Padronização da geometria de colônias de células-tronco embrionárias humanas em substratos compatíveis para controlar a mecânica de nível de tecido

Resumo

Os ligantes da matriz extracellular podem ser modelados em hidrogéis do poliacrilamida para permitir a cultura de pilhas de haste embrionário humanas em colônias confinadas em carcaças complacentes. Este método pode ser combinado com a microscopia da força da tração e os ensaios bioquímicos para examinar o interação entre a geometria do tecido, as forças pilha-geradas, e a especificação do Fate.

Resumo

As células-tronco embrionárias humanas demonstram uma capacidade única de responder a morfogênios in vitro por padrões de autoorganização da especificação de destino celular que correspondem à formação de camada germinativa primária durante a embriogênese. Assim, essas células representam uma ferramenta poderosa com a qual examinar os mecanismos que impulsionam o desenvolvimento humano precoce. Desenvolvemos um método para cultura de células-tronco embrionárias humanas em colônias confinadas em substratos complacentes que fornecem controle sobre a geometria das colônias e seu ambiente mecânico, a fim de recapitular os parâmetros físicos que embriogênese fundamentam. A característica chave deste método é a habilidade de gerar hidrogéis do poliacrilamida com testes padrões definidos do ligante extracelular da matriz na superfície para promover o acessório da pilha. Isto é conseguido fabricando stencils com os padrões geométricos desejados, usando esses estênceis para criar padrões de ligante de matriz extracelular em coberturas de vidro, e Transferindo esses padrões para hidrogéis de poliacrilamida durante a polimerização. Este método também é compatível com a microscopia de força de tração, permitindo ao usuário medir e mapear a distribuição de forças geradas por células dentro das colônias confinadas. Em combinação com ensaios bioquímicos padrão, essas medições podem ser usadas para examinar o papel que as pistas mecânicas desempenham na especificação do destino e na morfogênese durante o desenvolvimento humano precoce.

Introdução

Células-tronco embrionárias humanas (hESCs) possuem grande promessa para uso em aplicações de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos. A natureza pluripotente destas células dá-lhes a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula adulta. Enquanto grandes avanços foram feitos na direção do destino de hESCs a tipos de células particulares, manteve-se muito difícil de gerar tecidos inteiros ou órgãos de novo^1,2,3,4, a ⁵. Isto é devido, em grande parte, a uma compreensão limitada dos mecanismos que impulsionam a formação destes tecidos durante o desenvolvimento humano. A fim de preencher essa lacuna no conhecimento, vários métodos surgiram nos últimos anos para modelar o embrião precoce e estágios subsequentes de desenvolvimento com células-tronco embrionárias^{6,7,8,9 ,10,11,12,13}.

Logo após a derivação das primeiras linhagens de hESC¹⁴, foi demonstrado que corpos embrióides formados a partir de hESCs eram capazes de produzir espontaneamente células das três camadas germinativas primárias⁶. No entanto, devido à inerente falta de controle sobre o tamanho e a morfologia dos corpos embrióides, a organização das camadas germinativas variou significativamente e não combinou com a organização do embrião precoce. Mais recentemente, Warmflash et al. desenvolveram um método para confinar colônias de hESCs em substratos de vidro via micropadronização, proporcionando controle e consistência sobre o tamanho e a geometria das colônias⁸. Na presença de BMP4, um What importante no desenvolvimento adiantado, estas colônias confinadas eram capazes de testes padrões reprodutíveis Self-organizando da especificação aos destinos que representam as camadas de germe preliminares. Embora isso tenha proporcionado um modelo útil para estudar os mecanismos pelos quais se estabelecem as camadas germinativas primárias, os padrões de especificação do destino não correspondem precisamente à organização e à morfogênese observadas durante a embriogênese¹⁵. Uma recapitulação mais fiel do desenvolvimento embrionário precoce foi conseguida através da incorporação de hESCs em uma matriz extracelular tridimensional (ECM) do matrigel¹¹, proporcionando a evidência mais forte até à data para a capacidade de hESCs se AutoOrganizar e modelar estágios iniciais da embriogênese ex vivo. No entanto, esse método produz resultados inconsistentes e, portanto, é incompatível com um número de ensaios que poderiam ser usados para revelar os mecanismos subjacentes de autoorganização e especificação de destino.

Diante desses métodos existentes e suas respectivas limitações, buscou-se desenvolver um método de cultivo reacional de colônias de hESC de geometrias definidas em condições que modelem o ambiente extracelular do embrião precoce. Para isso, utilizamos hidrogéis de poliacrilamida de elasticidade ajustável para controlar as propriedades mecânicas do substrato. Usando microscopia de força atômica em embriões de frango em estágio de gastrulação, descobrimos que a elasticidade do epiblasto variou de centenas de pascals a alguns kilopascals. Assim, concentramos-nos na geração de hidrogéis de poliacrilamida com elasticidade nesta faixa para servir como substrato para colônias de hESC. Nós modificamos nossos métodos anteriores para a cultura de hESCs em hidrogéis de poliacrilamida^7,9 para fornecer um controle robusto sobre a geometria das colônias. Nós conseguimos este pela primeira padronização ligands ECM, ou seja, matrigel, em coberturas de vidro através de stencils microfabricados, como relatado anteriormente¹⁶. Nós projetamos então uma técnica nova para transferir o ligante modelado à superfície de hidrogéis do poliacrilamida durante a polimerização. O método que descrevemos aqui envolve o uso de fotolitografia para fabricar uma bolacha de silício com os padrões geométricos desejados, criando selos de teses características geométricas com polidimetilsiloxano (PDMS), e usando esses selos para gerar os estênceis que em última análise, permitir a padronização de ligante na superfície de coberturas de vidro e transferência para poliacrilamida.

Além de recapitular o ambiente mecânico do embrião precoce, confinando colônias de hESC em poliacrilamida possibilita a mensuração de forças geradas por células com microscopia de força de tração (TFM), conforme relatado em nosso método anterior⁹. Em resumo, os grânulos fluorescentes podem ser encaixados no poliacrilamida e ser usados como marcadores de a. As forças geradas por células são calculadas por imagem do deslocamento dessas esferas após a semeadura de hESCs no substrato padronizado. Além disso, os mapas de força de tração resultantes podem ser combinados com ensaios tradicionais, como imunocoloração, para examinar como a distribuição de forças geradas por células em colônias de hESC confinadas pode regular ou modular a sinalização a jusante. Nós esperamos que estes métodos revelarão que as forças mecânicas jogam um papel crítico no padronização da especificação do Fate da pilha durante o desenvolvimento embrionário adiantado que é negligenciado atualmente.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui relativos ao uso de hESCs foram aprovados pelo Comitê humano do Gamete, do embrião e da pesquisa da pilha de haste (GESCR) na Universidade de Califórnia San Francisco.

1. preparação de wafer de silício com características geométricas

1. Crie uma máscara fotográfica com recursos geométricos desejados. Use o software de desenho assistido por computador para projetar os recursos. Para o uso com photoresist negativo, faça as características opacas e o restante da máscara transparente.
   Nota: para a padronização em coberturas de 18 mm de diâmetro, as feições de grupo para cada condição experimental em áreas de 10 x 10 mm para garantir que os estênceis gerados na etapa 3 caiam sobre as coberturas.
2. Spin Coat fotoresistente negativo para uma bolacha de silício de 100 mm. Use a folha de dados fotororesista para determinar a velocidade e o comprimento da rotação para gerar uma espessura de filme de 100-250 μm.
   Nota: a espessura do filme deve ser ajustada de tal forma que a proporção da largura dos padrões para a altura do estêncil é o mais próximo de 1:1 possível. No entanto, recomendamos uma espessura mínima de 100 μm, pois nada menos produz estênceis delicados que facilmente rasgam.
3. Processe o fotororesista de acordo com a folha de dados do produto. Isto envolve tipicamente um cozer macio, exposição UV com Fotomáscara em um alinhador da máscara, cozer da exposição do borne, desenvolvimento, e cozer duro. Como exemplo, o procedimento usado para processar os wafers usados neste protocolo é esboçado na tabela 1.
   Nota: ser cauteloso ao manusear bolachas de silício como eles são frágeis. Uma vez gerados, as bolachas podem ser usadas repetidamente, desde que não sejam danificadas.

2. preparação de coberturas

1. Preparação de coberturas "Top" lavadas a ácido
   1. Coloc 18 milímetros de diâmetro #1 COVERSLIP da espessura em um prato de Petri de vidro. O número apropriado de coberturas depende do tamanho do prato. Para um prato de 100 mm, prepare 50-100 COVERSLIP de cada vez. As quantidades de volume dadas através do restante desta seção correspondem a um prato de 100 mm.
   2. Adicione 20 mL de HCl de 1 M à placa de Petri e agite delicadamente o prato para dispersar os COVERSLIP. Assegure-se de que todas as coberturas estejam submersas e libertem bolhas de ar entre as lamínulas. Incubar durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave.
      Cuidado: o HCl é ácido e corrosivo. Tenha cuidado e use EPI apropriados ao trabalhar com HCl.
   3. Decant HCl do prato. Adicione 20 mL de água ultrapura e lave com agitação suave durante 10 min. descarte a água e repita para um total de cinco lavagens.
   4. Depois de descartar a lavagem final, adicione 20 mL de etanol a 100% ao prato. Usando fórceps, retire as lamínulas individualmente e arranje entre dois pedaços de papel de filtro para secar.
   5. Armazene coberturas secas em um recipiente selado. As coberturas com lavagem ácida podem ser preparadas com antecedência e armazenadas por um mês ou mais em condições livres de poeira.
2. Preparação de COVERSLIP "Bottom" ativado por glutaraldeído
   Nota: refira métodos precedentes para detalhes adicionais^7,9.
   1. Coloque 18 mm de diâmetro #1 COVERSLIP de espessura em uma placa de Petri.
   2. Adicionar 20 mL de 0,2 M HCl para a placa de Petri e agitar suavemente o prato para dispersar os lamínulas. Assegure-se de que todas as coberturas estejam submersas e libertem bolhas de ar entre as lamínulas. Incubar durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave.
   3. Decant HCl do prato. Adicione 20 mL de água ultrapura e lave com agitação suave durante 10 min. descarte a água e repita para um total de cinco lavagens.
   4. Depois de descartar a lavagem final, adicione 20 mL de NaOH de 0,1 M e agite suavemente para dispersar e submergir as coberturas. Incubar à temperatura ambiente com agitação suave durante 1 h.
   5. Decant NaOH do prato. Adicione 20 mL de água ultrapura e lave com agitação suave durante 10 min. descarte a água e repita para um total de cinco lavagens.
   6. Após descartar a lavagem final, acrescente 20 mL de uma diluição de 1:200 de 3-aminopropiltrimetoxisilano em água ultrapura e agite suavemente para dispersar e submergir as coberturas. Incubar à temperatura ambiente com agitação suave durante 1 h ou durante a noite.
      PRECAUÇÃO: 3-aminopropiltrimetoxisilano é inflamável e pode provocar irritação cutânea. Manuseie com cuidado, use EPI apropriados e descarte os resíduos de acordo com os regulamentos de descarte local.
   7. Decantar a solução diluída de 3-aminopropyltrimethoxysilane do prato. Adicione 20 mL de água ultrapura e lave com agitação suave durante 10 min. descarte a água e repita para um total de pelo menos cinco lavagens. É crítico remover todo o 3-aminopropyltrimethoxysilane antes de prosseguir.
   8. Após descartar a lavagem final, adicione 20 mL de uma diluição de 1:140 de glutaraldeído a 70% em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e agite suavemente para dispersar e submergir os lamínulas. Incubar à temperatura ambiente com agitação suave durante 1 h ou durante a noite.
      Cuidado: 70% glutaraldeído é tóxico e pode causar irritação da pele. Manuseie com cuidado, use EPI apropriados e descarte os resíduos de acordo com os regulamentos de descarte local.
   9. Decantar a solução de glutaraldeído diluído do prato. Adicione 20 mL de água ultrapura e lave com agitação suave durante 10 min. descarte a água e repita para um total de cinco lavagens.
   10. Depois de descartar a lavagem final, adicione 20 mL de etanol a 100%. Usando fórceps, retire as lamínulas individualmente e arranje entre dois pedaços de papel de filtro para secar.
   11. Armazene coberturas secas em um recipiente selado. As coberturas ativadas por glutaraldeído podem ser preparadas com antecedência e armazenadas por até seis meses.

3. geração de stencils para padronização de ligante ECM

1. Gerando selos intermediários de polidimetilsiloxano (PDMS)
   1. Misture a base de PDMS com o agente de cura de PDMS em uma relação 10:1, pelo peso. Homogeneizar.
      Nota: para a aplicação inicial de PDMS, prepare aproximadamente 100 g de PDMS para encher um prato de 100 mm. Para aplicações subsequentes, remova o PDMS apenas do centro do prato onde as características da bolacha de silício estão localizadas e prepare 20-30 g de novos PDMS.
   2. Degas a mistura PDMS em um dessecador para 30-60 min ou até que todas as bolhas de ar são removidas.
   3. Coloque a bolacha de silício modificada da etapa 1 em um prato de plástico de 100 mm. Lentamente e uniformemente despeje a mistura PDMS sobre a superfície do wafer. Bata o prato na superfície de trabalho para liberar quaisquer bolhas de ar da superfície do wafer.
   4. Degas a mistura PDMS derramado sobre a bolacha por 10 min ou até que todas as bolhas de ar são removidos ou ter chegado à superfície do PDMS.
   5. Asse o PDMS a 70 ° c por 2 h. deixe esfriar a temperatura ambiente.
   6. Usando um bisturi ou cortador de caixa, recorte a seção de PDMS do centro do prato que contém as características geométricas.
   7. Corte o PDMS em cerca de 10 x 10 mm quadrados, cada um contendo os recursos para uma única condição experimental. Estes são referidos como "selos" nas etapas subseqüentes do protocolo.
2. Gerando lajes planas de PDMS
   1. Misture a base de PDMS com o agente de cura de PDMS em uma relação 8:1, pelo peso. Prepare aproximadamente 20 g para cada prato de 100 mm a ser usado. Homogeneizar.
   2. Degas a mistura PDMS em um dessecador para 30-60 min ou até que todas as bolhas de ar são removidas.
   3. Lentamente e uniformemente despeje o PDMS em um limpo 100 mm prato. Bata o prato na superfície de trabalho para liberar quaisquer bolhas de ar.
   4. Asse o PDMS a 70 ° c por 2 h. deixe esfriar a temperatura ambiente.
   5. Retire o PDMS do prato. Inverta de tal forma que a superfície do PDMS que estava em contato com a parte inferior do prato está voltada para cima.
   6. Para cada carimbo gerado na etapa 3,1, corte um quadrado de 15 x 15 mm de PDMS. Estes são referidos como "lajes lisas" em etapas subseqüentes do protocolo.
3. Gerando stencils
   1. Organize lajes planas de PDMS na tampa de um prato de 150 mm, ou outra superfície plana para facilitar a manipulação. Assegure espaçamento suficiente entre lajes (por exemplo, para um prato de 150 mm, organize nove lajes planas com espaçamento mesmo).
   2. Inverta cada selo gerado na etapa 3,1 em uma laje Lisa de PDMS, tais que as características no selo estão em contacto com a laje Lisa de PDMS. Pressione suavemente na parte superior do carimbo com fórceps para garantir mesmo o contato.
   3. Cuidadosamente prop a tampa segurando PDMS carimbo/laje pares na base do prato, de tal forma que a tampa repousa em um ângulo. Isto ajuda a wicking do polímero UV-curable na etapa seguinte.
   4. Coloc uma gota pequena do polímero UV-curable na relação superior de cada par do selo/laje. O polímero será perverso entre os dois por tensão superficial, assistido pela gravidade.
      Nota: muitos polímeros UV-curáveis diferentes podem trabalhar neste protocolo. Nós selecionamos o adesivo ótico 74 de Norland para as seguintes propriedades: i) cura rápida em cima da exposição à luz UV, II) remoção fácil dos selos de PDMS em cima da cura, III) adesão robusta aos COVERSLIP de vidro com pressão manual.
   5. Uma vez que o polímero foi completamente iníquo através, coloc a tampa com pares do selo/laje horizontalmente na superfície de trabalho. Coloc uma gota pequena do polímero UV-curable em cada um dos três lados restantes de cada relação do selo/laje.
   6. Usando uma ponta de pipeta de 200 μL, conecte as gotas do polímero em torno das bordas da relação do selo/laje. Isso cria uma borda que irá armazenar a solução de ligante na etapa 4.
      Nota: tenha cuidado ao trabalhar o polímero em torno das bordas do carimbo. Se a relação do selo/laje é interrompida, o polímero pavio as características e o estêncil não formarão corretamente.
   7. Coloc com cuidado os pares do selo/laje em uma caixa da UV-esterilização. Use a configuração de energia estéril "Str" e expor por 10 min.
   8. Retire os pares de carimbo/laje da caixa de esterilização por UV. Usando dois pares de fórceps, remova delicadamente o selo de PDMS ao segurar a laje Lisa e o estêncil que deram forma do polímero UV-curable.
   9. Usando fórceps, Retire cuidadosamente o estêncil e inverta-o de tal forma que a superfície que estava em contato com a laje plana do PDMS está voltada para cima.
      Nota: os estênceis são delicados. Tenha cuidado ao entregá-los, especialmente enquanto inicialmente removê-los do PDMS, de modo que eles não rasgar.
   10. Coloc os stencils invertidos de volta em uma caixa da UV-esterilização. Use a configuração de energia estéril "Str" e expor por 3 min.

4. padronização de ligante ECM em COVERSLIP

1. Prensagem de estênceis em coberturas com lavagem ácida
   1. Coloc um lamela ácido-lavado para cada estêncil em uma parte limpa de película do laboratório.
   2. Usando o fórceps, coloc com cuidado cada estêncil, liso-lado-para baixo, em um COVERSLIP ácido-lavado. Coloque de tal forma que os recursos estão centralizados na lamínula.
   3. Coloque um pequeno pedaço de filme de laboratório em cima de cada estêncil. Pressione firmemente e uniformente para baixo no estêncil para criar o contato forte entre o estêncil e o COVERSLIP.
      Nota: este é um passo crítico! Pressione firmemente e em toda a superfície do estêncil. Se o contato suficiente não é criado, a solução do ligante vazará entre o estêncil e os COVERSLIP e o padronização falhará. OPCIONAL: para confirmar o contato suficiente entre o estêncil e a lamínula, Pipetar 100 μL de água estéril ultrapura sobre a superfície de cada estêncil e incubar à temperatura ambiente. Depois de 1 h, verifique se há vazamento. Aspirar a água de stencils com sucesso ligado e proceder.
2. Plasma que limpa a superfície dos COVERSLIP stenciled para aumentar o Hidrofilia
   1. Coloc os COVERSLIP com os stencils em um líquido de limpeza do plasma. Aplique plasma de alta potência por 30 s.
3. Preparação da solução de ligantes ECM
   Nota: todas as etapas subsequentes devem ser concluídas em condições estéreis, se possível.
   1. Coloque estéril 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8,0 solução no gelo. Uma vez gelada, adicione matrigel e colágeno para atingir concentrações de 225 μg/mL e 25 μg/mL, respectivamente. Opcional: para a solução de problemas ou para a visualização do ligante, inclua um ligante cDNAs etiquetado na solução do ligante.
      1. Nota: os ligantes diferentes do ECM podem ser usados com este método. Para diferentes ligantes, pode ser necessária uma otimização adicional para determinar a concentração ideal, o tempo de incubação e a temperatura de incubação. Consulte a seção de discussão para obter mais informações.
   2. Pipeta a solução do ligante na superfície de cada estêncil. Para stencils feitos de 10 x 10 mm quadrados selos, aplique 100 μL por estêncil.
   3. Verifique se há bolhas de ar em recursos de estêncil. Se necessário, use fórceps com ponta fina ou uma ponteira de pipeta de 2 μL para remover as bolhas de ar das feições.
      Nota: este é um passo crítico! Se as bolhas de ar permanecerem presas na superfície da lamínula, o ligante não adsorverá a superfície e o padrão resultante será incompleto.
   4. Coloc os COVERSLIP stenciled com o ligante em um prato, enrole com película do laboratório, e incubar em 4 ° c durante a noite.

5. transferência de ligante para gel de poliacrilamida

1. Removendo a solução de ligante e o estêncil de cada lamínula
   1. Aspirar a solução de ligantes da superfície de um estêncil. A solução de ligand pode ser coletada e armazenada a 4 ° c e reutilizada por até um mês.
   2. Usando o fórceps, submergir momentaneamente o lamela com o estêncil em um prato que contem PBS estéril para lavar.
   3. Submergir momentaneamente o lamela com o estêncil em um segundo prato do PBS estéril para lavar.
   4. Remova o estêncil da superfície da lamínula. Tenha cuidado para não quebrar a lamínula.
   5. Submergir momentaneamente o lamela em um prato que contem a água estéril do ultrapura para remover os sais das lavas de PBS. Bata a borda do lamela a uma tarefa delicada limpe para pavio afastado o excesso de água.
   6. Seque a lamínula um gás inerte, como o nitrogênio. Marque a parte inferior da lamínula para manter o controle da orientação a partir deste ponto para a frente. Tenha cuidado para manter o lado estampado virado para cima.
   7. Repita as etapas 5.1.1 através de 5.1.6 para cada COVERSLIP stenciled.
2. Fazer hidrogéis de poliacrilamida com coberturas estampadas
   Nota: consulte os métodos anteriores para obter mais detalhes^7,9 esterilizar todos os suportes de tampa, tubos, e espaçadores utilizados para fazer géis de poliacrilamida por lavagem com 10% lixívia durante a noite, enxaguar com água pelo menos cinco vezes para remover lixívia, e lavar brevemente em 70% etanol. Coloc todas as partes em limpezas delicadas da tarefa em um armário estéril do biossegurança para secar antes de usar.
   1. Prepare a solução de poliacrilamida para obter a elasticidade do hidrogel desejada (tabela 2). Misture todos os componentes, exceto as microesferas fluorescentes e o persulfato de potássio (PPS).
      Nota: Prepare 1% de solução de persulfato de potássio fresca cada vez.
   2. Degas a solução de poliacrilamida, microesferas e PPS em tubos separados vácuo por 30 min.
   3. Para cada lamínula estampada, prepare uma lamínula de "fundo" ativada por glutaraldeído com um espaçador (diâmetro externo de 18 mm, diâmetro interno de 14 mm) colocado na parte superior.
   4. Após a desgaseificação, rapidamente proceda microesferas e adicionar o volume apropriado para a solução de poliacrilamida. Misture com pipetagem para cima e para baixo, tendo cuidado para não introduzir bolhas de ar. Brevemente SONICATE.
   5. Adicione o volume adequado de PPS à solução de poliacrilamida. Pipeta para cima e para baixo para misturar a solução, tendo o cuidado de não introduzir bolhas de ar.
      Nota: após ter adicionado o PPS, trabalhe ràpida para terminar etapas 5.2.6 com 5.2.11 antes que o poliacrilamida polimerize.
   6. Pipetar 75-150 μL (dependendo da espessura do espaçador) para o centro de cada lamínula ativada por glutaraldeído.
   7. Usando fórceps, coloc um lamela modelado em cada lamela glutaraldehyde-ativado com poliacrilamida e espaçador, tais que o ligante modelado enfrenta a solução do poliacrilamida. Se a solução de poliacrilamida suficiente foi adicionada, a tensão superficial vai pavio a poliacrilamida entre as duas coberturas e não bolhas de ar estarão presentes.
   8. Pick up cada poliacrilamida "sanduíche" e cuidadosamente tocar o lado a uma tarefa delicada Limpe a pavio afastado excesso de solução de poliacrilamida.
   9. Coloc com cuidado cada "sanduíche" do poliacrilamida em um suporte do tampão com as linhas que são compatíveis com os tubos cónicos-inferiores de 15 ml. A orientação deve ser tal que a parte inferior da lamínula de glutaraldeído esteja em contacto com a parte inferior do suporte do tampão, e a lamínula estampada esteja no topo.
   10. Aparafuse um tubo de fundo cônico de 15 mL em cada suporte de tampa para segurar a poliacrilamida "sanduíches" no lugar. Os tubos devem ser apertados para evitar vazamento, mas tenha cuidado para não apertar demais e quebrar as lamínulas.
   11. Centrifugue os "sanduíches" do poliacrilamida nos tubos em balanç-baldes em 200 x g por 10 minutos na temperatura ambiente. Retire os tubos da centrífuga e coloque em racks de tubos para manter a orientação para um adicional de 50 min para garantir a polimerização completa. Mantenha coberto com a folha para impedir o branqueamento de microesferas fluorescentes.
       Nota: a centrifugação é crítica ao usar este método para executar o TFM. A força centrífuga move todas as microesferas para um único plano, que acabará por ser logo abaixo da superfície do hidrogel. Isto é ideal para os deslocamentos da microesfera da imagem latente que são usados para calcular tensões pilha-geradas da tração. Se não estiver realizando TFM, microesferas podem ser deixadas de fora da solução de poliacrilamida e a polimerização pode ocorrer no de bancada sem centrifugação.
   12. Remover poliacrilamida polimerizada "sanduíches" dos tubos e submergir em PBS em um prato de 100 mm. Enrole em filme de laboratório e incubar por 3 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° c.
3. Preparação de géis estampados para células de semeadura
   1. Use um bisturi e fórceps para remover cuidadosamente a lamínula estampada e o espaçador do "sanduíche" de poliacrilamida enquanto ele permanece submerso em PBS. O ligante estampado terá sido transferido para a poliacrilamida durante a polimerização e permanecerá após a remoção da lamínula. O gel do poliacrilamida permanecerá Unido ao COVERSLIP glutaraldehyde-ativado.
      Nota: este é um passo crítico! O poliacrilamida deve ser submergido em PBS ao remover o lamela ou os testes padrões do ligante serão destruídos.
   2. Coloque cada lamínula com poliacrilamida estampada em um suporte de tampa. Coloque uma junta (diâmetro externo de 18 mm, diâmetro interno de 14 mm) em cima da lamínula e em torno da poliacrilamida, onde o espaçador foi localizado. Aparafuse um tubo de fundo cônico de 15 mm no suporte da tampa, formando um poço com a poliacrilamida padronizada na parte inferior. Esses conjuntos se encaixam nos poços de uma placa padrão de 12 poços para fácil manuseio.
   3. Lave cada gel adicionando 500 μL de PBS à montagem do poço. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente com agitação suave. Retire o PBS e repita duas vezes para um total de três lavas.
   4. Após a lavagem final de PBS, adicione 500 μL de mídia Knockout-DMEM a géis e incubar a 37 ° c durante a noite. Os géis podem ser mantidos a 37 ° c com mídia por até 5 dias antes da semeadura das células.
   5. O dia antes de semear as células, substitua Knockout-DMEM para a mídia completa KSR e incubar a 37 ° c durante a noite.

6. culturing hESCs em géis modelados

Nota: se planear fixar amostras para a imunocoloração após o TFM, tome imagens de posições não estressadas da microfera antes das pilhas de semeadura. Neste caso, o ligante cDNAs etiquetado deve ser usado na etapa 4.3.1 de modo que as posições eventuais das pilhas sejam conhecidas antes que a semeadura e as microesferas possam ser imaged naquelas regiões.

1. Mantenha culturas de hESC do estoque e culturas alimentador-livres secundárias preparadas em placas matrigel-revestidas em meios condicionados de KSR antes de semear em géis modelados do poliacrilamida como descrito previamente⁹.
   Nota: gere a mídia KSR condicionada, cultivando fibroblastos embrionários do camundongo irradiado em meios KSR suplementados com 4 ng/mL de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Coletar e substituir mídia a cada 24 h.
2. Aspirar a mídia de hESCs. Lave brevemente com a mídia Knockout-DMEM. Adicionar 0, 5% de Trypsin-EDTA suplementado com 10 μM Y27632 (inibidor da quinase de Rho) e incubar a 37 ° c por 5-10 min.
3. Adicionar mídia com soro para inibir a tripsina. Aspirar delicadamente meios e pipeta sobre o prato para remover pilhas. Continue a pipetagem suavemente para remover todas as células e dissociar os clusters de células para uma única célula.
4. Colete a suspensão celular e Centrifugue a 200 x g por 3 min.
5. Aspirar o sobrenadante e ressuscite a pelota em um volume equivalente de mídia KSR para lavar. Centrifugador a 200 x g durante 3 min.
6. Aspirar o sobrenadante e ressuscite o pellet em meio de KSR condicionado suplementado com 10 ng/mL de bFGF e 10 μM Y27632.
7. Conte as células com um hemociômetro e ajuste a suspensão da célula para uma concentração de 300.000 células por mL. Pipete 500 μL da suspensão celular para cada gel modelado (150.000 células por gel).
8. 3 h após a semeadura, use uma pipeta para aspirar cuidadosamente os meios de cada gel e substitua com os meios KSR condicionados frescos suplementados com 10 ng/mL bFGF e 10 μM Y27632. Isso remove as células em excesso que não aderiram às regiões padronizadas da poliacrilamida.
   Nota: este é um passo crítico! Neste estágio as células serão frouxamente aderiram ao ligand padronizado. Tenha muito cuidado ao trocar mídia para não separar as células. A igualdade de cuidados deve ser tomada com cada um dos swaps de mídia nas etapas subsequentes.
9. 24 h após a semeadura, use uma pipeta para aspirar cuidadosamente a mídia e troca por meio de KSR condicionado suplementado com 10 ng/mL bFGF e 5 μM Y27632.
10. 48 h após a semeadura, use uma pipeta para aspirar com cuidado os meios e a troca para meios condicionados de KSR suplementados com 10 ng/mL bFGF. Isto remove o inibidor da quinase de Rho da mídia e experimentos podem começar no dia seguinte, 72 h após a semeadura.

7. realizando TFM

1. Quando desejado, execute TFM como descrito anteriormente⁹ em condições experimentais desejadas.
2. Se as posições de microesfera não estressados foram fotografadas antes da semeadura das células, fixar as células após a tomada de posições de microesfera estressada e realizar imunocoloração para determinar a localização de proteínas de interesse em relação a regiões de forças de tração de alta e baixa.

Resultados

O principal desafio a ser superado na tentativa de cultura de hESCs em colônias de geometria controlada em substratos compatíveis é gerar um padrão homogêneo de ECM-ligand na superfície do substrato. A estratégia apresentada neste método envolve a primeira geração do padrão desejado na superfície de uma lamínula de vidro e, posteriormente, a transferência desse padrão para a superfície de um hidrogel de poliacrilamida durante a polimerização do gel (Figura 1 ...

Discussão

Para simplificar um protocolo longo e detalhado, este método consiste em três estágios críticos: 1) gerando testes padrões do ligante do ECM em COVERSLIP de vidro, 2) transferindo os testes padrões aos hidrogéis do poliacrilamida durante a polimerização do gel, e 3) semeando hESCs no hidrogel modelado. Há etapas críticas que devem ser consideradas em cada uma dessas três etapas. A fim de gerar padrões de alta fidelidade nas coberturas de vidro, o estêncil deve ser firmemente pressionado na lamínula para evitar vazamento ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,05% Tripsina	Gibco	25300054
placa de Petri de vidro de 100 mm	Fisher Scientific	08-747B
Placa de Petri de plástico de 100 mm	Fisher Scientific	FB0875712
Tubos de fundo cônico de 15 mL Placa	de plástico Corning	352095
150 mm Fisher	Scientific	FB0875714
18 mm diâmetro #1 lamínulas	Thermo Scientific	18CIR-1
2% bisacrilamida	Bio-Rad	161-0142
3-aminopropiltrimetoxissilano	ACROS Organics	313251000
40% de acrilamida	Bio-Rad	161-0140
Folha de alumínio	Fisher Scientific	01-213-100
Fator básico de crescimento de fibroblastos	Sigma-Aldrich	F0291
Bleach	Clorox	N/A
Centrífuga com baldes oscilantes	Eppendorf	22623508	Modelo: 5804 R
Dessecador	de 354236
	Corning Fisher Scientific	08-642-7
Etanol	Fisher Scientific	AC615095000
Fetal soro bovino	Gibco	16000044
Microesferas fluorescentes	Thermo Scientific	Fórceps F8821
(para lamínulas)	Fisher Scientific	16-100-122
Fórceps (para wafers)	Fisher Scientific	17-467-328
Suportes de gel	N/A	N/A	Os suportes de gel são impressos em 3D personalizados, desenho CAD disponível mediante solicitação
Glutaraldeído	Fisher Scientific	50-261-94
HEPES	Thermo Scientific	J16926A1
Placa quente	Fisher Scientific	HP88854100
Ácido clorídrico	Fisher Scientific	A144S-500
Álcool isopropílico	Fisher Scientific	A416-500
Kimwipes (lenços de tarefas delicadas)	Kimberly-Clark Professional	34120
Knockout substituição do soro	Gibco	10828028
Knockout-DMEM	Gibco	10829018
alinhador de máscara (para fotolitografia)	Karl Suss America, Inc.	Karl Suss MJB3 Máscara Aligner
Matrigel	Corning	354277
Microscópio para força de tração	Nikon	N/A	Modelo: Eclipse TE200 U
Estágio de posicionamento motorizado	Prior Scientific	N/A	Modelo: HLD117
Gás nitrogênio	Airgas	NI 250
Norland adesivo óptico 74 (polímero curável por UV)	Norland Produtos	NOA 74
Forno	Thermo Scientific	PR305225G
Parafilme (filme de laboratório)	Fisher Scientific	13-374-12
PDMS (Sylgard 184)	Fisher Scientific	NC9285739
	Photomask CAD/Art Services, Inc.	N/A	são feitas sob medida. Desenho CAD para nossos projetos disponíveis mediante solicitação
Limpador de plasma	Fisher Scientific	NC9332171
Plástico para junta	Marian Chicago	HT6135
Plástico para espaçador	TAP Plastics	N/A	Folha de policarbonato, 0,01 polegada de espessura
Cloreto de potássio (para fazer PBS)	Fisher Scientific	P217-500
Fosfato de potássio monobásico (para fazer PBS)	Fisher Scientific	P285-500
Persulfato de Pottassium	ACROS Organics	424185000
Bisturi	Fisher Scientific	14-840-00
Bolacha de silício	Microscopia eletrônica Sciences	71893-06	Tipo P, 3 polegadas, pastilhas de silício
Cloreto de sódio (para fazer PBS)	Fisher Scientific	S271-1
Hidróxido de sódio	Fisher Scientific	S318-100
Fosfato de sódio dibásico di-hidratado (para fazer PBS)	Fisher Scientific	S472-500
SU8-3050	Fotorresistente MicroChem	SU8-3000
SU8-Desenvolvedor	MicroChem	Y020100
TEMED	Bio-Rad	161-0800
Caixa de esterilização UV	Bio-Rad	N / A	Bio-Rad GS Gene Linker Câmara UV
Y27632 (inibidor de Rho quinase)	StemCell Technologies	72304