Isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados

Resumo

O objetivo deste protocolo é isolar microvasos de várias regiões do sistema nervoso central de vertebrados lissencefálicos e girofálicos.

Resumo

O isolamento de microvasos do sistema nervoso central (SNC) é comumente realizado apartir da combinação de tecido cortical de múltiplos animais, na maioria das vezes roedores. Esta abordagem limita o interrogatório de propriedades de barreira sangue-cérebro (BBB) ao córtex e não permite a comparação individual. Este projeto se concentra no desenvolvimento de um método de isolamento que permite a comparação da unidade neurovascular (NVU) de várias regiões do SNC: córtex, cerebelo, lobo óptico, hipotálamo, pituitário, tronco cerebral e medula espinhal. Além disso, este protocolo, originalmente desenvolvido para amostras de urina, foi adaptado com sucesso para uso em tecidos do SNC de pequenas e grandes espécies de vertebrados das quais também somos capazes de isolar microvasos da matéria branca do hemisfério cerebral. Este método, quando emparelhado com imunorotulagem, permite a quantidade de expressão proteica e comparação estatística entre indivíduos, tipo de tecido ou tratamento. Provamos essa aplicabilidade avaliando mudanças na expressão de proteínas durante encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo de urina de uma doença neuroinflamatória, esclerose múltipla. Além disso, micronavios isolados por este método poderiam ser usados para aplicações a jusante como qPCR, RNA-seq e mancha ocidental, entre outros. Mesmo que esta não seja a primeira tentativa de isolar micronavios do SNC sem o uso de ultracentrifugação ou dissociação enzimática, é único em sua adeptness para a comparação de indivíduos solteiros e múltiplas regiões do SNC. Portanto, permite a investigação de uma série de diferenças que, de outra forma, podem permanecer obscuras: porções do SNC (córtex, cerebelo, lobo óptico, tronco cerebral, hipotálamo, hipófise e medula espinhal), tipo de tecido cns (matéria cinzenta ou branca), indivíduos, grupos de tratamento experimental e espécies.

Introdução

Nosso cérebro é o órgão mais importante do nosso corpo. Por esta razão, manter a homeostase cerebral, apesar de fatores externos que podem desencadear um desvio da normalidade é uma prioridade. De acordo com alguns estudiosos, cerca de 400-500 milhões de anos atrás¹, animais vertebrados desenvolveram o que hoje conhecemos como a barreira hemato-hematograse (BBB)^2,3. Esta "cerca" protetora exerce a maior influência sobre a homeostase e as funções do sistema nervoso central (SNC), regulando firmemente o transporte de íons, moléculas e células entre sangue e snc. parenchyma. Quando o BBB é....

Protocolo

Todos os procedimentos do presente estudo estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Universidade da Califórnia (UC), Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). O cuidado animal em UC Davis é regulado por diversos recursos independentes e foi acreditado inteiramente pela associação para a avaliação e o accreditation do animal do laboratório internacional (AAALAC) desde 1966. Tecidos sincie foram obtidos do Departamento de Ciências Animais da UCD, Laboratório de Ciências da Carne. Tecidos do SNC de macacos rhesus foram obtidos do Departamento Nacional de Patologia do Centro de Pesquisa de Primatas da Califórnia (NIH P51OD011107). Nenhuma anest....

Resultados

Microvasos isolados do CNS de urina mostraram todos os componentes celulares intrínsecos da unidade neurovascular^2,3. Usando molécula de adesão de plaquetas endotelial-1 (PECAM, também conhecida como CD31) ou isolectinA IB4 (uma glicoproteína que liga o glycocalyx endotelilista) para células endotélias, plaquetas derivaram fator de crescimento-β (PDGFRβ) ou antígeno neuronal-glial 2 (NG2) para pericitos e aquaporina-4 (AQP4) para .......

Discussão

O BBB inclui as propriedades únicas das células endotélias de microvasculatura cerebral juntamente com uma arquitetura sofisticada de junções apertadas, aderentes, "peg-soquete" e placas de adesão críticas para a homeostase^doSNC^2,3,19. As propriedades das células endotélias são induzidas e mantidas pelos pericitos e pelos processos circundantes astroglia end-foot^2,3,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10X PBS	ThermoFisher	BP39920	Usado para bloqueio e diluente de anticorpos.
20% PFA	Microscopia Eletrônica Sciences	15713-S	Usado como fixador (4% PFA)
70.000 MW Dextran	Millipore Sigma	9004-54-0	Usado para solução MV-2
Adson Forceps	Fine Science Tools (FST)	11006-12	Usado para remoção de músculo e pele
Adson Forceps, qualidade do aluno	FST	91106-12	Mesmo que acima, mas soro bovino mais barato
albumina (BSA)	Millipore Sigma	A7906-100G	Usado para solução MV-3, bloqueio e diluente de anticorpos
Corning 100 μ m Filtro de células	Millipore Sigma	CLS431752-50EA
Corning 70 μ m Filtro de célula	Millipore Sigma	CLS431751-50EA
Corning Deskwork pontas de baixa ligação	Millipore Sigma	CLS4151	O mesmo que abaixo, mas mais barato.
Cultrex Poli-D-Lisina	R& D	3439-100-01	Usado para revestimento de slides
Burro anti-cabra IgG-ALEXA 555	Thermo	A21432	Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Burro anti-rato IgG-ALEXA 488	Thermo	A21202	Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Burro anti-coelho IgG-ALEXA 488	Thermo	A21206	Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Burro anti-coelho IgG-ALEXA 647	Thermo	A31573	Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Burro anti-rato IgG-DyLight 650	Thermo	SA5-10029	Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Picareta de tecido de duas pontas	FST	18067-11	Usado para remoção de meninges e plexo coróide
Fórceps Dumont #3c	FST	11231-20	Usado para manuseio de tecidos do SNC mais delicados e/ou pequenos (como hipófise)
Dumont #7 Fórceps	FST	11274-20	Usado para dissecção e manuseio do SNC
Dumont #7, estudante	FST	91197-00	O mesmo que acima, mas mais barato
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention Dicas	Eppendorf	22493008	Melhor qualidade do que as dicas acima (mais caras).
Pinça Graefe Extra Fina, serrilhada	FST	11151-10	Usada para remoção
Tesoura Fina, afiada	FST	14060-09	Usada para remoção de saco dural de porco e macaco
Pilão de Vidro 1.5 mL Microcentrifuge Tubo Moedor de Tecidos Homogeneizador, Pacote de 10	Chang Bioscience Inc. (eBay)	GP1.5_10	Usado para pequenos hipotátalos e hipófise vetebrados.
Cabra anti-CXCL12, biotinilada	PeproTech	500-P87BGBT	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada: 1:20.
Cabra anti-JAM-B	R& D	AF1074	Usado como anticorpo primário para avaliar a neuroinflamação. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Cabra anti-rato IgG-ALEXA 488	Thermo	A11001	Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Cabra anti-rato IgG-ALEXA 555	Thermo	A21424	Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Cabra anti-PDGFRβ	R& D	AF1042	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Cabra anti-coelho IgG-ALEXA 555	Thermo	A21249	Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Cabra anti-coelho IgG-DyLight 488	Thermo	35552	Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Cabra anti-rato IgG-DyLight 650	Thermo	SA5-10021	Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Pinça Graefe, ponta curva, dentes 1X2	FST	11054-10	Uso para retenção e agitação da rede de filtro de nylon
HBSS, 1X tampão com cálcio e magnésio	Corning	21-022-CM	Usado para solução MV-1
HEPES, 1M tampão líquido	Corning	25-060-CI	Usado para solução MV-1
Isolectina GS-IB4-Biotina-XX	ThermoFisher Scientific (Thermo)	I21414	Glicoproteína isolada da leguminosa Griffonia simplicifolia que se liga a resíduos de D-galactosil de glicocalysx de células endoteliais. Usado para microvasos do SNC aviários e suínos. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Tesoura LaGrange, serrilhada	FST	14173-12	Usado para dissecção do crânio e laminectomia (exceto porco e macaco)
Millicell EZ slide Unidade de 8 poços	Millipore Sigma	PEZGS0816
Mouse anti-CLDN5	Thermo	35-2500	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todos os espécimes. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Camundongo anti-GGT1	Abcam	ab55138	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Rato anti-humano CD31	R& D	BBA7	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de primatas. Concentração recomendada: 16,5 μ g/mL.
Camundongo anti-NFM	Thermo	RMO-270	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Camundongo anti-&alfa; SMA	Thermo	MA5-11547	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.
Rede de filtro de nylon, rolo	Millipore Sigma	NY6000010	Corte a laser em discos de rede de filtro de 13 mm de diâmetro. Usado para hipotátalo e hipófise vetebrados pequenos.
Redes de filtro de nylon, 25 mm	Millipore Sigma	NY2002500	Usado na maioria dos tecidos do SNC de pequenos vertebrados, exceto hipotálamo e hipófise. Usado para hipotálamo e hipófise de macacos e porcos.
Redes de filtro de nylon, 47 mm	Millipore Sigma	NY2004700	Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos, exceto hipotálamo e hipófise.
Reagente antidesbotamento ProLong Gold com DAPI	ThermoFisher	P36935	Usado para lâminas de lamínula.
Coelho anti-AQP4	Millipore Sigma	A5971	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.
Coelho anti-LSR	Millipore Sigma	SAB2107967	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Coelho anti-NG2	Millipore Sigma	AB5320	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.
Coelho anti-OSP	Abcam	ab53041	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 1 μ g/mL.
Coelho anti-VE-Caderina	Abcam	ab33168	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Coelho anti-ZO-1	Thermo	61-7300	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Rato anti-CD31	Becton Dickinson	BD 550274	Usado como anticorpo primário para microvasos murinos do SNC. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Rato anti-GFAP	Thermo	13-0300	Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.
Rato anti-VCAM-1	Becton Dickinson	BD 553329	Usado como anticorpo primário para avaliar a neuroinflamação. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Solução estéril de Ringer, Frog	Aldon Corporation	IS5066	Usado para anestesia amfibiana
Streptavidin-ALEXA 555	Thermo	S32355	Usado como anticorpo secundário para marcar anticorpos primários biotinilados. Diluição recomendada de 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647	Thermo	S32357	Usado como anticorpo secundário para marcar anticorpos primários biotinilados. Diluição recomendada de 1:500.
Tesoura cirúrgica, afiada	FST	14002-12	Usada para remoção de músculo e pele
Tesoura cirúrgica, afiada-romba	FST	14001-16	Usada para decapitação (exceto porco e macaco)
Suporte de filtro Swinnex, 13 mm	Millipore Sigma	SX0001300	Modificado por corte a laser. Usado para hipotátalo e hipófise vetebrados pequenos.
Suporte de filtro Swinnex, 25 mm	Millipore Sigma	SX0002500	Modificado por corte a laser. Usado na maioria dos tecidos do SNC de pequenos vertebrados, exceto hipotálamo e hipófise. Usado para hipotálamo e hipófise de macacos e porcos.
Suporte de filtro Swinnex, 47 mm	Millipore Sigma	SX0004700	Modificado por corte a laser. Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos, exceto hipotálamo e hipófise.
Triton X-100	ThermoFisher	50-165-7277	Usado para bloqueio e diluente de anticorpos.
Agitador Suspenso Wheaton 120 Vac	VWR (Fornecedor DWK Life Sciences)	62400-904 (DWK #903475)	Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos com triturador de tecidos de 55 mL, exceto hipotálamo e hipófise.
Moedor de tecidos Wheaton Potter-Elvehjem com pilão de PTFE, 10 mL	VWR (Fornecedor DWK Life Sciences)	14231-384 (DWK #357979)	Usado na maioria dos tecidos do SNC de pequenos vertebrados, exceto hipotálamo e hipófise. Usado para hipotálamo e hipófise de macacos e porcos.
Moedor de tecidos Wheaton Potter-Elvehjem com pilão de PTFE, 55 mL	VWR (Fornecedor DWK Life Sciences)	14231-372 (DWK #357994)	Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos, exceto hipotálamo e hipófise.

óssea