Artigo de método

Isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados

DOI:

10.3791/60291

⸱

12 de janeiro de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Cell Biology, University of California Davis, 2University of Veterinary Medicine Hannover Foundation

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo deste protocolo é isolar microvasos de várias regiões do sistema nervoso central de vertebrados lissencefálicos e girofálicos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O isolamento de microvasos do sistema nervoso central (SNC) é comumente realizado apartir da combinação de tecido cortical de múltiplos animais, na maioria das vezes roedores. Esta abordagem limita o interrogatório de propriedades de barreira sangue-cérebro (BBB) ao córtex e não permite a comparação individual. Este projeto se concentra no desenvolvimento de um método de isolamento que permite a comparação da unidade neurovascular (NVU) de várias regiões do SNC: córtex, cerebelo, lobo óptico, hipotálamo, pituitário, tronco cerebral e medula espinhal. Além disso, este protocolo, originalmente desenvolvido para amostras de urina, foi adaptado com sucesso para uso em tecidos do SNC de pequenas e grandes espécies de vertebrados das quais também somos capazes de isolar microvasos da matéria branca do hemisfério cerebral. Este método, quando emparelhado com imunorotulagem, permite a quantidade de expressão proteica e comparação estatística entre indivíduos, tipo de tecido ou tratamento. Provamos essa aplicabilidade avaliando mudanças na expressão de proteínas durante encefalomielite autoimune experimental (EAE), um modelo de urina de uma doença neuroinflamatória, esclerose múltipla. Além disso, micronavios isolados por este método poderiam ser usados para aplicações a jusante como qPCR, RNA-seq e mancha ocidental, entre outros. Mesmo que esta não seja a primeira tentativa de isolar micronavios do SNC sem o uso de ultracentrifugação ou dissociação enzimática, é único em sua adeptness para a comparação de indivíduos solteiros e múltiplas regiões do SNC. Portanto, permite a investigação de uma série de diferenças que, de outra forma, podem permanecer obscuras: porções do SNC (córtex, cerebelo, lobo óptico, tronco cerebral, hipotálamo, hipófise e medula espinhal), tipo de tecido cns (matéria cinzenta ou branca), indivíduos, grupos de tratamento experimental e espécies.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nosso cérebro é o órgão mais importante do nosso corpo. Por esta razão, manter a homeostase cerebral, apesar de fatores externos que podem desencadear um desvio da normalidade é uma prioridade. De acordo com alguns estudiosos, cerca de 400-500 milhões de anos atrás1, animais vertebrados desenvolveram o que hoje conhecemos como a barreira hemato-hematograse (BBB)2,3. Esta "cerca" protetora exerce a maior influência sobre a homeostase e as funções do sistema nervoso central (SNC), regulando firmemente o transporte de íons, moléculas e células entre sangue e snc. parenchyma. Quando o BBB é interrompido, o cérebro torna-se suscetível à exposição tóxica, infecção e inflamação. Portanto, a disfunção BBB está associada a muitos distúrbios neurológicos e neurodesenvolvimentais4,5,6.

A função sofisticada do BBB é atribuída à microvasculatura cns única conformada pela unidade neurovascular (NVU)2,3. Células endotélias altamente especializadas, pericitos e pés finais ascícticos são os componentes celulares do NVU2,3. A matriz extracelular gerada por essas células também é essencial para a fisiologia NVU e BBB2,3. Embora componentes celulares e moleculares essenciais do NVU sejam conservados entre vertebrados, a heterogeneidade é relatada entre ordens eespécies 7,8. No entanto, limitações técnicas impedem nossa capacidade de considerar plenamente essas diferenças em pesquisa sonoridade, biomédica ou translacional.

Devido a isso, expandimos um método de isolamento de micronavios específico da região do SNC para torná-lo aplicável a inúmeras espécies de todos os cinco grupos vertebrados: peixes, anfíbios, répteis, aves e mamíferos. O protocolo é descrito para uso em vertebrados pequenos lissencefálicos e de grande girofálico, incluindo espécies com relevância translacional9. Além disso, incluímos outras regiões do SNC não investigadas antes neste contexto, mas relevantes para a neurofisiologia e com tremendas implicações clínicas: hipotálamo, hipófise e matéria branca. Por fim, testamos a capacidade deste método de isolamento como uma ferramenta confiável paraidentificar mudanças na expressão de proteínas ao longo da NVU e/ou BBB9,10,11. Como prova de conceito, mostramos como determinar as mudanças na expressão VCAM-1 e JAM-B durante o EAE usando o método de isolamento seguido de imunofluorescência.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos do presente estudo estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Universidade da Califórnia (UC), Davis Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). O cuidado animal em UC Davis é regulado por diversos recursos independentes e foi acreditado inteiramente pela associação para a avaliação e o accreditation do animal do laboratório internacional (AAALAC) desde 1966. Tecidos sincie foram obtidos do Departamento de Ciências Animais da UCD, Laboratório de Ciências da Carne. Tecidos do SNC de macacos rhesus foram obtidos do Departamento Nacional de Patologia do Centro de Pesquisa de Primatas da Califórnia (NIH P51OD011107). Nenhuma anestesia, eutanásia ou necropsia foi realizada por funcionários de laboratório em porcos e macacos. Portanto, não existem recomendações particulares sobre essas questões.

NOTA: Este método foi validado para várias espécies, mas o protocolo fornecido corresponde mais diretamente aos tecidos de camundongos e suínos. Detalhes relativos ao lobo óptico não se aplicam ao usar espécimes de mamíferos. Todos os materiais bioperigosos devem ser tratados em uma instalação adequada de nível de biossegurança (BSL). Todos os materiais agudamente tóxicos devem ser manipulados debaixo de um capô de fumaça. Todos os resíduos médicos bioperigosos e resíduos agudamente tóxicos devem ser eliminados adequadamente.

1. Preparação

  1. Prepare soluções(Tabela 1)pelo menos um dia antes.
    NOTA: É muito difícil dissolver 70 kDa peso molecular (MW) dextran. É mais eficiente deixar a solução agitar durante a noite coberta com filme de parafina ou folha. O protocolo requer o uso de duas soluções mv-2 diferentes, dependendo do espécime investigação. O dextran de 18% separa eficientemente a mielina da pelota do micronavio ao executar o protocolo em espécimes lissencephalic pequenos. No entanto, desenvolve uma mancha de mielina dentro da interface dos tecidos do SNC a partir de grandes espécimes girosféricos, bem como o hipotálamo e o pituitário de pequenos espécimes. Esta mancha é impedida usando 20% dextran.
  2. Prepare-os slides bem carregando 50 μL por poço de poli-D-lisina e deixe secar por 2 h à temperatura ambiente (RT), de preferência em um gabinete de segurança biológica classe 2 (BSC-2). Não se cansar. Lave duas vezes com soro soro para os soro vermelho-fosfato (PBS) e mantenha na geladeira até que esteja pronto para uso.

2. Dissecção de tecido cns de pequeno espécime de vertebrados lissencefálicos

NOTA: O artigo demonstra a aplicação do protocolo em um C57BL6/J, 10 semanas de idade, ~ 25 g, rato macho.

  1. Prepare dois tubos cônicos de 15 mL e um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL com 5 mL e 1 mL, respectivamente, de solução MV-1 por espécime. Mantenha tubos no gelo.
  2. Anesthetization
    1. Camundongos anestesos por injeção intraperitoneal de um coquetel anestésico de cetamina, xilacina e acepromazine em 100/10/3 mg por kg de peso corporal e spray com 70% de etanol. Confirme a anestesia avaliando a ausência de reflexos palpebral e pedal tocando um olho e beliscando um pé, respectivamente.
    2. Pombos anestesia por inalação de 5% isoflurano usando uma caixa de anestesia de indução.
    3. Anestesie peixes e rãs em 1% tricaino em um peixe segurando tanque de água ou solução de anfíbio ringer(Mesa de Materiais), respectivamente.
    4. Anestesie lagartos refrigerando a 4 °C antes da eutanásia.
  3. Decapite o animal com tesoura cirúrgica, descasque a pele com fórceps para expor o crânio, e corte com tesourala lagrange através do foramen magnum (Figura 1A).
  4. Dissecar o cérebro com uma espátula e transferir para um tubo cônico de 15 mL com solução MV-1. Mantenha tubo no gelo.
  5. Recuperar o pituitário da sella turcica do crânio com fórceps e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL com solução MV-1. Mantenha tubo no gelo.
  6. Retire a pele e o músculo para expor a coluna vertebral. Cortar os membros, caixa torácica, e órgãos internos (Figura 1B).
  7. Dissecar a medula espinhal por um dos dois métodos descritos abaixo. Em seguida, transfira para um tubo cônico de 5 mL com solução MV-1. Mantenha tubo no gelo.
    1. Realizar laminectomia cortando em uma direção rostral para caudal com tesoura LaGrange, começando através do foramen vertebralcervical , até chegar ao cordão lombar.
    2. Executar rubor em uma direção caudal para rostral em todo o foramen lombar vertebral com uma agulha de 18 G e seringa de 10 mL carregado com solução MV-1 (Figura 1C,D).
      NOTA: Este método só funciona com espécimes muito pequenos, principalmente roedores (<100 g).
  8. Usando um escopo de dissecação, corte o saco dural da medula espinhal com tesoura de mola e retire as meninges restantes com uma escolha dupla(Figura 2).
  9. Transfira o cérebro para uma placa de Petri e, usando um escopo de dissecação, retire as meninges com uma escolha dupla(Figura 2A-C).
  10. Excise os bulbos e o tálamo olfativos com fórceps, tesouras da íris, e tesouras da mola. Usando a picareta dobro-facetada, remova o plexo choroid de todos os ventrículos do cérebro. Certifique-se de remover todo o plexo choroide.
    NOTA: O plexo choroid e as lâmpadas olfativas são uma fonte maciça de contaminação. Em contraste com o BBB, esses capilares são altamente fenestrated e os resultados dos experimentos subseqüentes serão comprometidos se eles não forem removidos.
  11. Usando fórceps, separe as regiões distintas do SNC: córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico (não em espécimes de mamíferos) e hipotálamo.

3. Dissecção de tecido cns de um grande espécime de vertebrados gyrencefálicos

NOTA: Este protocolo utiliza tecidos snc sinéci obtidos a partir de um matadouro. Portanto, nenhuma anestesia, eutanásia ou necropsia é descrita ou mostrada aqui.

  1. Transporte de tecidos sinitios CNS em um recipiente de histologia de 0,946 L (32 oz) carregado com solução MV-1 dentro de um baú de gelo / balde.
  2. Usando um escopo de dissecação, retire as meninges com uma picareta de duas pontas, fórceps, tesoura de íris e tesouras de mola de cada tecido do SNC. Certifique-se de remover todos os pedaços de plexo choroide do cérebro ventrículos.

4. Homogeneização do tecido do SNC

NOTA: É mais eficiente quando dois investigadores se envolvem no processo de homogeneização: um dissecando as meninges o estereoscópio e o outro homogeneizando os tecidos picados. Desta forma, os tecidos são rapidamente devolvidos ao balde de gelo e mantidos frios.

  1. Coloque cada região cns em uma placa de Petri com ~ 1 mL de solução MV-1. Usando uma lâmina de borda única, picar o tecido para obter 1-2 mm pedaços.
    1. Para um pequeno espécime de vertebrados, use uma placa de Petri de 100 mm x 20 mm.
    2. Para um grande espécime de vertebrados, use uma placa de Petri de 150 mm x 15 mm.
  2. Homogeneização de um pequeno espécime de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3)
    1. Transfira o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e medula espinhal para ~1 mL de solução MV-1 em um moedor de tecido de vidro individual de 10 mL Potter-Elvehjem com um pilão PTFE usando uma pipeta de transferência. Adicione 5 mL de solução MV-1 e homogeneize cada tecido (~10 cursos). Transfira para tubos cônicos individuais de 15 mL. Mantenha tubos no gelo.
      NOTA: Para um pequeno vertebrado, 5 ou 4, com ou sem lóbulo óptico, respectivamente, são necessários 10 moedores mL Potter-Elvehjem e 15 tubos cônicos mL.
    2. Transfira o hipotálamo e o pituitário com fórceps para ~100 μL da solução MV-1 em um tubo individual de 1,7 mL e homogeneize cuidadosamente com um micropestle de vidro. Lave cada micropestle com ~1 mL da solução MV-1. Mantenha tubo no gelo.
      NOTA: Para um pequeno vertebrado, são necessários 2 micropestles de vidro e tubos de 1,7 mL.
  3. Homogeneização de um grande espécime de vertebrado(Tabela 4 e Tabela 5)
    1. Usando uma pipeta de transferência, transfira o tecido picado para um moedor de tecido de vidro De 55 mL Potter-Elvehjem com um pilão PTFE e anexar ao agitador aéreo. Adicione metade do volume recomendado da solução MV-1, de acordo com a parcela específica do SNC sendo homogeneizada(Tabela 5).
    2. Ligue o agitador aéreo em velocidade muito baixa (~ 150 rpm) e mova cuidadosamente o tubo de vidro para cima e para baixo por cerca de 30 s.
    3. Desligue o agitador aéreo, adicione mais solução MV-1 e repita o passo 4.3.2 até obter uma pasta homogênea.
    4. Transfira para um tubo cônico de 50 mL. Mantenha tubo no gelo.
    5. Lave o moedor com água desionizada entre cada homogeneização do tecido do SNC.
      NOTA: Para um grande vertebrado 5 ou 4, com ou sem matéria branca, respectivamente, 50 tubos cônicos mL são necessários. Da mesma forma, dois (2) 15 mL tubos cônicos são necessários para o hipotálamo e pituitário.

5. Purificação de micronavios

  1. Homogeneados de tecido de centrífuga resultantes do passo 4.2.1, 4.2.2, ou 4.3.4 a 2.000 x g para 10 min em 4 °C. Uma grande interface branca de mielina se formará na parte superior das pelotas dos micronavioes avermelhados. Descarte os supernatantes.
    1. Pequeno espécime de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3)
      1. Resuspenda o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e pelotas da medula espinhal em 5 mL de solução MV-2 gelada com uma pipeta sorológica de 5 mL (~10 flushes). Adicione 5 mL de solução MV-2 gelada para cada suspensão e misture cuidadosamente lançando os tubos.
      2. Resuspenda as pelotas hipotálamas e pituitárias com 1 mL da solução MV-2.
    2. Grande espécime de vertebrado(Tabela 4 e Tabela 5)
      1. Adicione 20 mL de solução MV-2 gelada para o córtex, cerebelo, tronco cerebral e pelotas de microvaso da medula espinhal. Resuspenda as pelotas misturando em um revólver do tubo, agitando em 40 rpm para ~5 min. Balance os volumes dos tubos cónicos do córtex, do cerebelo, do tronco cerebral, e das suspensões da medula espinal adicionando mais solução MV-2.
      2. Resuspenda as pelotas de micronavio hipotálamo e pituitário em 5 mL da solução MV-2 com uma pipeta sorológica de 5 mL (~10 flushes). Adicione 5 mL de solução MV-2 gelada para as suspensões e misture cuidadosamente lançando o tubo.
  2. Centrífuga a 4.400 x g por 15 min a 4 °C.
  3. Cuidadosamente destacar a camada de mielina espessa e densa na interface líquida das paredes de cada tubo, girando lentamente os tubos e permitindo que o supernatant passe ao longo das paredes.
  4. Descarte a interface de mielina e líquido e borre a parede interna de cada tubo com uma espátula embrulhada com uma limpeza de papel de fiapos baixo. Para pequenos espécimes de vertebrados, retire a camada de mielina de cada hipotálamo e tubo pituitário por sucção cuidadosamente com uma pipeta de transferência.
  5. Limpe o excesso de líquido com uma limpeza de papel de fiapo rasteiro torcido. Resuspenda cada pelota com 1 mL da solução MV-3 usando pontas low-binding. Mantenha tubos no gelo.

6. Elução e Filtração de Micronavios

  1. Despeje a solução MV-3 gelada em taças individuais para cada região do SNC. Mantenha-se a 4 °C.
    1. Para pequenos espécimes de vertebrados, use 10 mL de solução MV-3 por copo de 50 mL. Um total de 6-7 taças é necessária dependendo se o lobo óptico está incluído ou não.
    2. Para grandes espécimes de vertebrados, use 30 mL de solução MV-3 por copo de 100 mL. Um total de 6-7 taças é necessária dependendo se a matéria branca está incluída ou não.
  2. Coloque um filtro de célula em cima de um tubo cônico de 50 mL. Use um por região do SNC. Use um filtro de 100 μm para o córtex, tronco cerebral, lobo óptico, medula espinhal e pituitário. Use um filtro de células de 70 μm para o cerebelo e hipotálamo.
  3. Molhe cada filtro com 1 mL de solução MV-3 gelada.
  4. Adicione mais solução MV-3 às suspensões preparadas na etapa 5.5 com uma pipeta serológica ao misturar para evitar agregados. Cuidadosamente carregar microvessels em cima do filtro. Enxágüe com a solução MV-3 gelada.
    1. Para pequenos espécimes de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3),adicione 10-15 mL da solução MV-3 com uma pipeta sorológica e lave com 5 mL de solução MV-3.
    2. Para grandes espécimes de vertebrados, adicione 20 mL de solução MV-3 com uma pipeta sorológica e lave com 10 mL de solução MV-3.
  5. Monte a unidade de filtragem colocando um filtro líquido de nylon de 20 μm em um suporte de filtro modificado (Figura 2D),um por região do SNC.
    1. Para pequenos espécimes de vertebrados(Tabela 2 e Tabela 3),use suportes de filtro modificados de 25 mm para o córtex, cerebelo, tronco cerebral, lobo óptico e medula espinhal. Use suportes de filtro modificados de 13 mm para o hipotálamo e hipólitaria.
    2. Para grandes espécimes de vertebrados(Tabela 4 e Tabela 5),use suportes de filtro modificados de 47 mm para o córtex, cerebelo, tronco cerebral e medula espinhal. Use 25 mm para o hipotálamo e hipólitaria.
  6. Coloque o filtro em cima de um tubo cônico de 50 mL e filtro molhado com 5 mL de solução MV-3 gelada certificando-se de que o buffer desça o suporte do filtro para o tubo cônico.
  7. Transfira os micronavioes eluted (da etapa 6.4) sobre o filtro líquido de nylon de 20 μm e lave os microvessels com 5-10 mL da solução MV-3 ice-cold.
  8. Recupere o filtro usando fórceps limpos e mergulhe-o no copo contendo a solução MV-3 gelada preparada na etapa 6.1.
  9. Desaseasse os microvessels do filtro agitando o delicadamente por aproximadamente 30 s. Para pequenos espécimes de vertebrados, despeje o teor de copo em um tubo cônico de 15 mL. Para grandes espécimes de vertebrados, despeje o teor de taça em um tubo cônico de 50 mL.
  10. Centrífuga a 2.000 x g por 5 minutos a 4 °C e resuspender a pelota em 1 mL de gelo-frio MV-3 solução usando uma ponta de pipeta de baixa ligação.
    1. Para pequenos espécimes de vertebrados, transfira a suspensão (do passo 6.10) para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL e centrífuga a 20.000 x g por 5 min a 4 °C.
      NOTA: Esta rotação é realizada em uma centrífuga bancada a uma velocidade máxima (~ 20.000 x g)para garantir um rendimento robusto.
    2. Para grandes espécimes de vertebrados, transfira a suspensão do passo 6.10 para um tubo de microcentrífuga de 5,0 mL, adicione 4 mL da solução MV-3 e centrífuga a 2.000 x g por 5 min a 4 °C.

7. Imunomanchas

NOTA: A coloração hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada em espécimes de répteis, anfíbios e peixes como prova de conceito da viabilidade do protocolo. Portanto, não há recomendação para imunorotulagem para esses espécimes.

  1. Retire o supernatant dos tubos de microcentrífuga.
  2. Resuspenda a pelota em PBS 1x estéril usando uma ponta de pipeta de baixa ligação(Tabela de Materiais). Mantenha os microvessels de dar forma a agregados pipetting épocas múltiplas. Para pequenos espécimes de vertebrados (Tabela 3),use ~100 μL-2.000 μL de acordo com o tamanho da pelota. Para grandes espécimes de vertebrados (Tabela 5),use ~1.000 μL-4.000 μL de acordo com o tamanho da pelota.
  3. Usando uma ponta de pipeta de baixa ligação, transfira os micronavioes para slides bem, tendo o cuidado de adicioná-los ao centro de cada poço, evitando as paredes laterais.
  4. Definir os slides bem, descoberto, dentro de um BSC-2, e deixe secar por 20 a 30 min em RT.
    NOTA: Um volume relativamente alto de 1x PBS é usado para evitar a formação agregada. Devido a isso, é necessário deixar os slides secar antes da fixação para se certificar de que os micronavioes estão sendo mantidos pelo revestimento de poli-D-lisina.
  5. Remover residual 1x PBS por pipetting para fora com uma pipeta de transferência, adicionar 200 μL de 4% paraformaldeído (PFA) e incubar por 30 min em RT.
  6. Pipette a solução fixa e lavar 3x com 200 μL de 1x PBS por 5 min em RT.
    NOTA: A mancha de H&E em micronavios cns de peixes, anfíbios e répteis foi realizada neste momento.
  7. Adicione 200 μL de bloqueio tampão para o poço slide e incubar por 60 min em 37 °C.
  8. Retire o tampão de bloqueio com uma pipeta de transferência e adicione 200 μL do coquetel de anticorpos primários em diluente de anticorpos(Mesa de Materiais). Incubar a 4 °C durante a noite.
  9. Pipette fora o coquetel de anticorpos primários e lavar 3x com 200 μL de 1x PBS por 5 min em RT.
  10. Carregue o coquetel de anticorpos secundários(Mesa de Materiais)diluído em 1x PBS e incubar por 2 h na RT, protegido da luz.
  11. Pipette fora do coquetel de anticorpos secundários e lavar 3x com 200 μL de 1x PBS por 5 min em RT, protegido da luz. Após a última lavagem destacar quadro do bem slide e borrar-sede qualquer excesso de 1x PBS com uma limpeza de papel de fiapos baixo.
  12. Adicione um coverslip, líquido antifade mountant médio, e 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para coloração nuclear. Deixe secar durante a noite em RT protegido da luz.
  13. Uma vez seco, mantenha-se protegido da luz em uma caixa de slides a 4 °C até que esteja pronto para microscopia confocal e aquisição de dados.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microvasos isolados do CNS de urina mostraram todos os componentes celulares intrínsecos da unidade neurovascular2,3. Usando molécula de adesão de plaquetas endotelial-1 (PECAM, também conhecida como CD31) ou isolectinA IB4 (uma glicoproteína que liga o glycocalyx endotelilista) para células endotélias, plaquetas derivaram fator de crescimento-β (PDGFRβ) ou antígeno neuronal-glial 2 (NG2) para pericitos e aquaporina-4 (AQP4) para ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O BBB inclui as propriedades únicas das células endotélias de microvasculatura cerebral juntamente com uma arquitetura sofisticada de junções apertadas, aderentes, "peg-soquete" e placas de adesão críticas para a homeostasedoSNC2,3,19. As propriedades das células endotélias são induzidas e mantidas pelos pericitos e pelos processos circundantes astroglia end-foot2,3,

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Cruz-Orengo foi apoiado pela Universidade da Califórnia, Davis, Escola de Medicina Veterinária Start Up Funds.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10X PBSThermoFisherBP39920Usado para bloqueio e diluente de anticorpos.
20% PFAMicroscopia Eletrônica Sciences15713-SUsado como fixador (4% PFA)
70.000 MW DextranMillipore Sigma9004-54-0Usado para solução MV-2
Adson ForcepsFine Science Tools (FST)11006-12Usado para remoção de músculo e pele
Adson Forceps, qualidade do alunoFST91106-12Mesmo que acima, mas soro bovino mais barato
albumina (BSA)Millipore SigmaA7906-100GUsado para solução MV-3, bloqueio e diluente de anticorpos
Corning 100 μ m Filtro de célulasMillipore SigmaCLS431752-50EA
Corning 70 μ m Filtro de célulaMillipore SigmaCLS431751-50EA
Corning Deskwork pontas de baixa ligaçãoMillipore SigmaCLS4151O mesmo que abaixo, mas mais barato.
Cultrex Poli-D-LisinaR& D3439-100-01Usado para revestimento de slides
Burro anti-cabra IgG-ALEXA 555ThermoA21432Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Burro anti-rato IgG-ALEXA 488ThermoA21202Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Burro anti-coelho IgG-ALEXA 488ThermoA21206Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Burro anti-coelho IgG-ALEXA 647ThermoA31573Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Burro anti-rato IgG-DyLight 650ThermoSA5-10029Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Picareta de tecido de duas pontasFST18067-11Usado para remoção de meninges e plexo coróide
Fórceps Dumont #3cFST11231-20Usado para manuseio de tecidos do SNC mais delicados e/ou pequenos (como hipófise)
Dumont #7 FórcepsFST11274-20Usado para dissecção e manuseio do SNC
Dumont #7, estudanteFST91197-00O mesmo que acima, mas mais barato
ep Dualfilter T.I.P.S. LoRetention DicasEppendorf22493008Melhor qualidade do que as dicas acima (mais caras).
Pinça Graefe Extra Fina, serrilhadaFST11151-10Usada para remoção
Tesoura Fina, afiadaFST14060-09Usada para remoção de saco dural de porco e macaco
Pilão de Vidro 1.5 mL Microcentrifuge Tubo Moedor de Tecidos Homogeneizador, Pacote de 10Chang Bioscience Inc. (eBay)GP1.5_10Usado para pequenos hipotátalos e hipófise vetebrados.
Cabra anti-CXCL12, biotiniladaPeproTech500-P87BGBTUsado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada: 1:20.
Cabra anti-JAM-BR& DAF1074Usado como anticorpo primário para avaliar a neuroinflamação. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Cabra anti-rato IgG-ALEXA 488ThermoA11001Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Cabra anti-rato IgG-ALEXA 555ThermoA21424Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Cabra anti-PDGFRβR& DAF1042Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Cabra anti-coelho IgG-ALEXA 555ThermoA21249Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Cabra anti-coelho IgG-DyLight 488Thermo35552Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Cabra anti-rato IgG-DyLight 650ThermoSA5-10021Usado como anticorpo secundário. Diluição recomendada de 1:200.
Pinça Graefe, ponta curva, dentes 1X2FST11054-10Uso para retenção e agitação da rede de filtro de nylon
HBSS, 1X tampão com cálcio e magnésioCorning21-022-CMUsado para solução MV-1
HEPES, 1M tampão líquidoCorning25-060-CIUsado para solução MV-1
Isolectina GS-IB4-Biotina-XXThermoFisher Scientific (Thermo)I21414Glicoproteína isolada da leguminosa Griffonia simplicifolia que se liga a resíduos de D-galactosil de glicocalysx de células endoteliais. Usado para microvasos do SNC aviários e suínos. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Tesoura LaGrange, serrilhadaFST14173-12Usado para dissecção do crânio e laminectomia (exceto porco e macaco)
Millicell EZ slide Unidade de 8 poçosMillipore SigmaPEZGS0816
Mouse anti-CLDN5Thermo35-2500Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todos os espécimes. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Camundongo anti-GGT1Abcamab55138Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Rato anti-humano CD31R& DBBA7Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de primatas. Concentração recomendada: 16,5 μ g/mL.
Camundongo anti-NFMThermoRMO-270Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Camundongo anti-&alfa; SMAThermoMA5-11547Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.
Rede de filtro de nylon, roloMillipore SigmaNY6000010Corte a laser em discos de rede de filtro de 13 mm de diâmetro. Usado para hipotátalo e hipófise vetebrados pequenos.
Redes de filtro de nylon, 25 mmMillipore SigmaNY2002500Usado na maioria dos tecidos do SNC de pequenos vertebrados, exceto hipotálamo e hipófise. Usado para hipotálamo e hipófise de macacos e porcos.
Redes de filtro de nylon, 47 mmMillipore SigmaNY2004700Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos, exceto hipotálamo e hipófise.
Reagente antidesbotamento ProLong Gold com DAPIThermoFisherP36935Usado para lâminas de lamínula.
Coelho anti-AQP4Millipore SigmaA5971Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.
Coelho anti-LSRMillipore SigmaSAB2107967Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Coelho anti-NG2Millipore SigmaAB5320Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.
Coelho anti-OSPAbcamab53041Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 1 μ g/mL.
Coelho anti-VE-CaderinaAbcamab33168Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Coelho anti-ZO-1Thermo61-7300Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Rato anti-CD31Becton DickinsonBD 550274Usado como anticorpo primário para microvasos murinos do SNC. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Rato anti-GFAPThermo13-0300Usado como anticorpo primário em microvasos do SNC de todas as amostras. Diluição recomendada de 1:200.
Rato anti-VCAM-1Becton DickinsonBD 553329Usado como anticorpo primário para avaliar a neuroinflamação. Concentração recomendada: 5 μ g/mL.
Solução estéril de Ringer, FrogAldon CorporationIS5066Usado para anestesia amfibiana
Streptavidin-ALEXA 555ThermoS32355Usado como anticorpo secundário para marcar anticorpos primários biotinilados. Diluição recomendada de 1:500.
Streptavidin-ALEXA 647ThermoS32357Usado como anticorpo secundário para marcar anticorpos primários biotinilados. Diluição recomendada de 1:500.
Tesoura cirúrgica, afiadaFST14002-12Usada para remoção de músculo e pele
Tesoura cirúrgica, afiada-rombaFST14001-16Usada para decapitação (exceto porco e macaco)
Suporte de filtro Swinnex, 13 mmMillipore SigmaSX0001300Modificado por corte a laser. Usado para hipotátalo e hipófise vetebrados pequenos.
Suporte de filtro Swinnex, 25 mmMillipore SigmaSX0002500Modificado por corte a laser. Usado na maioria dos tecidos do SNC de pequenos vertebrados, exceto hipotálamo e hipófise. Usado para hipotálamo e hipófise de macacos e porcos.
Suporte de filtro Swinnex, 47 mmMillipore SigmaSX0004700Modificado por corte a laser. Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos, exceto hipotálamo e hipófise.
Triton X-100ThermoFisher50-165-7277Usado para bloqueio e diluente de anticorpos.
Agitador Suspenso Wheaton 120 VacVWR (Fornecedor DWK Life Sciences)62400-904 (DWK #903475)Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos com triturador de tecidos de 55 mL, exceto hipotálamo e hipófise.
Moedor de tecidos Wheaton Potter-Elvehjem com pilão de PTFE, 10 mLVWR (Fornecedor DWK Life Sciences)14231-384 (DWK #357979)Usado na maioria dos tecidos do SNC de pequenos vertebrados, exceto hipotálamo e hipófise. Usado para hipotálamo e hipófise de macacos e porcos.
Moedor de tecidos Wheaton Potter-Elvehjem com pilão de PTFE, 55 mLVWR (Fornecedor DWK Life Sciences)14231-372 (DWK #357994)Usado para tecidos do SNC de macacos e porcos, exceto hipotálamo e hipófise.
óssea

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bundgaard, M., Abbott, N. J. All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4-500 million years ago. Glia. 56, 699-708 (2008).
  2. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, a020412(2015).
  3. Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handbook of Clinical Neurology. 133, 39-59 (2016).
  4. Kealy, J., Greene, C., Campbell, M. Blood-brain barrier regulation in psychiatric disorders. Neuroscience Letters. , (2018).
  5. Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nature Neuroscience. 21, 1318-1331 (2018).
  6. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99, 21-78 (2019).
  7. Wilhelm, I., Nyul-Toth, A., Suciu, M., Hermenean, A., Krizbai, I. A. Heterogeneity of the blood-brain barrier. Tissue Barriers. 4, e1143544(2016).
  8. O'Brown, N. M., Pfau, S. J., Gu, C. Bridging barriers: a comparative look at the blood-brain barrier across organisms. Genes & Development. 32, 466-478 (2018).
  9. Cruz-Orengo, L., et al. CXCR7 influences leukocyte entry into the CNS parenchyma by controlling abluminal CXCL12 abundance during autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 208, 327-339 (2011).
  10. Serres, S., et al. VCAM-1-targeted magnetic resonance imaging reveals subclinical disease in a mouse model of multiple sclerosis. FASEB Journal. 25, 4415-4422 (2011).
  11. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  12. Sohet, F., et al. LSR/angulin-1 is a tricellular tight junction protein involved in blood-brain barrier formation. Journal of Cell Biology. 208, 703-711 (2015).
  13. Cruz-Orengo, L., et al. Enhanced sphingosine-1-phosphate receptor 2 expression underlies female CNS autoimmunity susceptibility. Journal of Clinical Investigation. 124, 2571-2584 (2014).
  14. Dayton, J. R., Franke, M. C., Yuan, Y., Cruz-Orengo, L. Straightforward method for singularized and region-specific CNS microvessels isolation. Journal of Neuroscience Methods. 318, 17-33 (2019).
  15. Smyth, L. C. D., et al. Markers for human brain pericytes and smooth muscle cells. Journal of Chemical Neuroanatomy. 92, 48-60 (2018).
  16. Granberg, T., et al. In vivo characterization of cortical and white matter neuroaxonal pathology in early multiple sclerosis. Brain. 140, 2912-2926 (2017).
  17. Datta, G., et al. Neuroinflammation and its relationship to changes in brain volume and white matter lesions in multiple sclerosis. Brain. 140, 2927-2938 (2017).
  18. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging Techniques to Assess Inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. 403, 4-16 (2019).
  19. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  20. Cornford, E., Hyman, S. Localization of brain endothelial luminal and abluminal transporters with immunogold electron microscopy. NeuroRx. 2, 27-43 (2005).
  21. Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. Journal of Visualized Experiments. , 53208(2015).
  22. Paul, D., Cowan, A. E., Ge, S., Pachter, J. S. Novel 3D analysis of Claudin-5 reveals significant endothelial heterogeneity among CNS microvessels. Microvascular Research. , (2012).
  23. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. Journal of Neuroscience Methods. 207, 80-85 (2012).
  24. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  25. Bourassa, P., Tremblay, C., Schneider, J. A., Bennett, D. A., Calon, F. Beta-amyloid pathology in human brain microvessel extracts from the parietal cortex: relation with cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 137, 801-823 (2019).
  26. Porte, B., et al. Proteomic and transcriptomic study of brain microvessels in neonatal and adult mice. PLoS One. 12, e0171048(2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Propriedades da Barreira Hematoencef licaCompara o da Unidade NeurovascularT cnica de Isolamento de MicrovasosDissec o de Tecido do SNCHomogeneiza o em Solu o MV 1Protocolo de Purifica o de MicrovasosM todos de Detec o por Imunomarca oEncefalomielite Autoimune ExperimentalQuantifica o da Express o Proteica

Artigos relacionados