a remoção do meio de crescimento da placa 96-well antes do esferóide da pilha que encaixa em...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colágeno I, cauda de rato, 100 mg	Corning	354236	para ensaio de invasão de glioma; isso é oferecido por muitos distribuidores / fabricantes e precisará ser determinado para o tipo de ensaio pretendido e as linhas celulares usadas. Para linhagens de células de câncer de glioma, o colágeno de cauda de rato tipo 1 (por exemplo, Corning) é a escolha preferida. O colágeno deve ser armazenado a 4 & C, no escuro, até que seja necessário. Não é aconselhável misturar colágeno de diferentes lotes, pois isso pode afetar a consistência do colágeno polimerizado.
Lamínulas	várias		para imagens de microscopia
DMEM em pó	Sigma	D5648	necessário na concentração de 5x para solução de colágeno para ensaio de invasão de glioma;   Este pode ser adquirido em pó, feito em água bidestilada e, dependendo da composição final do meio de cultura, completado com quaisquer aditivos necessários. A solução 5x completa deve ser filtrada através de um sistema de filtro de seringa (0,22 μ m) antes do uso.
Soro fetal de bezerro	Sigma	F7524-500ML	necessário para cultura celular de linhas celulares de glioma
Lâminas de vidro	vários	vários	para imagens microscópicas
Alta glicose DMEM	Gibco	41965062	necessário para cultura celular de linhas celulares de glioma
Inibidor	Tocris	vários	vários - de acordo com o projeto experimental; os inibidores podem ser adquiridos de fabricantes como Selleckchem e Tocris. Esses fabricantes oferecem descrição detalhada das características do inibidor, links para referências associadas e sugestão de concentrações de trabalho. Tal como acontece com todos os inibidores, eles podem ser potencialmente tóxicos e devem ser manuseados de acordo com as diretrizes de saúde e segurança. Os inibidores são preparados como soluções de estoque, conforme recomendado pelo fabricante. Como exemplo, usamos o inibidor de enxaqueca MI-192 para demonstrar o uso de tais inibidores. Testamos uma variedade de inibidores da enxaqueca dessa maneira com resultados comparáveis.
Montagem	de vários		para imagens microscópicas
NaOH (1 M)	vários	vários	NaOH podem ser adquiridos na molaridade necessária ou preparados a partir da forma sólida. A solução preparada deve ser esterilizada por filtro usando um sistema de filtro de seringa. One M NaOH é corrosivo e deve-se tomar cuidado durante a preparação da solução.
Paraformaldeído	vários	vários	para fixar esferoides e células; maquiagem a 4%, cuidado com o risco à saúde, garantir que os regulamentos de saúde e segurança sejam cumpridos para a solução de colágeno para ensaio
de invasão Pastettes (pipeta graduada, 3 mL)	vários	vários para	ensaio de invasão, remoção de solução
PBS, estéril para cultura de tecidos	Sigma	D1408-500ML	necessário para cultura celular de linhagens celulares de glioma e lavagens para coloração
Pen/estreptococos (antibióticos)	Sigma	P4333	necessário para a cultura celular de linhas celulares de glioma
Anticorpo primário, anticorpo secundário, DAPI, Faloidina	vários	vários existem	muitos fabricantes para esses reagentes, para anticorpos marcados secundários, recomendamos Alexa Fluor (Sondas Moleculares). Aqui usamos para anticorpos primários anticorpo de tubulina anti-acetilada de camundongo (1/100, Abcam). Para anticorpos secundários, usamos 1/500 anticorpo conjugado Alexa Fluor 488 anti-camundongo, Sondas Moleculares. Para a coloração nuclear, usamos DAPI (muitos fabricantes) e a coloração de actina Faloidina (muitos fabricantes), ambos usados na diluição recomendada de 1/500.
Bicarbonato de sódio	Sigma	S5761	necessário para solução de colágeno para ensaio de invasão de glioma na concentração de 5x
Piruvato de sódio	Sigma	P5280	necessário para solução de colágeno para ensaio de invasão de glioma na concentração de 5x
Tripsina	Sigma	T4049	para tripsinização
Placas de fixação ultra baixa	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	para ensaio de invasão de glioma; É necessária uma placa de baixa aderência, com placas de 96 poços preferidas para permitir a triagem em larga escala dos compostos sob investigação. Existem várias placas de baixa aderência disponíveis comercialmente; É aconselhável testar uma variedade de placas para uma geração ideal de esferóides. Em nossa experiência, o Costar Ultra Low Cluster com tampa, fundo redondo, funciona melhor para a geração de esferóides a partir de células cancerígenas de glioma em termos de 100% de formação e reprodutibilidade de esferóides. Essas placas também foram usadas com sucesso para a geração de esferóides de glioma a partir de material derivado de pacientes, células de câncer de bexiga e ovário em nosso laboratório. Além disso, neuroesferas de caule ou progenitoras podem ser usadas nessas placas para facilitar a geração de esferoides de neuroesferas padronizados
Stripettes (pipetas sorológicas, estéreis, 5 mL e 10 mL)	vários, por exemplo, Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	para cultura de tecidos e preparação de colágeno
Vários multicanais (50 - 250 μ L) e pipetas monocanal (10 μ L, 50 μ L, 200 μ L 1 mL)	vários	vários	para manuseio de células e esferoides
Microscopia de campo amplo	vários	várias	para observação da geração de esferóides e imagens de esferóides; aqui imagens de fluorescência de campo amplo foram capturadas usando um sistema de imagem de células EVOS FL (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipado com uma objetiva de óleo Plan Apochromat 63x 1.4 NA	Zeiss	do fabricante	As imagens confocais foram capturadas usando uma objetiva de óleo Zeiss LSM 880 CLSM equipada com uma objetiva de óleo Plan Apochromat 63x 1.4 NA. Lasers de diodo 405nm, 458/488/514nm argônio multilinha e HeNe 594nm foram usados para excitar Faloidina 594, Alexa Fluor 488 e DAPI, respectivamente. Para cada imagem, uma única seção óptica representativa foi capturada, com todas as configurações, pré e pós-captura de imagem, mantidas para fins comparativos. Todas as imagens foram posteriormente processadas usando o software de imagem Zen associado e o Adobe Photoshop.

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