Caracterização citométrica de fluxo simultâneo de múltiplos tipos de células recuperadas do cérebro do camundongo/medula espinhal através de diferentes métodos de homogeneização

Summary

Apresentamos um método de citometria de fluxo para identificar simultaneamente diferentes tipos de células recuperadas do cérebro do rato ou da medula espinhal. Este método poderia ser explorado para isolar ou caracterizar populações de células puras em doenças neurodegenerativas ou para quantificar a extensão das células que visam a administração in vivo de vetores virais ou nanopartículas.

Abstract

Os recentes avanços nas ciências viral de vetores e nanomateriais abriram caminho para novas abordagens de ponta para investigar ou manipular o sistema nervoso central (SNC). No entanto, uma maior otimização dessas tecnologias se beneficiaria de métodos que permitam a determinação rápida e simplificada da extensão do SNC e da segmentação específica das células sobre a administração de vetores virais ou nanopartículas no corpo. Aqui, apresentamos um protocolo que aproveita as capacidades de alta produtividade e multiplexing da citometria de fluxo para permitir uma quantificação direta de diferentes subtipos celulares isolados do cérebro do rato ou da medula espinhal, ou seja, microglia / macrófagos, linfócitos, astrócitos, oligodendrócitos, neurônios e células endotélias. Aplicamos essa abordagem para destacar diferenças críticas entre dois métodos de homogeneização de tecidos em termos de rendimento celular, viabilidade e composição. Isso poderia instruir o usuário a escolher o melhor método, dependendo do tipo de célula (s) de interesse e da aplicação específica. Este método não é adequado para análise da distribuição anatômica, uma vez que o tecido é homogeneizado para gerar uma suspensão unicelular. No entanto, ele permite trabalhar com células viáveis e pode ser combinado com a classificação celular, abrindo o caminho para várias aplicações que poderiam expandir o repertório de ferramentas nas mãos do neurocientista, que vão desde o estabelecimento de culturas primárias derivadas de populações de células puras, a análises de expressão gênica e ensaios bioquímicos ou funcionais sobre subtipos celulares bem definidos no contexto de doenças neurodegenerativas, sobre o tratamento farmacológico ou terapia gênica.

Introduction

Tecnologias de entrega de genes e medicamentos (como vetores virais e nanopartículas) tornaram-se uma ferramenta poderosa que pode ser aplicada para obter melhores insights sobre vias moleculares específicas alteradas em doenças neurodegenerativas e para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas inovadoras^1,2,3. A otimização dessas ferramentas depende da quantificação de: (1) a extensão da penetração no SNC sobre diferentes rotas de administração e (2) direcionamento de populações celulares específicas. Análises histológicas são geralmente aplicadas para visualizar genes d....

Protocol

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Dana Farber Cancer Institute (protocolo número 16-024).

1. Preparação de soluções necessárias para o experimento

1. Prepare a solução de sal equilibrado (HBSS) da 1x Hank diluindo 10x HBSS com água estéril. Pré-chill a solução no gelo. Pelo menos 25 mL de solução são necessários para cada amostra.
2. Prepare a solução isotônica percoll (IPS) misturando 10x estéril HBSS 1:10 com gradiente médio de densidade (ou seja, Percoll). Pré-frio no gelo.
   NOTA: Ips pode ser armazenado por até 30 dias a 4 °C.
3. Prepare a s....

Results

Comparamos dois métodos diferentes de homogeneização (DH versus DP) aplicados ao cérebro do camundongo e à medula espinhal, para testar a eficiência na recuperação de diferentes tipos de células viáveis adequados para aplicações a jusante. Para isso, exploramos um painel de citometria de fluxo de 9 cores projetado para caracterizar, na mesma amostra, diferentes tipos de células do SNC, incluindo microglia, linfócitos, neurônios, astrócitos, oligodendrócitos e endotélio.

Os tecidos do cérebro e.......

Discussion

Aqui descrevemos um protocolo para a co-purificação e análise citométrica de fluxo simultâneo de algumas das células CNS mais relevantes do cérebro do rato e da medula espinhal. Tradicionalmente, análises histológicas têm sido aplicadas para descrever a distribuição de nanopartículas ou a eficiência de transdução de vetores virais no SNC^5,13,ou para fornecer insights sobre as alterações morfológicas e moleculares que ocorrem em tipos específicos de células durant.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (sem cálcio, cloreto de magnésio e sulfato de magnésio	Gibco	14185-052
Filtro de células de 70 mm	Corning	431751
anticorpo anti-camundongo ACSA / ACSA2	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC conjugado
com albumina de soro bovino	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b anticorpo	anti-camundongoInvitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 anticorpo
anti-camundongo de rato CD31	BD Bioscience	562939	BV421 anticorpo
anti-camundongo de rato CD45	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 anticorpo
anti-camundongo conjugado CD90.1 / Thy1.1	Biolegend	202518	PE / Cy7
anticorpo anti-camundongo de rato conjugado CD90.2 / Thy1.2	Tubos	Biolegend 1005325	PE/Cy7
(15 mL)	CellTreat	229411
tubos cônicos (50 mL)	Conjunto de	de tecido CellTreat 229422
Dounce (inclui almofariz e pilões A e B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Bloco de anticorpo anti-rato de rato	BD Pharmingen	553142
Kit de	Referência	100-106
(P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 anticorpo de camundongo/rato/humano	Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotina conjugada
Percoll	GE Healthcare 10266569		vendida como reagente não estéril
Percoll	Sigma	65455529	reagente estéril (para ser usado em aplicações que requerem esterilidade)
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	reagente contendo traços muito baixos de endotoxina
Streptavidin	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 conjugado