O modelo de bexiga livre de detrusor permite o acesso direto ao suburotelio para estudar os mecanismos locais de regulação da disponibilidade de mediadores biologicamente ativos na propria suburotelio/laminado durante o armazenamento e a anulação da urina. A preparação assemelha-se pròxima ao enchimento de uma bexiga intata e permite que os estudos do pressão-volume sejam executados sem influências sistemáticas.
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Artigo de método
Modelo de bexiga de urina de urina descentralizada (Ex Vivo) com o músculo destrusor removido para acesso direto ao suburotelio durante o enchimento da bexiga
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estudos anteriores estabeleceram a liberação de substâncias químicas de folhas de mucosa de bexiga plana afixadas nas câmaras de Ussing e expostas a mudanças na pressão hidrostática ou alongamento mecânico e de células urotelia cultivadas após alterações de pressão hidrostática, alongamento, inchaço celular ou forças de arrasto, e em lúmen da bexiga no final do enchimento. Tais achados levaram à suposição de que esses mediadores também são liberados em suburotelio (SubU)/lamina propria (LP) durante o enchimento da bexiga, onde afetam as células profundas na parede da bexiga para, em última análise, regular a excitabilidade da bexiga. Há pelo menos duas limitações óbvias em tais estudos: 1) nenhuma dessas abordagens fornece informações diretas sobre a presença de mediadores em SubU/LP, e 2) os estímulos utilizados não são fisiológicos e não recapitulam o preenchimento autêntico da bexiga. Aqui, discutimos um procedimento que permite o acesso direto à superfície suburotelial da mucosa da bexiga no decorrer do enchimento da bexiga. A preparação livre de intrusão de urina que criamos se assemelha ao enchimento da bexiga intacta e permite que estudos de volume de pressão sejam realizados na bexiga na ausência de sinalização confusa de reflexos espinhais e músculos suaves destruor. Usando o modelo de bexiga livre de detrusor, demonstramos recentemente que medições intravesivas de mediadores não podem ser usadas como um proxy para o que foi lançado ou presente no SubU/LP durante o enchimento da bexiga. O modelo permite o exame de moléculas de sinalização derivadas de urotelium que são liberadas, geradas pelo metabolismo e/ou transportadas para o SubU/LP durante o recheio da bexiga para transmitir informações aos neurônios e músculos lisos da bexiga e regular sua excitabilidade durante continência e micturição.
Introdução
O objetivo deste modelo é permitir o acesso direto ao lado submucosato da mucosa da bexiga durante diferentes fases do enchimento da bexiga.
A bexiga deve abster-se de contração prematura durante o enchimento e vazio quando o volume crítico e a pressão são alcançados. Continência anormal ou voiding da urina são freqüentemente associados com excitabilidade anormal do músculo liso detrusor (DSM) no curso do enchimento da bexiga. Excitabilidade do DSM é determinada por fatores intrínsecos às células musculares lisas e por influências geradas por diferentes tipos de células dentro da parede da bexiga. A parede da bexiga urinária consiste em urotelio (mucosa), suburotelio (SubU)/lamina propria (LP), músculo suave detrusor (DSM) e serosa (Figura 1A). O urotelio consiste em células guarda-chuva (ou seja, a camada mais externa do urotelio), células intermediárias e células basais (ou seja, a camada mais interna do urotelio). Vários tipos de células, incluindo células intersticiais, fibroblastos, terminais nervosos aferentes, pequenos vasos sanguíneos e células imunes residem no SubU/LP. É amplamente assumido que o urotelio da bexiga é um órgão sensorial que inicia mictura e continência reflexa, liberando mediadores na submucosa que afetam as células do SubU/ LP e do DSM1,2,3. Para a maior parte, tais pressupostos são baseados em estudos que demonstraram liberação de mediadores: a partir de pedaços de mucosa expostos a mudanças na pressão hidrostática4,5; de células uroteliais cultivadas expostas ao trecho6,7,célulainduzida pela hipotonicidade inchando7 ou forças de arrasto8; de tiras de parede da bexiga isoladas sobre receptor ou ativação nervosa9,10,11,12,13,14; e na bexiga lúmen no final da bexiga enchimento15,16,17,18,19. Embora tais estudos foram fundamentais para demonstrar a liberação de mediadores sobre a estimulação mecânica de segmentos da parede da bexiga ou células uroteliais cultivadas, eles precisam ser apoiados por evidências diretas para a liberação de mediadores na submucosa que é eliciada por estímulos fisiológicos que reproduzem o enchimento da bexiga. Esta é uma tarefa desafiadora, dado que o SubU / LP está localizado no fundo da parede da bexiga dificultando o acesso direto à vizinhança de SubU / LP durante o enchimento da bexiga.
Aqui, ilustramos um modelo descentralizado (ex vivo) da bexiga da urina com o músculo detrusor removido13 que foi desenvolvido para facilitar estudos nos mecanismos locais do mechanotransduction que participam na sinalização entre o urothelium da bexiga, dSM e outros tipos da pilha na parede da bexiga. Esta abordagem é superior ao uso de folhas de parede da bexiga plana, tiras de parede da bexiga ou células uroteliais cultivadas porque permite medições diretas nas proximidades de SubU/LP de mediadores derivados de urotelium que são liberados ou formados em resposta a pressões fisiológicas e volumes na bexiga e evita possíveis mudanças fenotípicas na cultura celular. Ele pode ser usado para medir a disponibilidade, liberação, metabolismo e transporte transurotelial de mediadores em SubU/LP em diferentes estágios de enchimento da bexiga (Figura 1B). A preparação também pode ser usada para examinar a sinalização urotelial e mechanotransdução em modelos de síndromes da bexiga hiperativa e subativa.
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Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo animais descritos neste manuscrito foram realizados de acordo com o National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e o Institutional Animal Use and Care Committee da Universidade de Nevada.
NOTA:O modelo aqui apresentado consiste na remoção do músculo detrusor, enquanto o urotelio e SubU/LP permanecem intactos(Figura 1B)para permitir aos investigadores o acesso direto ao SubU/LP no decorrer do enchimento da bexiga.
1. Dissecação da Preparação da Bexiga Livre de Detrusor
- Coloque a bexiga isolada em um prato de dissecação cheio de frio (10 °C) e oxigenado com 5% co2/95 % O2 Krebs bicarbonato solução (KBS) com a seguinte composição (mM): 118,5 NaCl, 4.2 KCl, 1.2 MgCl2,23.8 NaHCO3,1.2 KH2PO4,11.0 dextrose, 1.8 CaCl2 (pH 7.4)13.
- Pine uma pequena parte da cúpula da bexiga isolada para um prato de dissecação coberto de Sylgard preenchido com KBS. Certifique-se de que o pino passa por um pedaço da serosa ou a borda mais externa do músculo detrusor longe da borda mais interna do músculo que enfrenta o SubU / LP.
- Usando um microscópio, identifique a uretra e os ureteres e fixe cada um deles à parte inferior do prato de dissecação.
- Retire o excesso de tecidos adiposos e conjuntivos para que todo o corpo principal da bexiga, a uretra e ambos os ureteres sejam exibidos.
- Amarre os ureteres com suturas de nylon 6-0. Em seguida, fixar as extremidades abertas de ureters para o fundo do prato de dissecação para garantir a preparação.
- Usando fórceps de ponta fina, puxe suavemente um pedaço da serosa no canto entre o ureter e o corpo da bexiga.
- Ajuste a luz do microscópio para aumentar a transparência e distinguir a margem da submucosa o músculo detrusor.
- Comece a cortar(não descascar!) a parede da bexiga com tesoura de ponta fina ao longo da superfície interna da camada muscular detrusor, enquanto suavemente puxando o segmento de corte longe da preparação. Em todos os momentos, garantir que a borda lateral da mucosa pode ser visto e evitar tocá-lo.
- Retire o músculo detrusor inteiramente, virando o prato de dissecação para que a posição da preparação é confortável para continuar dissecando o músculo detrusor.
- Deixe um pequeno pedaço de músculo detrusor no topo da cúpula da bexiga para garantir a capacidade de imobilizar a preparação durante as etapas restantes do protocolo.
- Faça um laço duplo de 6-0 fio de nylon, colocá-lo em torno do pescoço da preparação da bexiga, e deixar o laço solto.
- Adicione um segundo laço duplo de 6-0 fio de seda, colocá-lo em torno do pescoço da preparação da bexiga, e deixar o laço perder. Ter duas suturas impede vazamentos em torno das suturas.
- Corte cerca de 2 cm de tubos de 20 PE (cateter), incendiar a ponta, movendo-se lentamente a ponta perto de uma chama.
- Encha o cateter com KBS oxigenado quente (37°C).
- Insira o cateter no orifício da uretra da bexiga e empurre suavemente o cateter até que a ponta do cateter atinja aproximadamente o meio da bexiga.
- Amarre a sutura ao redor do cateter e o tecido circundante do pescoço da bexiga.
- Lentamente encher a bexiga com cerca de 50-100 μL de quente (37 °C) KBS oxigenado, levantá-lo brevemente (<10 s) acima da superfície do KBS, e monitorar vazamentos nas suturas e corpo da bexiga.
- Se nenhum vazamento for observado, a preparação está pronta para o experimento. Se um vazamento em torno da sutura é observada, retire a sutura e substituí-lo. Se um vazamento de um buraco no corpo da bexiga é notado, descartar a preparação.
2. Enchimento da preparação da bexiga desnudada
- Perfuse KBS (37 °C) em uma câmara de 3 mL de um prato de órgão regado de água (37 °C) com um fundo Sylgard.
- Ajuste as linhas de oxigênio e sucção.
- Coloque a preparação da bexiga desnudada na câmara.
- Fixe o cateter para o lado da câmara para que a preparação não flutue acima da superfície da solução de perfusão.
- Ligue o cateter da bexiga a uma tubulação PE20 mais longa (linha de infusão) conectada à torneira de três vias usando o mesmo tamanho.
- Certifique-se de que as linhas entre a bomba de infusão, o transdutor de pressão e a bexiga estão abertas.
- Encha a seringa de infusão com KBS fresco, quente (37 °C) e oxigenado.
- Ajuste os parâmetros da bomba: tipo/volume de seringa (ou seja, 1 mL), operação (ou seja, Infusível), fluxo (ou seja, constante) e taxa de fluxo (ou seja, 15 μL/min).
- Pressione o botão Iniciar na bomba de seringa para encher a bexiga.
- Monitore o volume de enchimento e a pressão intravesa durante o enchimento da bexiga.
3. Detecção de mediadores no aspecto SubU/LP da preparação da bexiga desnudada
- Colete alíquotas da solução de banho em tubos de microcentrífuga sem gelo ou inserções de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
- Prepare e processe as amostras de acordo com a aplicação de detecção apropriada. No caso da detecção da disponibilidade de purina, processe as amostras por HPLC com detecção de fluorescência13,18.
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Resultados
A parede da preparação da bexiga livre de detritos e urina está intacta e contém todas as camadas, exceto o DSM e a serosa. Estudos de prova de princípio demonstraram que a parede da bexiga livre de DSM inclui urotelium e SubU/LP, enquanto a tunica muscular e a serosa estão ausentes (Figura 2)13.
O enchimento da bexiga livre de detrusor aproxima-se do enchimento norm...
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Discussão
A bexiga tem duas funções: armazenamento e voiding da urina. O funcionamento normal dessas funções requer sensoriamento mecânico adequado de volume e pressão intralumínio e transdução de sinais através de células na parede da bexiga para regular a excitabilidade muscular detrusora. Acredita-se que a mucosa da bexiga (urotelio) regule a excitabilidade da bexiga, liberando uma variedade de moléculas de sinalização no SubU/LP que afetam vários tipos de células na parede da bexiga. Atualmente, a maioria das tentativas de car...
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Divulgações
Partes deste trabalho foram publicadas anteriormente no Journal of Physiology (PMCID: PMC6418748; DOI:10.1113/JP27692413). A permissão foi concedida pela Wiley and Sons, Inc. para o uso de materiais desta publicação. Os autores não têm conflitos financeiros ou outros para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais Grant DK41315.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| CaCl2 | Fisher | C79 | Fonte flexível |
| Dextrose | Fisher | D16 | Fonte flexível |
| Pinos de dissecação | Fine Science Tools | 26002-20 | Fonte flexível |
| Kent Scientific | GenieTouch | Fonte flexível | |
| KCl | Fisher | P217 | Fonte flexível |
| KH2PO4 | Fisher | P284 | Fonte flexível |
| Fonte de luz | SCHOTT ACEI | Fonte flexível | |
| Microscópio | Olympus SZX7 | Flexível para usar qualquer escopo | |
| MgCl2 | Fisher | M33 | Fonte flexível |
| NaCl | Fisher | S671 | Fonte flexível |
| NaHCO3 | Fisher | S233 | Fonte flexível |
| Agulhas 25G | Becton Dickinson | 305122 | Fonte flexível |
| Banho de órgão | Feito sob medida | Fonte flexível; Nós o fizemos a partir de Radnoti prato de dissecação | |
| PE-20 tubulação | Intramedic | 427405 | Fonte flexível |
| Transdutor de pressão | AD instrumento | Fonte flexível | |
| S & T Fórceps | Fine Science Tools | 00632-11 | Fonte flexível |
| Software pressão-volume | AD Instruments | Power lab | |
| Sutura Nylon, 6-0 | AD cirúrgico | S-N618R13 | Source flexível |
| Sutura Seda, 6-0 | Deknatel via Braintree Scientific, Inc. | 07J1500190 | Fonte seringas flexíveis |
| 1 mL | Becton Dickinson | 309602 | Fonte flexível |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Fonte flexível |
| Circulador de água | Baxter | K-MOD 100 | Fonte flexível |
Referências
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72, 1057-1064 (2007).
- Fry, C. H., Vahabi, B. The Role of the Mucosa in Normal and Abnormal Bladder Function. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. , 57-62 (2016).
- Merrill, L., Gonzalez, E. J., Girard, B. M., Vizzard, M. A. Receptors, channels, and signalling in the urothelial sensory system in the bladder. Nature Reviewes Urology. 13, 193-204 (2016).
- Ferguson, D. R., Kennedy, I., Burton, T. J. ATP is released from rabbit urinary bladder epithelial cells by hydrostatic pressure changes--a possible sensory mechanism? Journal of Physiology. 505, 503-511 (1997).
- Wang, E. C., et al. ATP and purinergic receptor-dependent membrane traffic in bladder umbrella cells. Journal of Clinical Investigation. 115, 2412-2422 (2005).
- Miyamoto, T., et al. Functional role for Piezo1 in stretch-evoked Ca(2)(+) influx and ATP release in urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 289, 16565-16575 (2014).
- Mochizuki, T., et al. The TRPV4 cation channel mediates stretch-evoked Ca2+ influx and ATP release in primary urothelial cell cultures. Journal of Biological Chemistry. 284, 21257-21264 (2009).
- McLatchie, L. M., Fry, C. H. ATP release from freshly isolated guinea-pig bladder urothelial cells: a quantification and study of the mechanisms involved. BJU International. 115, 987-993 (2015).
- Birder, L. A., Apodaca, G., de Groat, W. C., Kanai, A. J. Adrenergic- and capsaicin-evoked nitric oxide release from urothelium and afferent nerves in urinary bladder. American Journal of Physiology Renal Physiology. 275, F226-F229 (1998).
- Birder, L. A., Kanai, A. J., de Groat, W. C. DMSO: effect on bladder afferent neurons and nitric oxide release. Journal of Urology. 158, 1989-1995 (1997).
- Birder, L. A., et al. Vanilloid receptor expression suggests a sensory role for urinary bladder epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 98, 13396-13401 (2001).
- Birder, L. A., et al. Beta-adrenoceptor agonists stimulate endothelial nitric oxide synthase in rat urinary bladder urothelial cells. Journal of Neuroscience. 22, 8063-8070 (2002).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. Journal of Physiology. 597, 1467-1485 (2019).
- Yoshida, M., et al. Non-neuronal cholinergic system in human bladder urothelium. Urology. 67, 425-430 (2006).
- Beckel, J. M., et al. Pannexin 1 channels mediate the release of ATP into the lumen of the rat urinary bladder. Journal of Physiology. 593, 1857-1871 (2015).
- Collins, V. M., et al. OnabotulinumtoxinA significantly attenuates bladder afferent nerve firing and inhibits ATP release from the urothelium. BJU International. 112, 1018-1026 (2013).
- Daly, D. M., Nocchi, L., Liaskos, M., McKay, N. G., Chapple, C., Grundy, D. Age-related changes in afferent pathways and urothelial function in the male mouse bladder. Journal of Physiology. 592, 537-549 (2014).
- Durnin, L., Hayoz, S., Corrigan, R. D., Yanez, A., Koh, S. D., Mutafova-Yambolieva, V. N. Urothelial purine release during filling of murine and primate bladders. American Journal of Physiology Renal Physiology. 311, F708-F716 (2016).
- Gonzalez, E. J., Heppner, T. J., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Purinergic signalling underlies transforming growth factor-beta-mediated bladder afferent nerve hyperexcitability. Journal of Physiology. 594, 3575-3588 (2016).
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