Imagem da Sinapse Imunológica Humana

Summary

Este protocolo images a formação imunológica da sinapse e o tráfego polarizado subseqüente do secretry para a sinapse imunológica. Conjugados celulares foram formados entre uma célula Raji com pulso de superantígeno (agindo como uma célula de apresentação de antígeno) e um clone de Jurkat (agindo como um linfocito auxiliar de efetoreto T).

Abstract

O objetivo do método é gerar uma sinapse imunológica (EI), um exemplo de conjugação célula-célula formada por uma célula de apresentação de antígeno (APC) e uma célula de linfocito efetivo T linfocito (Th), e registrar as imagens correspondentes aos primeiros estágios da célula de apresentação de antígenos (APC) e uma célula de linfocito t efetivo (Th), e registrar as imagens correspondentes aos primeiros estágios da célula de apresentação de antígenos (APC) e uma célula de linfocito efetivo T linfocito (Th), e registrar as imagens correspondentes aos primeiros estágios da célula de apresentação de antígenos (APC) e uma célula de linfocito t efetivo (Th), e registrar as imagens correspondentes aos primeiros estágios da célula de apresentação de antígenos (APC) e uma célula de l A formação do EI e os eventos subsequentes de tráfico (ocorrendo tanto na APC quanto na célula Th). Estes eventos eventualmente levarão à secreção polarizada no EI. Neste protocolo, as células Jurkat desafiadas com as células Raji de Staphylococcus Enterotoxin E (SEE) pulsadas como modelo de sinapse celular foram usadas, devido à proximidade deste sistema experimental com a realidade biológica (conjugações sinápticas da célula-APC th). A abordagem aqui apresentada envolve conjugação célula-célula, aquisição de lapso de tempo, microscopia de fluorescência de campo largo (WFFM), seguida pelo processamento de imagem (desconvolução pós-aquisição). Isso melhora a relação sinal/ruído (SNR) das imagens, melhora a resolução temporal, permite a aquisição sincronizada de vários fluorocromos em conjugados sinápticos emergentes e diminui o branqueamento de fluorescência. Além disso, o protocolo é bem combinado com os protocolos de fixação de células de ponto final (paraformaldeído, acetona ou metanol), o que permitiria mais manchas e análises de imunofluorescência. Este protocolo também é compatível com microscopia confocal de varredura a laser (LSCM) e outras técnicas de microscopia de última geração. Como uma ressalva principal, apenas os limites da célula T-APC (chamados de interfaces IS) que estavam no ângulo certo de 90° para o plano de foco ao longo do eixo Z poderiam ser devidamente imageados e analisados. Existem outros modelos experimentais que simplificam a imagem na dimensão Z e as seguintes análises de imagem, mas essas abordagens não emular a superfície complexa e irregular de um APC, e podem promover interações não fisiológicas no EI. Assim, a abordagem experimental aqui utilizada é adequada para reproduzir e enfrentar algumas complexidades biológicas que ocorrem no EI.

Introduction

O principal objetivo do método é gerar conjugados de célula-célula imunológica (Is) formados por uma célula de apresentação de antígeno (APC) pulsada com superantígenos SEE e uma célula Th efetora, e registrar as imagens correspondentes aos primeiros estágios de formação imunológica de sinapse e os eventos subsequentes de tráfico (que ocorrem tanto no APC quanto na célula Th), que eventualmente levarão à secretão polarizada no Is. O estabelecimento do IS by T linfócitos após a ligação de seu receptor celular (TCR) para antígenos vinculados ao MHC-II no APC organiza um exemplo extremamente dinâmico, maleável e crítico envolvido em respostas imunes antigenênitas, humoras e celulares^1,2. O EI é definido pela formação de um padrão especial de ativação supramolecular (SMAC) caracterizado por um processo de reorganização de atoina^3. Após a construção do EI por linfócitos T com a APC, a polarização das vesículas de secretismo em relação ao EI parece estar implicada na secreção polarizada na lacuna sináptica. Esta maquinaria focalizada parece fornecer inequivocamente o sistema imunitário com um estratagema superbly regulado para realçar a eficácia de papéis críticos do efetor do secretry de linfócitos de T, ao reduzir a estimulação inespecífica, citocina-arbitrada de pilhas do espectador, matança de pilhas de alvo irrelevantes e suicídio apoptotic através da morte ativa-induzida da pilha (AICD)⁴.

A conseqüência do EI varia de acordo com a natureza do linfócito T e do APC. O contato sináptico das células Th (tipicamente células CD4+) com o APC exibindo antígeno associado ao MHC-II produz a ativação da célula T (secreção de citocina, proliferação, etc.) e, em alguns casos, apoptose via AICD⁴. Para linfócitos citotóxicos t (CTLs) (principalmente células CD8+) interagindo com APC apresentando antígeno associado ao MHC-I, o resultado difere na pré-estimulação ou não das CTLs com antígeno. Assim, ctls ingênuos identificação de antígeno-MHC-I complexos no APC são "preparados" para destruir as células-alvo e dividir. Ctls preparados também estabelecer sinapses com células-alvo (ou seja, células infectadas por vírus ou células tumorais) produzindo extermínio celular específico de antígeno^5,6.

A secreção polarizada de exossomos na sinapse imunológica é uma área de pesquisa em desenvolvimento e desafiadora envolvida em respostas imunes relevantes⁷. Tem sido demonstrado que os corpos multivesiculares (MVB) carregando vesículas intraluminais (ILVs) experimentam transporte polarizado em direção ao IS^8,9 ( Vídeo1) após estimulação tcr com antígeno. A fusão destes MVB na membrana sináptica induz sua degranulação e a liberação dos ILVs como exossomos à fenda sináptica^8,10. Isso ocorre em IS formado por células Jurkat do tipo Th que foram desafiadas com células Raji revestidas de superantígeno SEE atuando como APC^11,CD4⁺ linfoblastos estimuladas por TCR e CTLs preparados. Assim, as sinapses feitas pelas células Jurkat constituem um modelo valioso para estudar o tráfego secreto de exossomos polarizado. Além disso, várias décadas de investigação mostraram que muitos insights fundamentais sobre a sinalização TCR vieram de estudos com linhas de células T transformadas, e de fato o mais conhecido desses sistemas de modelo é a linha de células T leukemica Jurkat¹².

A formação de um EI totalmente desenvolvido produz vários resultados biológicos cruciais, incluindo a ativação de células Th, ativação de CTLs ingênuos ou matança de células-alvo por CTLs preparados, além de anergia ou AICD⁵. Portanto, existem dois tipos principais de secretismo é estabelecido por linfócitos T que resultam em muito diversificada, mas igualmente crítico, funções efetivo imune^1,6,13. Por um lado, o EI dos linfócitos t citotóxicos preparados (CTLs) induz uma polarização rápida (variando de segundos a poucos minutos) de grânulos líticos (chamados de "lisosomos secretos") em direção ao EI. A degranulação dos grânulos líticos induz a secreção de perforina e granzymes à fenda sináptica^14,que são moléculas pró-apoptotas. O perforin o secreto e os granzymes induzem subseqüentemente a matança das pilhas de alvo^15,16. Ctls desenvolver sinapses temporárias, com duração de apenas alguns minutos, como as células-alvo são assassinados^3,17. Isto é provavelmente devido à circunstância de que a tarefa CTL ideal requer um contato rápido e temporário, a fim de distribuir tantos ataques letais quanto possível para numerosas células-alvo^3,17. Em contraste, os linfócitos Th, como as células Jurkat, geram estável, is de longa data (de 10-30 min até horas), uma vez que isso parece ser necessário para a secreção direcional e incessante de estimulantecitocinas^3,17. As citocinas também estão fechadas em vesículas secretas e algumas delas (ou seja, IL-2, IFN-γ) experimentam transporte polarizado para o IS¹⁷ e secreção. Uma característica essencial do EI é a formação de contatos exploratórios, fracos e transitórios entre a célula T e a APC(Vídeo 1)que podem produzir uma interação mais forte e o estabelecimento de um EI maduro, desde que o TCR identime os complexos de antígeno-MHC cognatos e que conexões co-estimulantes apropriadas sejam estabelecidas^5. Tanto o início dos contatos iniciais quanto a fundação de um EI maduro e totalmente produtivo são processos inerentemente estocásticos, rápidos e assíncronos^5,18. Além disso, há uma frequência escassa na criação de conjugados de célula para célula¹⁹, o que pode constituir um desafio para técnicas de imagem (por favor, consulte as seções de resultados e discussão).

Outro desafio principal no exame da polarização do centro organizador de microtúbulos (MTOC) e granules secretory em linfócitos T é que todo o processo é rápido (segundos a poucos minutos), particularmente em CTLs. Considerando esses fatos, a maioria das abordagens iniciais confrontou uma estratégia de ponto final em que as células Alvo APC/e os linfócitos T são misturados em conjunto e convergiram por centrífugas de baixa velocidade, para favorecer a criação de conjugação de células para células, incubadas por vários minutos, fixas e posteriormente avaliadas para o deslocalização de vesículas MTOC e/ou secretários para o IS^20. Esta abordagem tem duas limitações significativas: não foram alcançados dados de tráfico vivo e foram obtidos altos níveis de polarização de grânulos mtoc/secretory de fundo, provavelmente devido ao caráter estocástico do estabelecimento¹⁸do EI. Além disso, qualquer correlação entre eventos de sinalização inicial estimulados por TCR (ou seja, aumentos de cálcio intracelular, reorganização da actina) e polarização de vesicle secretory é problemática para investigar. Assim, disposições imperativas para a imagem adequada do EI em células vivas combinam-se para melhorar a materialização conjugada célula-célula, para sincronizar a geração do EI e, quando possível, garantir o estabelecimento de conjugações celulares em campos de microscópio definido XY e posições Z. Várias estratégias foram desenvolvidas para evitar todos esses problemas. Está fora do escopo deste artigo explicar esses métodos, seus benefícios e fraquezas. Consulte as revisões publicadas anteriormente abordando esses pontos importantes^1,4,5,21.

O fato de que é feito por linfócitos Th são de longa duração, ea circunstância de que em Th linfócitos o MTOC, linfokine contendo grânulos secretos e MVB levar de vários minutos até horas para mover e atracar para o IS²² faz com que o Th-APC é um candidato ideal para a imagem usando o protocolo descrito aqui.

Protocol

1. Preparação de slides para aderir células Raji

1. Adicione 150 μL de fibronectina (100 μg/mL) por poço a um slide de câmara de 8 micropoços (lâmina de câmara de fundo plástico) e incuba-lo por 30 min a 1 h a 37 °C. Este substrato de adesão permitirá a ligação das células Raji para o fundo do poço (Passo 2), a formação de conjugados vivos com células Jurkat (Passo 4) células, e captura de microscopia time-lapse (passo 6), e também é compatível depois com fixação opcional paraformaldeído (PFA) (passo 7).
   Nota: Para fixação de acetona, use lâminas de câmara de fundo de vidro e poli-L-lisina (20 μg/mL) em vez de fibronectina, uma vez que a acetona dissolve o plástico. O slide de câmara de 8 micropoços (1 cm² bem, 300 μL volume máximo) ou equivalente é um formato flexível e adequado.
2. Fibronectina aspirada usando uma pipeta automática de 200 μL e lave cada poço com 200 μL de PBS por 2 min com agitação suave. Repita esta lavagem mais uma vez. O slide da câmara pode ser armazenado nesta fase com pbs por 1-2 semanas em 4 °C.

2. Adesão de células Raji para os slides de câmara e 7-amino-4-clorometilcoumarina (CMAC) Rotulagem

1. Transfira 10 mL de um confluent (1-2 x 10⁶ pilhas/mL) pre-culture de pilhas de Raji a um tubo de 15 mL, V-bottom. Misture bem e use 10 μL para contar as células na câmara ou equivalente neubauer.
2. Centrífuga as células restantes em 300 x g para 5 min à temperatura ambiente. Aspirar e descartar o supernatant.
3. Resuspende suavemente a pelota celular em meio de cultura completa quente (RPMI 1640 complementada com 10% FCS, 2 mM glutamina, 10 mM HEPES, 100 u/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina) em uma concentração de 10⁶ células/mL. Use a equação dada abaixo:
   ([]_{inicial x} V_inicial = [ ]_final x V_final), onde []_inicial representa a concentração celular inicial, V_inicial = volume inicial da suspensão celular, [ ]_final = concentração de célulafinal, V_final = volume final da suspensão celular.
   Nota: Dependendo da concentração celular da cultura inicial, é possível coletar mais células do que o necessário, mas é importante manter as células restantes na cultura (37 °C) até o final do experimento, a fim de evitar potenciais problemas (ver Passo 2.6).
4. Rotular as células Raji para permitir a sua identificação durante a formação conjugate sináptica. Neste experimento, a rotulagem de 7 amino-4-chloromethylcoumarin (CMAC) é realizada na etapa 2.4.2.
   1. Transfira o número necessário de células Raji no meio da cultura para um tubo de 2 mL. Para o slide de câmara de 8 micropoços, é necessário um total de 1,6 mL da suspensão celular (200 μL por poço).
   2. Adicione cmac a uma concentração final de 10 μM. Mantenha as células no escuro, cobrindo o tubo com folha de alumínio, uma vez que o CMAC é sensível à luz. 200 μL contendo 2 x 10⁵ células Raji são necessários por 1 cm² bem. Assim, se 8 poços precisam ser preparados, 1.6 x 10⁶ pilhas de Raji são exigidas.
      Nota: Rotular as células Raji com o rastreador celular azul (CMAC, excitação UV e emissão azul) as distingue das células Th quando os conjugados sinápticos são formados. Este corantes é compatível com pfa e acetona fixativas e permite mais imunofluorescência procedimentos. Tente evitar a exposição leve. A rotulagem das células Raji em uma piscina com CMAC seguido de resuspensão antes da adesão das células Raji para os slides de câmara revestidos de fibronectina garante a rotulagem homogênea de células Raji com CMAC entre diferentes poços.
5. Resuspender as células manchadas de CMAC e, após a aspiração da PBS na lâmina de câmara do passo 1.2., transfira 200 μL da suspensão celular para cada poço dos slides de câmara revestidos de fibronecina preparados na etapa 1.1-1.2. Incubar o deslizamento de câmara em 37 °C, 5% CO₂ para 30 min-1 h.
   Nota: A adesão e a rotulagem cmac ocorrerão simultaneamente nesta etapa e isso economiza tempo. Por favor, esteja ciente de que as células Raji sedimentar rapidamente e cuidado precisa ser tomado para manter uma concentração homogênea na suspensão celular antes de semeadura. Não é necessário lavar cmac nesta fase por centrífuga, uma vez que a lavagem CMAC será mais facilmente feito no passo 2.7 (quando as células Raji rotulados já são respeitados para os slides de câmara). Como o CMAC está presente na suspensão celular em grande excesso, o fundo de fluorescência azul é muito alto para distinguir as células manchadas de azul. Verifique a fluorescência de CMAC celular no passo 2.7 após a lavagem do CMAC.
6. Certifique-se de que as células Raji são aderidos ao fundo dos poços por agitação suave das lâminas de câmara no microscópio. Certifique-se de que as células apresentam lacunas entre si e não são confluentes (Figura 1, painel do meio). 50-60% da confluência celular é apropriado.
   1. Se a maioria das células aderir eficientemente à lâmina da câmara e não forobservadas lacunas celulares, lave cada um bem com meio completo quente e resuspenda o meio com um tubo automático de 200 μL para separar o excesso de células. Verifique a confluência após cada etapa de resuspensão.
   2. Se as células não aderirem, repita o passo de adesão novamente e aumente o tempo de adesão e/ou o número de celular.
      Nota: É possível parar aqui, incubar o deslizamento de câmara a 37 °C, 5% CO₂ durante a noite (O/N), e continuar com o protocolo no dia seguinte. Por favor, confirme no dia seguinte que as células Raji permanecem aderidas e cmac-rotulado suster a microscopia fluorescência.
7. Lave cada poço novamente cuidadosamente com RPMI quente complementado para eliminar o excesso de CMAC e verificar se há emissão azul com o microscópio de fluorescência (Figura 1).
   Nota: Para evitar o uso de óleo de imersão (pegajoso e viscoso) e objetivos de óleo de abertura numérica alta, extra-longa distância (ou seja, 20x ou 40x) objetivos podem ser usados para verificar rapidamente a rotulagem CMAC usando o microscópio de fluorescência.

3. Pulso de CMAC - células Raji rotuladas com Enterotoxina Estafilocócica E

1. Adicione Enterotoxina Estafilocócica E (VEJA, 1 μg/mL) a cada poço. See pode ser convenientemente diluído no meio de cultura celular (solução de trabalho em 100 μg/mL) dos estoques congelados SEE (1 mg/mL em PBS). Use 2 μL da solução de trabalho 100x por microwell de 200 μL.
   CUIDADO: Use luvas para esta etapa e dispor da ponta usada na caixa de risco biológico.
2. Incubar o deslizamento de câmara em 37 °C, 5% CO₂ por pelo menos 30 min. O efeito SEE dura pelo menos 3-4 h.
   Nota: See pode ser adicionado aos poços em diferentes pontos de tempo, quando necessário, se configurações distintas de lapso de tempo forem planejadas (passo 5) e/ou dependendo do ponto de início para os experimentos de ponto final (passo 6).

4. Preparação das células Jurkat

1. Use uma cultura previamente crescente de pilhas de Jurkat (1-2 x 10⁶ pilhas/mL) para esta experiência. Use células de um frasco de cultura padrão ou de uma transfecção anterior seguindo protocolos de eletroporação padrão, como descrito anteriormente²³. A transfecção das células Jurkat permitirá a visualização de lapso de tempo do tráfego de grânulos de secretismo em células vivas. Por exemplo, quando gfp-cd63 (um marcador de MVB) é expressa o movimento de GFP-CD63-decoradoves vesículas podem ser gravadas(Vídeo 1).
2. Observe as células um microscópio de contraste de fase. Se um excesso de células mortas (>20-30%) são observados, executar polrifugação gradiente densidade Ficoll usando protocolos padrão²⁴, para eliminar o excesso de células mortas (células mortas apresentam maior densidade do que as células vivas) antes de usar (ver Discussão).
3. Transfira as células para um tubo de 15 mL, tubo de fundo V, e use 10 μL para contar usando hemocytometer.
4. Centrífuga as células restantes, como descrito no passo 2.2. Descarte o supernatant e resuspenda as pilhas na mesma concentraçãoque pilhas de Raji (1 x 10 6/mL) usando o meio fresco, morno da cultura. Siga os passos 2.2-2.3.
5. Manter as células Jurkat na cultura (37 °C, 5% CO₂₎enquanto aguarda o Passo 4.
   Nota: Na segunda opção (transfecção), o número de células vivas será muito menor do que na primeira. Assim, considere usar um maior volume de cultura celular inicial, a fim de ter células suficientes para o experimento. A partir de 10 x 10⁶ células Jurkat por cuvette eletroporação e transfecção, apenas 2-4 x 10⁶ células Jurkat sobreviverão após 48 h de transfecção e algumas dessas células serão perdidas durante o passo ficoll. Assim, um cuvette de eletroporação é geralmente suficiente para desafiar as células Raji aderidas a partir de 8 micro poços (1,6 x 10⁶ células Jurkat transinfectadas necessárias).

5. Co-semeadura de células Raji e Jurkat

1. Pegue os slides de câmara contendo as células Raji com rótulo SC, pulsadas no SEE, aderidas da incubadora do passo 3.2. Não é necessário lavar o CMAC nesta fase, uma vez que isso foi feito anteriormente no Passo 2.7.
2. Assabilmente o meio cultural de cada poço, um por um, de um canto do poço usando uma pipeta automática de 200 μL. Não deixe o meio no poço secar completamente.
3. Substitua imediatamente o meio por 200 μL de células Jurkat resuspendidas no meio da cultura celular (1 x 10 6/mL) preparadas na etapa 4.5. Se a imagem de lapso de tempo for realizada, vá para o passo 6 imediatamente após esta etapa, uma vez que as células Jurkat tendem a sedimentar e formar conjugados sinápticos muito rapidamente. Por conveniência, os micropoços contendo células Raji aderidas e aderidas no SEE que não recebem semeadura com células Jurkat nesta fase devem ser mantidas com meio de cultura celular até o desafio subsequente com as células Jurkat. Isso permitirá flexivelmente o desafio subsequente com as células Jurkat para lapso de tempo adicional ou abordagens experimentais cinéticas e invertéticas.
4. Se um lapso de tempo vai ser realizado, proceder rapidamente para a etapa 6. Isso envolve a co-cultura para 1-2 h na incubadora de estágio de microscópio ou equivalente a 37 °C, 5% CO₂ para permitir a formação conjugate sináptica e aquisição simultânea de imagem. Se a análise do ponto final, mas nenhum lapso de tempo, é prevista a formação conjugate da verificação após o período da co-cultura usando o microscópio (como na figura 1)antes de reparar as pilhas (etapa 7).

6. Imagens de lapso de tempo de conjugados sinápticos emergentes

1. Prepare o microscópio e a câmara de incubação antes da imagem latente. Para o exemplo mostrado no Vídeo 1, as configurações detalhadas de microscopia são mostradas na Figura 2.
   Nota: Se um experimento de lapso de tempo for planejado, todas as configurações e complementos de microscópio (câmara de cultura de células ambiente, etc.) devem ser preparados antes de adicionar a suspensão Jurkat ao slide da câmara com células Raji aderidas. As seguintes etapas são descritas para um microscópio comercial(Tabela de Materiais). No entanto, qualquer microscópio de fluorescência invertida equipado com uma incubadora de cultura celular pode ser usado.
   1. Use um microscópio com uma imersão de óleo de 60x, abertura numérica alta quando a imagem polarizou o tráfego.
   2. Certifique-se de que o sistema de foco automático é ligado e ajustar o deslocamento para focar as células Raji ligadas à superfície inferior. Por favor, consulte a Figura 1, Vídeo 1 e Vídeo 2.
2. Após a adição jurkat para cada poço contendo as células Raji aderido na etapa 5.3, localizar rapidamente o deslizamento de câmara de micropoço na incubadora de estágio de microscópio pré-aquecido (1-2 h) (ou seja, OKOlab) e selecionar algumas posições XY com o microscópio, campos em que é provável gravar uma formação emergente do EI feita por, por exemplo, uma célula infectada por Jurkat caindo no foco do microscópio.
3. Use uma incubadora pré-aquecida do estágio do microscópio desde que se observou que um estágio temperatura-estabilizado mantem posições estáveis de X,Y,Z. Os critérios para um campo XY conveniente são: células Raji bem focadas e não confluentes (ou seja, exibindo lacunas entre as células) e a presença de células Jurkat transinfectadas (isso pode ser verificado acombinando a transmissão e os canais UV ou GFP). As células Jurkat sedimentarão muito rapidamente (poucos minutos) na lâmina da câmara, e as chances de imagem de sinapses emergentes diminuirão com o tempo(Figura 1). É possível terminar o experimento após o lapso de tempo definido ou proceder para a Etapa 7 e corrigir os conjugados para imunofluorescência e análises subsequentes.
   Nota: É possível selecionar até 16 campos diferentes do microscópio de até 4 microwells diferentes para a aquisição simultânea, multi-well do time-lapse com a definição temporal apropriada (1-2 min por o frame). A limitação baseia-se no número e intensidade (afetando a exposição da câmera) dos diversos fluorocromos a serem imageados (dependendo do número de proteínas fluorescentes expressas, além da CMAC). Uma maneira de aumentar a taxa de quadros é a gravação para o canal CMAC em apenas um em cada "n" prazos para GFP (ou seja, n = 8, como mostrado na Figura 2), uma vez que as células Raji são aderidas ao fundo do poço e não se movem facilmente como células Jurkat. Além disso, isso beneficia a viabilidade celular, uma vez que a exposição à luz UV freqüente pode danificar as células. Tente ajustar a taxa de prazo para 1 quadro a cada 1 minuto ou menos (ou seja, 20 s por quadro no Vídeo 1, Figura 2) desde a polarização do MVB leva alguns minutos para horas para ser concluído. Um microscópio equipado com uma torre de epifluorescência motorizada e filtros ou equivalentes apropriados de fluorescência de passagem de banda são necessários para realizar essa captura multicanal.

7. Formação do ponto final de conjugados e fixação sinápticos

1. Se apenas um experimento de ponto final for planejado (1-2 horas de incubação para permitir a formação conjugada sináptica for apropriado), incubar o deslizamento de câmara a 37 °C, 5% CO₂ para 1-2 h. Verifique a formação conjugada após o período de cultura (como na Figura 1) e, posteriormente, corrigir os conjugados com acetona ou PFA (fixação dependerá dos antígenos e anticorpos a serem utilizados na imunofluorescência subseqüente). Neste caso, a incubação não requer uma incubadora de estágio de microscópio. Por favor, consulte o Vídeo 3 por exemplo.
2. Para consertar as células, lave o poço agitando suavemente com rpmi quente (37 °C) médio sem FCS (albumina do soro pode precipitar com fixação de acetona). Aspirate e adicionar 200 μL de PFA ou acetona pré-refrigerada para cada poço. Incubar o deslizamento de câmara à temperatura ambiente (RT) ou no gelo, respectivamente, por 20 min.
   Nota: Para a fixação da acetona, pré-chill a acetona a -20 °C e pré-frio o slide da câmara em 4 °C. Retire as tampas de plástico quando a acetona é usada para corrigir as células cultivadas nos 8 toboáguas de câmara bem inferiores a vidro.
3. Lave cada poço duas vezes com PBS e adicione 200 μL de solução de extinção (PBS, 50 mM NH₄Cl). Incubar o deslizamento de câmara a 4 °C.
   Nota: Nesta fase, o slide da câmara pode ficar por pelo menos um mês a 4 °C antes de realizar o protocolo de imunofluorescência, conforme descrito⁸. A tampa impede a evaporação.

8. Processamento de imagem

1. Realize a desconvolução de imagem pós-aquisição (ou seja, desconvolução ou equivalente, tabela de materiais)da série time-lapse e/ou fotos estáticas de células fixas. Deconvolute empregando um software apropriado (isto é, usando a opção ótica do "campo largo" em Huygens) e os parâmetros óticos corretos. A desconvolução exige o processamento de imagem da função de spread de ponto medido (PSF) do microscópio^4.
2. Alternativamente, use o software para calcular o PSF idealizado pelo carregamento automático dos parâmetros ópticos incluídos entre os metadados dos arquivos do microscópio. Esses parâmetros ópticos compreendem comprimento de onda fluorocromático, índice de refração, abertura numérica do objetivo e a técnica de imagem (confocal, wide-field, etc.) ^4.
3. Posteriormente, o software de imagem usa o PSF e diversos algoritmos de desconvolução (ou seja, QMLE e CMLE no software Huygens) em um processo de cálculo acumulado rumativo passo a passo, cujos resultados podem ser continuamente visualizados e parados (ou retomado) quando exigido pelo usuário. Nesta fase, o usuário pode alterar o número de convoluções e/ou a relação sinal/ruído e retomar a desconvolução. O software de desconvolução funciona bem com a série time lapse (X, Y,T) (Vídeo 2) e Z-stacks (X, Y,Z) (Vídeo 3). Os canais desconvoluted foram fundidos subseqüentemente ao CMAC, canaleta crua, desde fluorochromes citosólicos, difusos não melhoram pelo deconvolution^4,9.

Results

Nós seguimos o protocolo descrito a fim gerar conjugados imunes da sinapse de Jurkat-Raji e para imaginar corretamente os estágios adiantados da formação do EI. Nosso objetivo era melhorar as primeiras abordagens²⁰ anteriormente seguidas para estudar a polarização do MTOC e da maquinaria de secretismo em relação ao EI. Essas abordagens foram baseadas em uma estratégia de ponto final que não permitia a imagem latente da formação do EI ou dos primeiros eventos sinápticos, uma vez que nessas estratégias a formação do EI ocorria na pelota de células mistas centrífugas, mas não em um microscópio. Nosso protocolo foi projetado para evitar essa ressalva principal, uma vez que a abordagem foi baseada no uso de uma concentração celular adequada (Passos 2 e 3), para favorecer a formação do IS célula-a-célula conjuga nas próprias lâminas de câmara do microscópio (8 micro lâmina de câmara), montadana incubadora de estágio de microscópio pré-aquecido (no Passo 4). Esta estratégia induz a formação do EI, simultaneamente à captura de imagens em lapso de tempo(Vídeo 1).

A Figura 1 representa conjugados sinápticos de Jurkat-Raji que foram obtidos seguindo o protocolo (passo 5.2). A imagem representa o primeiro quadro de um experimento representativo de lapso de tempo. 2 x 10⁵ células Raji e 2 x 10⁵ células Jurkat foram adicionados a um 1 cm² bem. O painel superior mostra canal de transmissão, o painel do meio é composto por CMAC (azul) canal (células Raji), e o painel inferior mostra tanto a transmissão mais canais cmac fundida. As setas amarelas rotulam alguns conjugados sinápticos, como referência, enquanto as setas verdes indicam conjugados sinápticos feitos por uma célula Jurkat e várias células Raji (conjugados complexos). Diminuir as concentrações celulares (10⁵ ou menos células no poço de 1 cm²⁾ irá contornar a formação de conjugados celulares complexos, mas pode não haver conjugados celulares suficientes para a análise posterior do tráfego polarizado (veja abaixo), que por sua vez diminuirá também as chances de encontrar e imagem emergentes conjuga.

A Figura 2 representa capturas de tela correspondentes aos parâmetros de imagem usados para a captura simultânea dos dois fluorocromos diferentes (CMAC e GFP-CD63) usando software apropriado (ou seja, NIKON NIS_AR) em um experimento representativo de lapso de tempo correspondente ao Vídeo 1.

O vídeo 1 (sinapses imunológicas, crus) representa um linfócito Jurkat T expressando GFP-CD63 (um marcador de corpos multivesiculares-MVB, vesículas verdes) e a formação de uma sinapse dupla entre 1 célula Jurkat e 2 células Raji rotuladas com CMAC, em azul (uma delas sofre de engolfamento). O movimento simultâneo de MVB dentro da célula Jurkat em direção às áreas de sinapse foi registrado (taxa de quadro de captura = 1 quadro a cada 20 segundos para GFP-CD63; velocidade de reprodução de vídeo = 2 quadros por s). Os conjugados sinápticos foram obtidos e imagemdos seguindo o protocolo descrito acima (Passo 6.2), que permitiu imagens de sinapses emergentes (Vídeo 1). A captura simultânea dos canais de fluorescência GFP-CD63 e CMAC foi realizada usando um software apropriado (ou seja, NIS-AR, Tabela de Materiais). O vídeo representa os dados brutos de um experimento representativo de lapso de tempo. O sistema de foco automático foi definido com uma compensação apropriada no que diz respeito às pilhas de Raji limitadas à parte inferior de vidro, para assegurar um foco estável ao longo da experiência.

Vídeo 2 (sinapses imunológicas, após deconvolução) corresponde ao Vídeo 1, mas a desconvolução das imagens do canal de fluorescência GFP-CD63 foi realizada empregando um software de desconvolução apropriado (ou seja, Huygens), usando a opção óptica de "campo largo" e os parâmetros ópticos adequados (8). Este canal desconvoluted foi posteriormente fundido ao CMAC, canal bruto. A melhoria da relação sinal-ruído e nitidez da imagem é evidente. A desconvolução foi realizada após a aquisição, como descrito acima. Para detalhes específicos sobre o software de desconvolução, consulte⁴.

O vídeo 3 (sinapse imunológica, após a fixação e a coloração de imunofluorescência) representa uma pilha Z (tamanho z-passo = 0,8 μm, 5 quadros) de um conjugado fixo de IS após a etapa 6 do protocolo (fixação de acetona). Após a fixação, a imunofluorescência foi realizada seguindo protocolos padrão²⁵ usando pfalooidin para visualizar o F-actin (verde), anti-CD63 para visualizar MVB (magenta), anti-γ-tubulin para visualizar MTOC (vermelho). CMAC (azul) rotula a célula Raji. Posteriormente, o conjugado foi imagemdos por epifluorescência e vários canais desconvoluted usando o "campo largo" opção óptica e os parâmetros ópticos adequados (passo 7). Os canais desconvolitutos foram posteriormente fundidos ao CMAC, canal bruto, como indicado nos diferentes painéis (CMAC mais Transmissão-TRANS, CMAC mais Phallodin, CMAC mais anti-CD63 e CMAC mais anti-γ-tubulina, respectivamente). A seta branca rotula a sinapse, enquanto a seta verde rotula o MVB e a seta amarela rotula o MTOC. A quantificação detalhada da polarização MVB e MTOC foi explicada em outros lugares^25.

A abordagem aqui apresentada envolve a formação de conjugados de célula para célula e, simultaneamente, a aquisição de lapso de tempo pela microscopia de fluorescência de campo largo (WFFM), seguida pelo processamento de imagem (desconvolução pós-aquisição). Essa tática melhorou a relação sinal/ruído (SNR) das imagens, aumentou sua resolução temporal e permitiu a aquisição sincronizada de vários fluorocromos em conjugados sinápticos emergentes⁴. Além disso, o protocolo é bem combinado com os métodos subsequentes de fixação de células de ponto final (paraformaldeído, acetona ou metanol), o que permitiria mais imunofluorescência manchas e análises²⁵ (Vídeo 3). Este protocolo também é compatível com a microscopia confocal de varredura a laser e outras técnicas de microscopia de última geração.

Figura 1: Campo representativo da microscopia de tamanho duplo de conjugados sinápticos. A imagem representa o primeiro quadro de um experimento representativo de lapso de tempo seguindo o protocolo. O painel superior mostra o canal de transmissão, o canal CMAC do painel médio (células Raji) e o painel inferior ambos os canais fundidos. Setas amarelas rotulam alguns conjugados sinápticos, como referência. Setas verdes indicam conjugados sinápticos complexos (ou seja, uma célula Jurkat que estabelece sinapses com mais de uma célula Raji). Capturado com um objetivo de 40x EWD (0,6 NA). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Configurações de microscópio de lapso de tempo. A imagem corresponde a várias capturas de tela correspondentes aos parâmetros de imagem usados para a captura simultânea dos dois fluorocromos diferentes (CMAC e GFP-CD63) usando software apropriado (ou seja, NIKON NIS_AR) em um experimento representativo de lapso de tempo correspondente ao Vídeo 1. Cada quadro para o canal GFP-CD63 foi capturado a cada 20 anos. Apenas um quadro para um canal UV de oito quadros para o canal GFP foi capturado, a fim de manter a viabilidade celular ao longo do experimento. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Vídeo 1: Sinapses imunológicas feitas por uma célula Jurkat expressando GFP-CD63, dados brutos. Células Raji B rotuladas com célula rastreador azul (CMAC, azul) foram pulsadas com SEE por 30 min e sinapses com células Jurkat expressando GFP-CD63⁸ foram formadas. Lapsos de tempo correspondentes aos canais GFP-CD63 e CMAC foram capturados (20 s por quadro; velocidade de reprodução de vídeo = 2 quadros por s) e um exemplo representativo é mostrado. Capturado com um objetivo de 60x PLAN APO (1,4 NA). Clique aqui para ver este vídeo (Clique certo para baixar).

Vídeo 2: Sinapses imunológicas feitas por uma célula Jurkat expressando GFP-CD63, após desconvolução. Mesmo que o vídeo 1, mas as imagens foram deconvoluted usando um software de desconvolução. A melhorrela sinal/ruído e a maior nitidez, devido à eliminação de contaminantes fora da fluorescência de foco, são evidentes. Clique aqui para ver este vídeo (Clique certo para baixar).

Vídeo 3: Sinapse imunológica fixa e imunosmanchada. A imagem mostra um conjugado sináptico fixo representativo após a etapa 7 do protocolo e a imunofluorescência subseqüente. CMAC (azul) rotula células raji, transmissão (TRANS) para mostrar o conjugado sináptico (seta branca), phalloidin rótulos F-actin (verde), anti-CD63 rótulos MVB (magenta, seta verde) e anti-γ-tubulin rótulos MTOC (vermelho, seta amarela), respectivamente. Esses canais foram imageados por epifluorescência, desconvoluted e fundida como indicado. O vídeo inclui uma pilha Z (z-passo tamanho = 0,8 μm, 5 quadros). A seta branca rotula a área de contato sináptica, enquanto a seta verde rotula o MVB e a seta amarela rotula o MTOC. Clique aqui para ver este vídeo (Clique certo para baixar).

Discussion

Uma limitação deste protocolo é que nem todas as sinapses serão idealmente orientadas perpendiculares ao eixo óptico. Usando esta técnica, não há nenhuma maneira de prever e/ou influenciar a orientação ideal para a imagem latente imune da sinapse. Para corrigir esse problema, excluímos das análises subsequentes todas as sinapses capturadas aleatoriamente que finalmente não preenchem os critérios ideais. Estas sinapses, oportunamente, não são muito freqüentes. No entanto, é possível contornar essa limitação usando várias abordagens experimentais^4.

A liberação polarizada de CD63 (degranulação) pode ser quantificada por outras técnicas complementares, como a coloração da superfície celular de CD63 (relocalização CD63 à superfície celular) em células vivas (não fixas e não permeabilizadas), após o passo 6, e subsequente lavagem e fixação, como mostrado anteriormente⁸. Além disso, a liberação de CD63 em exossomos^8,9 e quantificação exômica por análises de rastreamento de nanopartículas^9,25 podem ser realizadas. Essas abordagens são certamente compatíveis com o nosso protocolo, desde que a fixação esteja sendo realizada após a imunofluorescência da superfície celular das células vivas.

Nós encontramos que o número ideal de pilhas (para um 1 cm² bem na corrediça da câmara de 8 poços) é 4 x 10⁵ pilhas (2 x 10⁵ pilhas de Raji e 2 x 10⁵ pilhas de Jurkat) desde que aderem eficientemente à parte inferior do poço. A eficiência de ligação ao plástico (usando fibronectina), ou fundo de vidro (usando poli-L-lisina) microslides geralmente não é um problema. Números celulares mais altos podem não produzir lacunas entre as células aderidas e, posteriormente, conjugados sinápticos complexos (Figura 1); ambas as situações não são desejáveis quando os conjugados de célula única para célula precisam ser visualizados, por exemplo, em experimentos de polarização de grânulos do MTOC ou da cónese. Menor número de células pode diminuir as chances de encontrar conjugados, especialmente quando as células Jurkat transinfectadas são desafiados com APC para gerar sinapses. Por favor, note que observamos que uma incubadora de estágio estabilizada pela temperatura no local no estágio do microscópio X/Y antes do início do protocolo (ou seja, 1-2 h de antecedência para estabilizar a configuração de estágio/microscópio) mantém parâmetros estáveis de X,Y,Z, o que é crucial para a imagem adequada. Sistema de foco automático acabará por compensar pequenas variações Z.

Quando certas técnicas de transdução gênica, como eletroporação, são usadas para expressar proteínas quiméricas fluorescentes (ou seja, GFP-CD63) nos clones jurkat(Vídeo 1),uma fração considerável das células pode morrer após a eletroporação. Isso pode ser um problema, uma vez que, embora as células mortas não formam sinapses, quando eles estão em excesso sobre os vivos, células transinfectadas, eles podem interferir com a formação de conjugados feitos por células Th vivos. Nós encontramos que a eliminação cuidadosa de pilhas inoperantes das culturas transfected usando um meio do gradiente da densidade que segue protocolos padrão antes que a etapa conjugada da formação possa certamente aumentar as possibilidades à imagem corretamente conjugates. Além disso, baixa eficiência de transfecção (<20%) pode ser uma ressalva importante, uma vez que este, combinado com uma eficiência de formação moderada conjugada (cerca de 60%)²⁵, irá diminuir a probabilidade de encontrar conjugados feitos por células transfeccionadas. Este não é um problema quando as células não transacionadas são usadas para obter conjugações em experimentos de ponto final e fixação subseqüente. Os 8 slides de câmara de micropoçosão são compatíveis com protocolos convencionais de imunofluorescência. Isso aumenta a flexibilidade do protocolo acima com diferentes propósitos. Fixação com acetona pode ser um problema a considerar ao usar slides de câmara com poços de fundo de plástico. No entanto, existem 8 lâminas de câmara de microscópio de microsmato comercialmente disponíveis contendo fundos de vidro, que são compatíveis com fixação de acetona. Retire as tampas de plástico quando a acetona é usada para corrigir as células cultivadas em 8 micropoços de vidro de vidro slides de câmara.

Recomenda-se que o microscópio esteja equipado com um estágio XY motorizado, torre de epifluorescência motorizada e sistema de foco automático (por exemplo, Sistema de Foco Perfeito) ou suplementos equivalentes. Quando a aquisição multi-bem é necessária^25,o sistema de foco automático irá garantir um foco estável ao longo do experimento. A experiência anterior indica que, ao estabelecer um foco adequado compensado nas células Raji, tanto o movimento das células T (Vídeo 1) quanto os movimentos de slides de estágio/câmara do microscópio em experimentos multipontos XY, podem ser compensados. Isso é de fato conveniente para a captura de lapso de tempo multiwell.

Uma câmera de dispositivo acoplado (CDD) de vidro e resfriado em preto e branco, pancromática e resfriado foi usada, mas a câmera de semicondutores complementares de óxido de metal complementar (sCMOS) de maior sensibilidade, fluorescência científica é desejável, uma vez que isso diminuirá os tempos de exposição da câmera e melhorará a resolução temporal. Os tempos curtos de exposição da câmera que usamos (formulário de classificação de 100 ms a 500 ms) combinados com o obturador automático de fluorescência permite a captura prolongada de lapso de tempo (até 24 h) com uma resolução de tempo adequada (1 quadro por minuto ou menos, para até 16 posições XY) sem branqueamento de fluorescência significativa e/ou perda na viabilidade celular. O estágio motorizado permite a captura multi-ponto (XY) e aumenta a chance de encontrar e imagem das sinapses emergentes e em desenvolvimento na orientação ideal, mas também permite a aquisição de imagem em slides de câmara multiwell quando diferentes clones Jurkat precisam ser simultaneamente conjugados²⁵. Alta abertura numérica do objetivo (ou seja, 60x, 1,4) é necessária para obter os melhores resultados ao analisar o tráfego de grânulos de secretismo.

O RAJI-SEE-Jurkat constitui um modelo de sinapse imunológica bem estabelecido que tem sido usado por uma miríade de pesquisadores desde que foi originalmente descrito¹¹. Adaptamos nosso protocolo a este modelo para a imagem adequada dos estágios iniciais da formação do EI. Nosso objetivo era melhorar as primeiras abordagens²⁰ anteriormente seguidas para estudar a polarização do MTOC e da maquinaria de secretismo em relação ao EI. É notável que os conjugados feitos com este protocolo produzam reorganização f-actin na sinapse, configurando um SMAC canônico, concomitantemente para o tráfego polarizado MVB²⁵. Esses eventos cruciais também foram analisados e validados pela microscopia confocal^25.

Diferenças cinéticas no tráfego polarizado existem entre diferentes tipos de EI. Por exemplo, o transporte polarizado de grânulos líticos de CTLs ocorre em segundos ou muito poucos minutos, enquanto várias vesículas contendo citocinas dos linfócitos Th levam de minutos até várias horas para terminar. Essas dessemelhanças temporais devem ser levadas em conta com antecedência, a fim de projetar a melhor estratégia e selecionar a abordagem experimental e de imagem mais apropriada, já que para alguns estratagemas de imagem (ou seja, microscopia confocal de varredura a laser (LSCM)), o tempo pode ser um fator limitante, já que o tempo de captura é muito maior do que a resolução de tempo apropriada (1 min ou menos)⁴. Esta não é uma limitação quando a microscopia de fluorescência de campo largo (WFFM) é usada conforme descrito no protocolo acima. Uma vez que em CTLs, a polarização do MTOC em direção à sinapse dura apenas alguns minutos^3,6,17, diversas abordagens específicas de microscopia de última geração diferentes das descritas aqui (mas abrigando maior resolução espacial e temporal) são necessárias para a imagem adequada dessas sinapses^26,27, principalmente quando vários microscópios (captação multi-ponto) são imagemdos. Essas novas abordagens de alta resolução também podem ser utilizadas para a imagem das sinapses feitas pelos linfócitos Th, embora razões econômicas e/ou logísticas (ou seja, o equipamento principal necessário para algumas dessas técnicas de imagem custe 6-7 vezes mais do que a descrita aqui) certamente poderia constituir uma limitação para esses métodos de imagem de última geração^4. O fato de que é feito por linfócitos Th são de longa duração, ea circunstância de que em Th linfócitos o MTOC, o linfokine contendo vesículas de secretismo e MVB levar de vários minutos até horas para transportar e doca para o IS²², torna este protocolo uma abordagem ideal e acessível para a imagem do Th-APC IS.

Wffm em combinação com a desconvolução de imagem pós-aquisição constitui uma abordagem interessante e não apenas razões econômicas apoiar esta estratégia. A má resolução intrínseca no eixo Z (a ressalva mais importante da técnica) pode ser melhorada usando a desconvolução de imagem pós-aquisição⁴ (compare o Vídeo 1 com o Vídeo 2). A desconvolução usa uma abordagem de processamento de imagem baseada em cálculo que pode melhorar a relação de sinal e ruído e resolução de imagem e contraste²⁷ até 2 vezes, até 150-100 nm no eixo XY e 500 nm no eixo Z⁴.

O uso de maior sensibilidade, alta velocidade de leitura e ampla gama dinâmica, novas câmeras fluorescência sCMOS irá melhorar a qualidade das imagens e irá reduzir o branqueamento de fluorescência. A flexibilidade oferecida pelo protocolo de conjugação célula-célula descrito aqui permite a combinação da abordagem celular descrita com várias técnicas de microscopia de última geração, tanto em células vivas, mas também em células fixas, quanto no resultado esperado irá de fato melhorar o nosso conhecimento da sinapse imunológica.

Embora tenhamos implementado e validado o protocolo usando linhas celulares bem estabelecidas e fáceis de manusear, o potencial da abordagem pode permitir a visualização de interações mais fisiológicas quando as células T primárias e diferentes tipos de células que apresentam antígenos (como células dendríticas de macrófagos) são usadas^5. Neste contexto, este protocolo também foi estendido e validado usando a linha de células EL-4 de camundongo pulsada de superantígeno (SEB) usada como APC, para desafiar os linfobos primários do camundongo T⁹. Na verdade linfocitos T primários, CTLs em particular, prestados mais de curta duração e contatos sinápticos dinâmicos (ver Vídeo Suplementar 8 em referência⁹) para aqueles vistos com o modelo SEE-Raji e Jurkat. A variabilidade dos modos de contato sináptico pode ser melhor observada para interações primárias com células Tendríticas ou células B em equivalentes bidimensionais de tecido in vitro que também podem ser registrados e analisados usando este protocolo. Além disso, além de superantígenos, a técnica pode ser usada para imagem de outros tipos de sinapses. Por exemplo, ele poderia ser usado em um modelo transgênico de células T específicos de antígeno, por exemplo, usando o sistema ot1/OT2 específico de urina de ovalbumina ou por transfecção de células T com receptores de células T específicos de antígeno. Isso abre uma miríade de possibilidades experimentais para o futuro imediato.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Câmera Nikon DS-QI1MC	Nikon	MQA11550	Cabeça de Câmera Refrigerada
CMAC	ThermoFisher Scientific	C2110	Cell tracker azul
células JURKAT	ATCC	ATCC TIB-152	Effector T linfócitos
μ-Slide 8 poço ibiTreat, μ-Slide 8 poço Glass-Bottom	IBIDI	Cat.No: 80826, 80827	Cultura de células e suportes de imagem celular
Microscópio NIKON Eclipse Ti-E	Nikon	NIKON Eclipse Ti-E	Microscópio de fluorescência de campo amplo, totalmente motorizado, equipado com a opção Perfect Focus System (PFS)
Incubadora de estágio de microscópio com misturador de gás manual de 3 canais e borbulhador de gás/módulo de umidade	OKOLAB	H201-NIKON-TI-S-ER	Atmosfera de cultura de células
Raji Células ATCC		ATCC CCL-86	APC
RPMI médio GIBCO	ThermoFisher Scientific	21875034	Meio de cultura
Streptococcus Enterotoxin E (SEE)	Toxin Technology, Inc	EP404	Software de toxina bacteriana
Huygens Essential	SVI	Huygens Essential	Image Software de deconvolução
Software ImageJ		NIH Image J	Software de imagem
Nikon NIS-AR	Nikon	NIS-Elements AR	Software de captura e análise de imagens