Isolamento e diferenciação de Mioblasts primários de explantes do músculo esquelético do rato

Summary

Os mioblastos estão proliferando células precursoras que se diferenciam para formar miotubos polinucleados e, eventualmente, miofibras musculares esqueléticas. Aqui, nós apresentamos um protocolo para a isolação e a cultura eficientes de mioblastos preliminares dos músculos esqueletais do rato adulto novo. O método permite estudos moleculares, genéticos e metabólicos de células musculares na cultura.

Abstract

Os mioblastos preliminares são precursores proliferating indiferenciados do músculo esqueletal. Eles podem ser cultivados e estudados como precursores musculares ou induzidos a se diferenciar em estágios posteriores do desenvolvimento muscular. O protocolo fornecido aqui descreve um método robusto para o isolamento e a cultura de uma população altamente proliferativa de células mioblastos de explantes de músculo esquelético do rato adulto jovem. Estas pilhas são úteis para o estudo das propriedades metabólicas do músculo esqueletal de modelos diferentes do rato, assim como em outras aplicações a jusante tais como o transfection com ADN exógeno ou a transdução com vetores da expressão viral. O nível de diferenciação e perfil metabólico dessas células depende do comprimento da exposição e da composição dos meios utilizados para induzir a diferenciação mioblástica. Estes métodos fornecem um sistema robusto para o estudo do metabolismo de células musculares do rato ex vivo. É importante ressaltar que, diferentemente dos modelos in vivo, os métodos aqui descritos fornecem uma população celular que pode ser expandida e estudada com altos níveis de reprodutibilidade.

Introduction

Embora muitas vezes citado como uma indicação de saúde metabólica global, vários estudos mostraram que o índice de massa corporal (IMC) em idosos não está consistentemente associado com maior risco de mortalidade. Até o momento, o único fator que se mostrou consistente com a redução da mortalidade nessa população é o aumento da massa muscular¹. O tecido muscular representa uma das maiores fontes de células sensíveis à insulina no corpo e, portanto, é crítico na manutenção da homeostase metabólica geral². A ativação do tecido do músculo esqueletal através do exercício é associada com os aumentos na sensibilidade de insulin local e na saúde metabólica total³. Enquanto os modelos in vivo são essenciais para estudar a fisiologia muscular e o impacto da função muscular no metabolismo integrado, as culturas primárias dos miotubos fornecem um sistema tratável que reduz a complexidade dos estudos em animais.

Os mioblastos derivados de músculos pós-natais podem ser usados para estudar o impacto de inúmeras condições de tratamento e crescimento de forma altamente reprodutível. Isto tem sido reconhecido por muito tempo e diversos métodos para o isolamento e a cultura do mioblastos foram descritos^4,5,6,7,8,9. Alguns destes métodos utilizam os músculos Neonatais e produzem números relativamente baixos de mioblastos^,8,necessitando de vários animais para estudos de maior escala. Além disso, os métodos mais utilizados para a cultura de mioblasts usam "Pré-chapeamento" para enriquecer para os mioblastos, que são menos aderentes do que outros tipos de células. Nós encontramos o método alternativo do enriquecimento descrito aqui para ser muito mais eficiente e reprodutível para enriquecer uma população altamente proliferative do mioblastos. Em resumo, este protocolo permite o isolamento de mioblastos altamente proliferativos de explantes musculares jovens adultos, através de conseqüência em meios de cultura. Myoblasts pode ser colhido repetidamente, sobre diversos dias, expandido ràpida, e induzido para diferenciar-se em myotubes. Este protocolo gera de forma revisível um grande número de células de mioblastos saudáveis que se diferenciam de forma robusta em miotubos espontâneamente espasmos. Nos permitiu estudar o metabolismo e os ritmos circadianos em miotubos primários de camundongos de uma variedade de genótipos. Finalmente, incluímos métodos para a preparação de miotubos para o estudo do metabolismo oxidativo, utilizando medições de taxas de consumo de oxigênio em placas de 96 poços.

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da Scripps Research.

1. coleta e processamento de explantes do tecido muscular

1. O dia anterior à dissecção, esterilizar todos os equipamentos de dissecção (fórceps, lâminas de barbear e tesoura) e preparar todos os meios necessários: fosfato tampão salina (PBS), MB chapeamento de mídia (12,5 mL de DMEM, 12,5 mL de PRESUNTOS F12, 20 mL de calor-inativado fetal bovino soro (FBS), 5 mL de suplemento médio líquido amniótico) e solução de revestimento (24 mL de DMEM, 24 mL de PRESUNTOS F12, 1,7 mL de colágeno, 1 mL de matrigel).
2. O dia da dissecção, cubra um prato de 6 cm com solução de revestimento para cada músculo a ser dissecado. Adicionar 2 mL de solução de revestimento para a superfície de cada placa, agitar suavemente para criar um casaco mesmo na superfície, e incubar as placas com solução a 4 ° c para 1 h.
3. Remova a solução de revestimento das placas e retorne à solução de estoque.
   Nota: A solução de revestimento pode ser reutilizada por até seis meses e deve ser armazenada a 4 ° c.
4. Lave as placas duas vezes com 2 mL de PBS para remover o colágeno não acoplado e o matrigel.
5. Coloc as placas em uma incubadora da cultura do tecido de 37 ° c durante dissecções.
6. Prepare uma câmara húmida colocando 2-3 folhas de papel absorvente espesso num saco plástico ou num prato estéril de 15 cm e utilize uma pipeta para molhar a superfície do papel com água estéril.
7. Coloque a câmara luz UV durante 5 min para esterilizar.
8. Dissecar os músculos desejados de um rato velho de 4 a 8 semanas. Para esterilizar o tecido muscular, enxaguar suavemente em PBS contendo 40 μg/mL de gentamicina.
   Nota: Para os músculos do quadríceps e do gastrocnêmio, a placa um músculo por a placa. Para soleus, Plantaris e EDL, misture os músculos de ambas as pernas em uma placa.
9. Use fórceps estéril para transferir o músculo a um prato de Petri não-revestido estéril de 10 cm. Adicionar 0.5-1.0 mL de chapeamento de mídia sobre o músculo de tal forma que o tecido é úmido, mas não flutuante (Figura 1a).
10. Use um bisturi estéril ou lâmina de barbear para cortar suavemente o músculo em pequenos fragmentos (aproximadamente 1-3 mm³).
    Nota: É importante minimizar o manuseio do tecido muscular para obter melhores resultados.
11. Use fórceps ou uma pipeta para transferir os fragmentos musculares para a superfície de uma placa de 6 cm pré-revestida. Muito suavemente sobrepor um adicional 0,8 mL de chapeamento de mídia sobre o tecido. Deve haver meios suficientes para manter as partes do tecido hidratadas, mas não flutuantes (Figura 1B).
12. Coloque os pratos de 6 cm contendo os fragmentos musculares dentro da câmara úmida e retorne a uma incubadora (37 ° c, 5% CO₂) por 48 h (Figura 1C).
    Nota: É vital que os fragmentos musculares aderem à superfície da placa para permitir o crescimento de mioblastos. Não mova as placas/câmara durante pelo menos 48 h.
13. Após 48 h, verific com cuidado as placas para assegurar-se de que os fragmentos do músculo aderiram. Sobreposição com 2 mL de chapeamento de mídia, tendo o cuidado de não desalojar os fragmentos.
    Nota: Se houver contaminação ou detritos visíveis nas placas, Lave cuidadosamente as partes musculares. Placa 2 mL de solução de PBS/gentamicina na borda da placa e ponta suavemente para lavar sobre o tecido muscular. Retire o PBS e repita a etapa de lavagem. Após a segunda lavagem, sobrepor 2 mL de chapeamento de mídia.
14. Mantenha as placas na incubadora de 37 ° c por até 3 dias adicionais (5 dias da dissecção original) antes de colher Myoblasts. Verific todos os dias para o conseqüência dos Myoblasts.
    Nota: O aparecimento de células emergentes de explantes musculares será variável e heterogênea. Os mioblastos preliminares aparecem como pilhas pequenas, redondas, e brilhantes. No entanto, não é necessário nem confiável identificá-los por sua aparência nesta etapa (Figura 2).

2. colhendo Myoblasts de outgrowing

1. Preparar e meios de mioblastos pré-quentes (17,5 mL de DMEM, 17,5 mL de PRESUNTOS F12, 10 mL de FBS, 5 mL de suplemento médio de fluido amniótico), tripsina e PBS/gentamicina. Cubra um frasco de T25 por grupo muscular a ser colhido com solução de revestimento e conforme descrito na etapa 1,2 (ver tabela 1).
2. Remova os meios de chapeamento e enxague suavemente os explantes musculares com 2 mL de PBS/gentamicina. Remova rapidamente PBS (enxágüe uma placa de cada vez e não deixe a placa sentar-se em PBS nesta etapa).
3. Adicione suavemente 1 mL de PBS/gentamicina e coloque a placa na incubadora de 37 ° c durante 1 min.
4. Use uma pipeta P1000 para coletar PBS/células em um tubo de centrífuga de 15 mL.
5. Adicionar 1 mL de tripsina à placa e regressar à incubadora de 37 ° c durante 3 min. Bata suavemente nas placas para desalojar os Myoblasts. Colete a tripsina/células e combine com a coleção PBS. Adicione 8 mL de Myoblast Media ao tubo de centrifugação e inverta suavemente para misturar.
6. Sobreponha suavemente 2 mL de solução de chapeamento nas placas musculares e retorne à incubadora de 37 ° c.
7. Gire os tubos de centrifugação contendo células em uma centrífuga por 3 min a 200 x g.
8. Aspirar o sobrenadante a ~ 1 mL, sendo cuidadoso para evitar a pelota da pilha. Adicione suavemente o Myoblast Media (ver tabela 1) e transfira as células para o balão pré-revestido e coloque na incubadora de 37 ° c. Esta é a colheita P0. Se observado um microscópio, pode haver muito poucas células (Figura 3).
9. Repita a colheita descrita acima cada outro dia até três vezes. Após a terceira safra, descarte os explantes.

3. expansão e enriquecimento de Mioblasts Proliferating

Nota: A colheita P0 será heterogênea (~ 60% mioblasts). As próximas 2 passagens usam PBS para colher seletivamente os mioblastos. Muitas das pilhas mais aderentes serão deixadas para trás e os mioblastos ràpida proliferating serão ≥ 95% puros dentro de 2 passagens. Uma vez que os mioblastos são estabelecidos, devem ser mantidos em uma baixa densidade para evitar a diferenciação espontânea.

1. Para cada frasco de T25 de ~ 40-50% de células confluentes da secção 2, bata um balão T75 com 5 mL de solução de revestimento e coloque a 4 ° c por 1-4 h.
2. Remova a solução de revestimento dos frascos e retorne à solução do estoque. Lave as garrafas duas vezes com 2 mL de PBS/gentamicina e coloque na incubadora de 37 ° c.
3. Aspirar a mídia de P0 mioblastos T25 frascos. Enxague brevemente as células com 2 mL de PBS/gentamicina quente. Aspirar PBS do balão.
   Nota: O objetivo desta etapa (3,3) é reduzir a possibilidade de contaminação bacteriana. Se realizada de forma rápida e suave, não deve resultar em perda de mioblastos. Pode ser omitido para maximizar a preservação do mioblastos se desejado.
4. Pipete 2 mL de PBS quente (não tripsina) em cada frasco contendo mioblasts. Coloque os frascos com PBS na incubadora de 37 ° c durante 3 min.
   Nota: Os Myoblasts devem facilmente separar-se dos frascos com PBS. Usar PBS em vez de tripsina nesta etapa é fundamental para reduzir a contaminação da população de mioblastos com outros tipos de células.
5. Retire as células da incubadora de 37 ° c e aperte firmemente o lado dos frascos para desalojar as células. Verific um microscópio claro para Myoblasts livremente de flutuação.
6. Coloc os frascos eretos em uma capa da cultura do tecido e enxague a parte inferior dos frascos com 10 mL de meios de Myoblast 2-3 vezes para assegurar-se de que todas as pilhas estejam desalojadas.
7. Colete a mistura de célula/mídia em um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugador por 3 min a 200 x g.
8. Aspirar a mídia para cerca de 1 mL, sendo cuidadoso para evitar o pellet celular. Adicione suavemente um volume apropriado de Myoblast Media ao tubo de centrifugação e misture suavemente.
9. Distribua a mistura da pilha aos frascos T75 novos. Adicione 10 mL de Myoblast Media a cada novo balão T75. Agitar suavemente as garrafas horizontalmente para distribuir as células e colocar na incubadora de 37 ° c durante a noite.
10. Dois dias mais tarde, passagem mais uma vez com PBS, dividindo cada balão T75 em três frascos T75.
    Nota: Não permita que os mioblastos tornem-se mais de 50%-60% confluente, porque este os faria começar diferenciar e perder a capacidade prolifaterive.
11. Para passagens adicionais, use tripsina. O passaging duas vezes com PBS rende > 95% Myoblasts; tentativas de melhorar ainda mais a pureza tende a resultar em uma diferenciação mais pobre.

4. diferenciação de Mioblasts primários para Miotubos

1. Mioblasts de placa P2 (ou posterior) em Mioblast Media em placas revestidas (ver tabela 1 para volumes e números de células sugeridos para revestimento e chapeamento). Dois ou três dias mais tarde, quando as células estão em 70-80% confluência, mudar os meios de comunicação para a diferenciação de mídia (24 ml de DMEM, 24 ml de presuntos F12, 1,5 ml de calor inativado cavalo soro, 0,5 ml de insulina-selênio-transferrina).
2. Mude meios da diferenciação cada outro dia durante a diferenciação de mioblastos preliminares em myotubes. A diferenciação é tipicamente completa pelo dia 4-5 e será marcada por células alongadas e fundidas que se contorna espontaneamente. Realize experimentos em miotubos diferenciados dentro de 6 dias. Tipicamente as células são ensaiadas cinco ou seis dias após o início da diferenciação.

5. medindo a taxa do consumo do oxigênio em Myoblasts ou em Myotubes em placas 96-well

1. Revestimento 96-placas de poço com 25 μL de solução de revestimento por poço. Centrifugue as placas a 58 x g durante 1 min para remover quaisquer bolhas.
2. Incubar as chapas em solução de revestimento para 1-4 h a 4 ° c. Utilize a pipeta multicanal para remover a solução de revestimento e lave três vezes em 25 μL de PBS/gentamicina a frio. Centrifugue pelo menos um destes lava para assegurar-se de que nenhumas bolhas estejam prendidas.
3. Adicionar 40 μL de meios de diferenciação a cada poço. Centrifugue a mídia na placa revestida sem células por 1 min a 58 x g para evitar bolhas e remover a tensão superficial para obter uma camada uniforme de mídia.
4. Adicione células suspensas em um adicional de 40 μL de mídia para cada poço. Gire novamente em 58 x g.
   Nota: A consistência no chapeamento é importante para melhores resultados e o número de pilhas chapeadas por bem deve ser aperfeiçoado para cada instalação experimental, e será provavelmente na escala de ~ 10000-25000 mioblastos chapeados em meios da diferenciação por o poço de uma placa 96-well.
5. Mude suavemente a mídia diariamente durante a diferenciação. Não aspirar a mídia, mas sim removê-lo com uma pipeta, deixando um pequeno volume para trás para evitar desalojar as células ou expô-los ao ar. Por exemplo, substitua 50 μL de cada vez por três repetições em vez de todos os 80 μL ao mesmo tempo.
6. Use 8-15 poços por condição. Pode ser necessário omitir alguns poços se as células não formam uma camada uniforme de miotubos.
   Nota: Omitir poços nas bordas da placa porque eles são altamente suscetíveis à evaporação. Varie a configuração da placa para repetições experimentais para evitar erros sistemáticos.
7. Realize o ensaio desejado em miotubos diferenciados dentro de 1-2 dias de diferenciação total (dia 4-6 do início da diferenciação). Os instrumentos e reagentes recomendados para a medição das taxas de consumo de oxigénio estão listados na tabela de materiais.

Results

Após a seção 1 do protocolo fornecido deve-se produzir células primárias emergindo dos explantes que serão visíveis um microscópio de luz padrão (Figura 2). Uma população heterogênea da pilha será vista crescer fora e em torno de cada explant do tecido do músculo. Os Myoblasts aparecerão como esferas pequenas, redondas, brilhantes. A seção 2 do protocolo produzirá colheitas precoces de mioblasts de explantes teciduais, que conterá poucas células e será hetero...

Discussion

O músculo esquelético é vital para o estabelecimento e manutenção da homeostase metabólica¹¹. O estudo da fisiologia muscular é complicado pela variabilidade interindividual, bem como dificuldade na obtenção de amostras, particularmente no caso de estudos humanos. Os miotubos preliminares cultivados foram mostrados para recapitular muitas características da fisiologia do músculo, incluindo a homeostase¹²do cálcio, regeneração do tecido danificado⁵do ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
< solução > revestimento: < / forte >
DMEM	Gibco	10569010	Sempre adicione gentamicina (1: 1.000 por volume) antes de usar; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Sempre adicione gentamicina (1: 1.000 por volume) antes de usar; 24 mL
de Collagen	Life Technologies	A1064401	1,7 mL
de Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
Meio de reforço:
DMEM	Gibco	10569010	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 12,5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 12,5 mL
de FBS	Life Technologies	inativadas por calor 16000044	20 mL; pode ser comprado como FBS regular e inativado por calor, colocando em um 40 ° C banho-maria por 20 minutos
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 17,5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 17,5 mL
de calor FBS Life Technologies inativado		16000044	10 mL; pode ser comprado como FBS regular e inativado por calor, colocando em um 40 ° C banho-maria por 20 min
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Meios de diferenciação:
DMEM	Gibco	10569010	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Sempre adicione gentamicina (1:1.000 por volume) antes de usar; 24 mL
de calor Soro Inativado	para Cavalos Sigma	H1138	1.5 mL
Insulina-Selênio-Transferrina	Life Technologies	41400045	0.5 mL
Outros Materiais:
PBS	Gibco	14040133
Gentamicina	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	Prepare como 10% DMSO em Myoblast Meios para congelação de células
Fórceps	Qualquer
lâmina de barbear	Qualquer
tesoura	Qualquer
papel Whatman	VWR	21427-648
Placa de 60 mm	VWR	734-2318
Placa de 10 cm	VWR	25382-428 (CS)
Frascos T25 Frascos	ThermoFisher	156367
T75	156499		ThermoFisher
(15 mL)	BioPioneer	CNT-15
Taxas de consumo de oxigênio:
Seahorse XFe96 Analyzer	Analisador Agilent	Seahorse XFe96	Instrumento usado para medir as taxas de consumo de oxigênio lidas por acidificação do meio extracelular
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	Placas de 96 poços para uso no Analisador XFe96
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Os componentes Agilent	103015-100	podem ser adquiridos de outros fornecedores assim que o ensaio for estabelecido; algumas recomendações estão listadas abaixo
Substrato Seahorse XF Palmitate-BSA FAO	Agilent	102720-100	podem ser adquiridos de outros fornecedores assim que o ensaio for estabelecido; algumas recomendações estão listadas abaixo
Ácido palmítico	Sigma	P5585-10G	para medição da oxidação de ácidos graxos
Carnitina	Sigma	C0283-5G	para medição da oxidação de ácidos graxos
Etomoxir	Sigma	E1905	para medição da oxidação de ácidos graxos
BSA	Sigma	A7030	usado como controle ou em conjugação com ácido palmítico para uso na medição da oxidação de ácidos graxos