Isolamento e diferenciação de Mioblasts primários de explantes do músculo esquelético do rato

Summary

Os mioblastos estão proliferando células precursoras que se diferenciam para formar miotubos polinucleados e, eventualmente, miofibras musculares esqueléticas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação e a cultura eficientes de mioblastos preliminares dos músculos esqueletais do rato adulto novo. O método permite estudos moleculares, genéticos e metabólicos de células musculares na cultura.

Abstract

Os mioblastos preliminares são precursores proliferating indiferenciados do músculo esqueletal. Eles podem ser cultivados e estudados como precursores musculares ou induzidos a se diferenciar em estágios posteriores do desenvolvimento muscular. O protocolo fornecido aqui descreve um método robusto para o isolamento e a cultura de uma população altamente proliferativa de células mioblastos de explantes de músculo esquelético do rato adulto jovem. Estas pilhas são úteis para o estudo das propriedades metabólicas do músculo esqueletal de modelos diferentes do rato, assim como em outras aplicações a jusante tais como o transfection com ADN exógeno ou a transdução com vetores da expressão viral. O nível de diferenciação e perfil metabólico dessas células depende do comprimento da exposição e da composição dos meios utilizados para induzir a diferenciação mioblástica. Estes métodos fornecem um sistema robusto para o estudo do metabolismo de células musculares do rato ex vivo. É importante ressaltar que, diferentemente dos modelos in vivo, os métodos aqui descritos fornecem uma população celular que pode ser expandida e estudada com altos níveis de reprodutibilidade.

Introduction

Embora muitas vezes citado como uma indicação de saúde metabólica global, vários estudos mostraram que o índice de massa corporal (IMC) em idosos não está consistentemente associado com maior risco de mortalidade. Até o momento, o único fator que se mostrou consistente com a redução da mortalidade nessa população é o aumento da massa muscular¹. O tecido muscular representa uma das maiores fontes de células sensíveis à insulina no corpo e, portanto, é crítico na manutenção da homeostase metabólica geral². A ativação do tecido do músculo esqueletal através do exercício é associada com os aumentos na sensibilidade de insuli....

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da Scripps Research.

1. coleta e processamento de explantes do tecido muscular

1. O dia anterior à dissecção, esterilizar todos os equipamentos de dissecção (fórceps, lâminas de barbear e tesoura) e preparar todos os meios necessários: fosfato tampão salina (PBS), MB chapeamento de mídia (12,5 mL de DMEM, 12,5 mL de PRESUNTOS F12, 20 mL de calor-inativado fetal bovino soro (FBS), 5 mL de suplemento médio líquido amniótico) e solução de revestimento (24 mL de DMEM, 24 mL de PRESUNTOS F12, 1,7 mL de colágeno, 1 mL de matrigel).
2. O dia da dissecção, cubra um prato de 6 ....

Results

Após a seção 1 do protocolo fornecido deve-se produzir células primárias emergindo dos explantes que serão visíveis um microscópio de luz padrão (Figura 2). Uma população heterogênea da pilha será vista crescer fora e em torno de cada explant do tecido do músculo. Os Myoblasts aparecerão como esferas pequenas, redondas, brilhantes. A seção 2 do protocolo produzirá colheitas precoces de mioblasts de explantes teciduais, que conterá poucas células e será hetero.......

Discussion

O músculo esquelético é vital para o estabelecimento e manutenção da homeostase metabólica¹¹. O estudo da fisiologia muscular é complicado pela variabilidade interindividual, bem como dificuldade na obtenção de amostras, particularmente no caso de estudos humanos. Os miotubos preliminares cultivados foram mostrados para recapitular muitas características da fisiologia do músculo, incluindo a homeostase¹²do cálcio, regeneração do tecido danificado⁵do .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
< solução > revestimento: < / forte >
DMEM	Gibco	10569010	Sempre adicione gentamicina (1: 1.000 por volume) antes de usar; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Sempre adicione gentamicina (1: 1.000 por volume) antes de usar; 24 mL
de Collagen	Life Technologies	A1064401	1,7 mL
de Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
Meio de reforço:
DMEM	Gibco	10569010	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 12,5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 12,5 mL
de FBS	Life Technologies	inativadas por calor 16000044	20 mL; pode ser comprado como FBS regular e inativado por calor, colocando em um 40 ° C banho-maria por 20 minutos
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 17,5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 17,5 mL
de calor FBS Life Technologies inativado		16000044	10 mL; pode ser comprado como FBS regular e inativado por calor, colocando em um 40 ° C banho-maria por 20 min
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Meios de diferenciação:
DMEM	Gibco	10569010	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 24 mL
de calor Soro Inativado	para Cavalos Sigma	H1138	1.5 mL
Insulina-Selênio-Transferrina	Life Technologies	41400045	0.5 mL
Outros Materiais:
PBS	Gibco	14040133
Gentamicina	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	Prepare como 10% DMSO em Myoblast Meios para congelação de células
Fórceps	Qualquer
lâmina de barbear	Qualquer
tesoura	Qualquer
papel Whatman	VWR	21427-648
Placa de 60 mm	VWR	734-2318
Placa de 10 cm	VWR	25382-428 (CS)
Frascos T25 Frascos	ThermoFisher	156367
T75	156499		ThermoFisher
(15 mL)	BioPioneer	CNT-15
Taxas de consumo de oxigênio:
Seahorse XFe96 Analyzer	Analisador Agilent	Seahorse XFe96	Instrumento usado para medir as taxas de consumo de oxigênio lidas por acidificação do meio extracelular
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Placas de 96 poços para uso no Analisador XFe96
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Os componentes Agilent	103015-100	podem ser adquiridos de outros fornecedores assim que o ensaio for estabelecido; algumas recomendações estão listadas abaixo
Substrato Seahorse XF Palmitate-BSA FAO	Agilent	102720-100	podem ser adquiridos de outros fornecedores assim que o ensaio for estabelecido; algumas recomendações estão listadas abaixo
Ácido palmítico	Sigma	P5585-10G	para medição da oxidação de ácidos graxos
Carnitina	Sigma	C0283-5G	para medição da oxidação de ácidos graxos
Etomoxir	Sigma	E1905	para medição da oxidação de ácidos graxos
BSA	Sigma	A7030	usado como controle ou em conjugação com ácido palmítico para uso na medição da oxidação de ácidos graxos