A atividade fagocítica do macrófago contra as células cancerosas, especificamente as células carcinomas mamárias do camundongo 4T1, foi imagemda neste estudo. O modelo de cocultura de células vivas foi estabelecido e observado por meio de uma combinação de microscopia de contraste de interferência fluorescente e diferencial. Esta avaliação foi imagemdo usando o software de imagem para desenvolver multiponto de vídeo time-lapse.
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Artigo de método
Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures
Neste artigo
Resumo
Resumo
Macrófagos associados ao tumor (TAMs) têm sido identificados como um componente importante para o crescimento do tumor, invasão, metástase e resistência às terapias contra o câncer. No entanto, macrófagos associados ao tumor podem ser prejudiciais ao tumor, dependendo do microambiente tumoral e podem alterar reversivelmente suas características fenotípicas, antagonizando a atividade citotóxica das células imunes ou melhorando a resposta antitumoral. As ações moleculares dos macrófagos e suas interações com células tumorais (por exemplo, fagocitose) não foram amplamente estudadas. Portanto, a interação entre as células imunes (M1/M2-subtipo TAM) e células cancerosas no microambiente tumoral é agora um foco da pesquisa de imunoterapia do câncer. No presente estudo, foi desenvolvido um modelo de cocultura celular ao vivo de macrófagos M1 induzidos e células carcinoma mamárias de camundongos 4T1 para avaliar a atividade fagocítica dos macrófagos usando um recurso de vídeo de lapso de tempo usando microscopia de contraste de interferência de contraste de fase, fluorescente e diferencial (DIC). O método atual pode observar e documentar imagens multiponto de células vivas de fagocitose. A fagocitose das células 4T1 por macrófagos M1 pode ser observada usando microscopia fluorescente antes de colorir células 4T1 com esucinta de carboxyfluorescein (CFSE). A publicação atual descreve como cocultura macrófagos e células tumorais em um único prato de imagem, polarizar macrófagos M1, e gravar eventos multiponto de macrófagos engolindo células 4T1 durante 13 h de cocultura.
Introdução
Macrófagos são a primeira linha de defesa imunológica e desempenham um papel na orquestração de respostas imunes contra patógenos e materiais estranhos, incluindo células cancerosas. Eles são um phagocito especializado que destrói e se livra de partículas indesejadas no corpo. Macrófagos contribuem com funções defensivas, como a limpeza de células apoptóticas e microorganismos e o recrutamento de outras células imunes1. Macrófagos podem se diferenciar em dois tipos diferentes, macrófagos M1 e M2, em resposta aos sinais ambientais2. Macrófagos polarizados por M1 (ou seja, macrófagos ativados classicamente) são ativados pe....
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Protocolo
NOTA: As seções 1-6 descrevem o modelo de cocultura das células carcinoma mamárias do camundongo 4T1 e macrófagos de camundongos RAW 264,7. A seção 7 descreve a avaliação do lapso de tempo das células 4T1 phagocyted dos macrófagos M1.
1. Culturing 4T1 mouse células carcinoma mamária e RAW 264,7 macrófagos do mouse
- Descongele um frasco de 4T1 criogenicamente preservado e RAW 264,7 células de passagem 6 por agitação suave em um banho de água a 37 °C ou a temperatura de crescimento normal para as linhas celulares.
NOTA: O descongelamento deve ser feito rapidamente, aproximadamente dentro de 2 min. Para evitar a contaminação, retir....
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Resultados
As imagens bidimensionais (2D) de lapso de tempo do modelo de cocultura das linhas celulares do carcinoma mamária do camundongo 4T1 mostram as células 4T1 sendo engolidas por macrófagos M1 durante um período de 13 h. É importante garantir uma polarização completa dos macrófagos M1 realizando imunomanchas. Os resultados(Figura 1)mostram que a concentração de 100 lipopolissacarídeos ng/mL (LPS) e 20 ng/mL IFN-γ polarizou RAW 264,7 macrófagos no estado m1. Rotular as células-alvo com um corante.......
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Discussão
O protocolo descrito requer duas etapas: 1) cocultura de células carcinoma mamárias 4T1 e macrófagos polarizados por M1 e 2) avaliação da atividade fagocítica do macrófago usando microscopia de lapso de tempo. A cocultura de células vivas é amplamente utilizada na falese e ensaios migratórios. O modelo de cocultura de células vivas aqui é um procedimento simples e adaptável in vitro(Figura 2)que utiliza um corante fluorescente, cfse, que é usado para rotular as células-alvo 4T1. Isso é usado.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado financeiramente por Geran Putra Berimpak (GBP), Universidades Putra Malásia: 9542800. Gostaríamos de agradecer aos laboratórios do Instituto Agro-Biotecnologia, malásia (ABI) e à instalação de imagem de microscopia. Um agradecimento especial a Mohd Daniel Hazim para ajudar na edição e gravação do vídeo experimental para este trabalho.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-INOS conjugado FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µ g em 1 mL |
| de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol, dicloridrato) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/glicose alta | HyClone | SH30003.04 | 670,0 g |
| Soro fetal bovino | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolissacarídeos | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Interferon-gama recombinante de camundongo | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µ g |
| Solução de penicilina-estreptomicina | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Solução salina tamponada com fosfato | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pacotes |
| de tripsina EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µ Ponteiras de pipeta L | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 ponteiras/caixa |
| Pipeta sorológica de 2 mL | JET BIOFIL | GSP012002 | Não priogênico |
| 200 µ Pontas de pipeta L | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20.000 tps/caixa |
| 25 cm2 frasco de cultura de células | Corning | CLS430639 | Tratamento de cultura de tecidos |
| Centrífuga de bancada | Dynamica | FA15C | Modelo: Velocity 14R |
| Exaustor de segurança biológica | Nuaire | NU-565-400 | Modelo: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Classe II, Tipo B2 Exaustor de Biossegurança |
| Misturador de CO2/ar | Chamlide (Instrumento de Célula Viva) | FC-R-20 | FC-5 (Misturador de CO2/Ar) com o medidor de vazão |
| Raspador de células | NEST | 710001 | |
| Incubadora de células de CO2 | Panasonic | N/A | Modelo: MCO-19M(UV) |
| Microscópio confocal | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Prato de fundo de vidro | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| Software de elementos NIS | Nikon Instruments Inc. | Disponível para download | |
| Controlador de pipeta | CappAid | PA-100 | CappController controlador de pipeta, 0,1-100ml |
| Termostato | Shinko | Descontinuado | JCS-33A 48 x 48 x 96,5 mm |
Referências
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A.
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Reimpressões e permissões
