Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um sistema implantável para registro cronológico in vivo de potenciais eletromiográficos evocados e espontâneos. O sistema é aplicado à investigação da reinervação dos músculos laríngeos após lesão nervosa.
A eletromiografia (EMG) mede a resposta muscular à estimulação elétrica ou atividade espontânea das unidades motoras e desempenha um papel importante na avaliação da função neuromuscular. O registro crônico da atividade emg refletindo o estado de reinervação do músculo após lesão nervosa foi limitado, devido à natureza invasiva das técnicas tradicionais de gravação de EMG. Nesse sentido, um sistema implantável é projetado para gravação de EMG in vivo a longo prazo e estimulação nervosa. Foi aplicado e testado em um estudo sobre reinervação de músculos laríngeos. Este sistema consiste em 1) duas algemas nervosas de eletrodos bipolares e leva para estimular cada um dos dois nervos: o nervo laríngeo recorrente (RLN) e o ramo interno do nervo laríngeo superior (SLN); 2) dois eletrodos de gravação emg e condutores para cada um dos dois músculos laríngeos: músculo cricoarytenoide posterior (PCA) e complexo muscular de cricotenoide-lateral-tricoienoide (TA-LCA); e 3) um recipiente de pele que interentro todos os terminais de chumbo implantados a um pré-amplificador e estimulador de gravação externa usando um cabo de conexão. Os cabos são revestidos de Teflon, multifilamento, tipo 316 de aço inoxidável. Eles são enrolados e podem esticar durante o movimento corporal do animal acordado para evitar a quebra do chumbo e a migração de eletrodos. Este sistema é implantado durante uma cirurgia asséptica. Posteriormente, as gravações de EMG de linha de base são realizadas antes que o RLN seja transecido na segunda cirurgia para estudar a reinervação muscular. Ao longo do estudo, várias sessões fisiológicas são realizadas no animal anestesiado para obter atividade EMG evocada e espontânea que reflete o estado de reinervação dos músculos laríngeos. O sistema é compacto, livre de infecções ao longo do estudo, e altamente durável. Este sistema implantável pode fornecer uma plataforma confiável para pesquisas nas quais o registro de longo prazo ou a estimulação nervosa são necessários em um animal anestesiado ou livremente em movimento.
O registro emg é uma técnica útil para medir a atividade elétrica produzida por um músculo esquelético quando ativado por estimulação elétrica de seu nervo ou disparo espontâneo de suas unidades motoras. O monitoramento de sinais EMG pode ser utilizado para avaliação da transmissão neuromuscular e da biomecânica muscular1. A gravação emg também desempenha um papel importante na caracterização da qualidade e magnitude da reinervação muscular após lesão nervosa2,3,4,5. No entanto, várias gravações emg durante todo o período de reinervação não podem ser alcançadas por uma abordagem invasiva. Portanto, os dispositivos implantáveis foram projetados e desenvolvidos para estimulação e gravação repetidas e crônicas em sistemas neuromusculares66,77,8,,9,,10,,11,,12,,13. O objetivo deste artigo é descrever um protocolo para a fabricação e implantação de um sistema estável para a obtenção de dados EMG cronológicos confiáveis da laringe.
Este sistema é aplicado aqui ao estudo da reinervação muscular laríngea. Uma breve visão geral da laringe é fornecida para orientação (Figura 1). Uma coordenação precisa entre componentes sensoriais e motores é essencial para o movimento muscular adequado durante a respiração, a voz e a proteção das vias aéreas. O músculo PCA, localizado na laringe posterior, é o único sequestrador da dobra vocal. Este músculo é ativado espontaneamente durante a inspiração para aumentar a área glotal para inalação. O complexo TA-LCA é o principal adutor da dobra vocal. Ativação deste complexo muscular juntamente com outro adutor (ou seja, o músculo interarytenoide) medializam a dobra para vibração e produção de som e fecham a dobra para proteção das vias aéreas durante a deglutição.
Além disso, as fibras dos neurônios motores inervam os músculos abdutores e adutores no RLN. Os músculos abdutor e adutor podem ser distinguidos com base na composição da unidademotora 14,15. O músculo PCA apresenta aumento do disparo durante as condições hipercapnicas e/ou hipóxica16 devido à presença de unidades motoras inspiratórias. Em contrapartida, as unidades motoras de fechamento glotático reflexo (RGC), que fecham a glote reflexivamente através da ativação de receptores sensoriais dentro da mucosa laríngea, estão presentes no complexo muscular TA-LCA. O ramo interno do nervo laríngeo superior (SLN) carrega as fibras aferentes dos receptores sensoriais na laringe17. Embora a voz seja principalmente uma função adutora, tanto as unidades de motor abdutor quanto adutora estão envolvidas neste comportamento laríngeo altamente evoluído.
Figura 1: Anatomia da laringe. Os componentes deste sistema implantável também são exibidos. SLN = nervo laríngeo superior; RLN = nervo laríngeo recorrente; PCA = músculo cricoarytenoide posterior; TA-LCA = complexo muscular de trítesioide-lateral cricoarytenoide; DBS = estimulação cerebral profunda. Este número foi reproduzido com permissão de Wiley27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A lesão no RLN pode resultar em paralisia da dobra vocal (VFP), o que compromete tanto as funções de abdução quanto a adutora devido à denervação do músculo laríngeo14,,18,19. Posteriormente, ocorre a regeneração das fibras nervosas rln e a reinervação dos músculos. No entanto, a reinervação é um processo aleatório e resulta em reconexão muscular inadequada e mal direcionada na maioria dos casos. Isto é referido como sincinese, na qual a ativação espontânea de antagonistas abdutores e adutores é defeituosa e produz movimento ineficaz ou mesmo paradoxal das dobras vocais14,,19,20,21. Com a sincinese, a função crítica que se perde é o sequestro da dobra vocal, resultando em ventilação inadequada. Embora existam tentativas contínuas de tratar a sinese laríngea por qualquer um dos 1) bloqueio do fechamento glotésico com Botox22,23 ou 2) estimulando eletricamente a abertura glotética com um marca-passo implantável24,25, não há intervenção clínica que previne de forma confiável a sincinese26. No entanto, há evidências de que o condicionamento elétrico do músculo PCA durante a reinervação em baixa frequência promove a reconexão neuromuscular adequada e minimiza a sincinese de acontecer. Estudos estão sendo conduzidos para elucidar os mecanismos subjacentes2.
O foco deste artigo é descrever um sistema implantável simples e barato para estimulação nervosa crônica e gravação de EMG. Este sistema pode ser usado para investigar os efeitos do condicionamento elétrico de baixa frequência do músculo PCA sobre a especificidade de sua reinervação subseqüente. Os sinais EMG obtidos por este sistema podem refletir a qualidade e a quantidade de reinervação muscular laríngea ao longo do tempo.
Este artigo descreve os passos necessários na fabricação de um novo sistema econômico e implantável para estimulação de nervos laríngeos e registro de respostas emg de músculos laríngeos a longo prazo. O protocolo é descomplicado e pode produzir um implante que é compacto o suficiente para ser utilizado em um animal tão pequeno quanto um rato. Existem várias etapas críticas que devem ser enfatizadas. Primeiro, os fios de chumbo devem ser enrolados com cuidado e uniformemente para evitar o desinlserção de chumbo, torção ou quebra. Se uma máquina de enrolamento não estiver disponível, os cabos enrolados pré-fabricados podem ser obtidos comercialmente. Em segundo lugar, a estratégia de inserir fios de chumbo em um tubo de silicone para formar um “V” que atravessa o nervo é fundamental para promover a entrega da corrente através do nervo dentro da braçadeira. Se ambos os cabos forem colocados no mesmo lado do tubo, pode ocorrer desvio de corrente entre eletrodos. Também é importante que as pistas estejam posicionadas contra a parede interna do tubo para evitar a possibilidade de lesão de fatia no nervo.
Em terceiro lugar, durante a cirurgia de implantação, os nervos laríngeos devem ser dissecados cuidadosamente para evitar danos. Na fase posterior da implantação, ao inserir pinos no recipiente, deve-se aplicar força ao pino em alinhamento ao seu orifício para evitar a dobra súbita da cabeça do pino. Posteriormente, o cimento ósseo deve ser distribuído minuciosamente no fundo do recipiente para isolamento completo e prevenção de crosstalk entre os canais. Por fim, a prevenção da infecção é fundamental para garantir a integridade do sistema de implanteao longo do tempo. Pode ser alcançado por uma combinação de várias manobras: adição de uma saia ao recipiente, administração de antibióticos, limpeza diária da ferida e recipiente com solução antisséptica compatível com tecido, e colocação de pinos masculinos manequim nos pinos femininos do recipiente para mantê-los limpos de detritos entre as sessões.
O protocolo foi comprovado como bem sucedido neste modelo laríngeo de cachorro. No entanto, algumas modificações ou estratégias alternativas podem ser consideradas para outras aplicações. Por exemplo, as pontas de sensoriamento desisoladas dos eletrodos EMG PCA e TA-LCA são ancoradas nos músculos por um meio externo – seja o enxerto de poliéster ou o eletrodo DBS. Em uma aplicação em que a ancoragem externa não é necessária ou realizada, a farpa do eletrodo por si só pode servir como âncora. Nesse caso, o fio de aço inoxidável revestido de Teflon pode ser preferível ao fio multifilamento, tendo em vista sua maior resistência à tração, proporcionando uma barb que é mais estável no tecido. No entanto, deve-se notar que os fios multifilamentos podem ser menos propensos à quebra. Uma estratégia alternativa para a fabricação e montagem do recipiente de pele é a impressão 3D usando polímeros biocompatíveis (por exemplo, MED610 da Stratasys). Isso pode simplificar o processo de fabricação.
Após a cirurgia de implantação e recuperação do animal, são realizadas sessões fisiológicas com as RLNs ainda intactas para obter dados de linha de base. Durante uma sessão, a ausência de sinais EMG de um músculo laríngeo pode ocorrer após a estimulação rln. Para solucionar problemas da causa(Tabela 1),deve-se primeiro determinar se o movimento da dobra vocal está presente. Se ele estiver presente, isso significa que o nervo é efetivamente ativado pela braçadeira, mas há um problema com o chumbo EMG. Nesta situação, os usuários devem olhar melhor para o artefato de estímulo EMG. Se o artefato EMG estiver ausente, provavelmente haverá uma descontinuidade na entrada EMG para o pré-amplificador. O ruído de sessenta ciclos também estará presente e grande em amplitude. Se o artefato for grande, desviar de um pino de estímulo para o pino de gravação pode ser responsável por saturar o pré-amplificador do canal e obliterar a resposta do EMG. Se o artefato estiver normal, então o chumbo EMG provavelmente se deslocou do músculo e não pode detectar sua atividade. Por outro lado, se o movimento da dobra vocal está ausente, então o nervo não está sendo ativado. Se o artefato estiver ausente, pode haver uma descontinuidade no circuito de estimulação, impedindo a ativação do nervo. Se o artefato parecer normal, o nervo pode ter sido ferido durante a cirurgia de implante ou o manguito pode ter migrado para fora do nervo. Uma estratégia semelhante pode ser aplicada para solucionar problemas da causa de sinais EMG ausentes durante a estimulação SLN.
Nervo estimulado | Músculo saudoso | Movimento da dobra vocal ipsilateral | Artefato de estímulo | Causas |
RLN | PCA e/ou TA-LCA | Sim | Ausente (ruído de 60 ciclos presente) | Descontinuidade na entrada EMG ao pré-amplificador (por exemplo, chumbo, pino, cabo); |
Grande | Conversa cruzada entre stim e pinos de gravação no recipiente | |||
Normal | Deslocamento do eletrodo EMG | |||
Não | Ausente | Descontinuidade no circuito de estimulação | ||
Normal | 1. Lesão RLN; 2. Luxação da braçadeira | |||
Sln | TA-LCA | Sim | Ausente (ruído de 60 ciclos presente) | Descontinuidade na entrada EMG ao pré-amplificador (por exemplo, chumbo, pino, cabo); |
Grande | Conversa cruzada entre stim e pinos de gravação no recipiente | |||
Normal | Deslocamento do eletrodo EMG | |||
Não | Ausente | Descontinuidade no circuito de estimulação | ||
Normal | 1. Lesão SLN ou RLN; 2. Luxação da braçadeira |
Tabela 1: Guia de solução de problemas.
Deve-se mencionar que existem duas pequenas limitações na aplicação atual desta tecnologia. Primeiro, a dobra súbita do pino feminino durante a inserção no recipiente ocorreu em vários casos. Felizmente, os pinos podem ser endireitados e inseridos em seus orifícios com sucesso. Se o dano do pino for irreparável, o chumbo e todo o seu componente precisam ser substituídos. Portanto, os componentes de backup devem estar prontamente disponíveis antes da cirurgia. Em segundo lugar, o tempo necessário para completar a implantação cirúrgica é longo (~10 h). A longa duração reflete parcialmente o grande número de componentes de estimulação e recodificação necessários para este estudo: quatro nervos, quatro músculos, um recipiente e um IPG. Se forem necessários menos componentes usando esta tecnologia, o tempo de implantação deve ser significativamente reduzido (por exemplo, o modelo de língua de rato28).
Essa abordagem tecnológica introduz vários recursos que têm vantagem sobre os métodos existentes. O entalo dos fios de chumbo é a característica mais nova e importante deste sistema. Os condutores enrolados não são comumente disponíveis para experimentação animal não comercial, apesar dos muitos benefícios que proporcionam. Um chumbo enrolado pode ser expandido para o comprimento desejado durante a implantação. Além disso, ele se esticará na hora acordada, movendo o animal para evitar a luxação da ponta do eletrodo ou quebra do fio após a implantação. Esta característica garante a longevidade do implante e estimulação nervosa estável e registro muscular a longo prazo. Além disso, adicionar uma saia compatível com tecido ao redor do recipiente previne a exposição da ferida a este corpo estranho e promove a fibrose normal e a cicatrização da ferida na ausência de infecção. Estudos anteriores sem essa saia resultaram em infecção precoce e término prematuro do experimento. Por fim, este sistema de implante é compacto e multicanalizado, permitindo a aquisição efetiva de dados de inúmeras estruturas neuromusculares em modelos animais de vários tamanhos.
Esta abordagem técnica foi adaptada e traduzida com sucesso para um modelo de rato. Este estudo foi projetado para investigar o efeito do condicionamento elétrico na prevenção da atrofia muscular da língua e disfunção no rato envelhecido. Os nervos hipoglossais foram implantados com os eletrodos da braçadeira para condicionamento e a língua implantada com os eletrodos de gravação EMG28. Essa tecnologia também pode ser utilizada em outras aplicações de pesquisa. Como uma extensão do protocolo atual na laringe canina, os efeitos do condicionamento elétrico na promoção da reinervação seletiva estão atualmente sendo estudados em músculos faciais de coelho. Este estudo pode fornecer uma base para a prevenção da sincinese facial em pacientes com paralisia de Bell, uma condição médica comum e debilitante. Um uso potencial final desta tecnologia é estimular e registrar a partir de animais acordados e livremente em movimento. Atualmente, tais dados foram obtidos via cabo externo de ratos acordados e sem restrições28. No futuro, esse sistema econômico também pode ser combinado com a tecnologia remota de estimulação de gravação (por exemplo, telemetria) para ativar ou sondar sistemas neuromusculares sem fio.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem ao Dr. Hongmei Wu por sua contribuição para o cuidado com os animais e coleta de dados ao longo do estudo. Agradecemos a Amy Nunnally, Jamie Adcock e Phil Williams pela ajuda com cirurgias estéreis. A experiência e dedicação da equipe do Centro de Cuidados Animais da Universidade vanderbilt foi inestimável. Esta pesquisa foi apoiada pela bolsa NIH U01DC016033.
20 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305175 | |
23 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305145 | |
25 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305125 | |
3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL | Ethicon | J219H | |
3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8684G | |
4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8871H | |
6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene | Ethicon | 8805 | |
7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | M8735 | |
Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98% | ACROS | code 194790100 | for dilution of modical adhesive silicone |
Bone cement | Zimmer | 1102-16 | 20g powder 10ml liquid |
Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1ml) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd | 12496-0757-1 | |
CCD video camera attached to the endoscope | Sony | MCC500MD | |
Cefpodoxime (Simplicef 100mg tablets) | Zoetis | 5228 | |
Data acquisition device , PowerLab 16/35 | ADInstruments, Inc | 5761-E | |
Deep-brain stimulation (DBS) electrodes | Abbott | 6172ANS | |
Digital oscilloscope | Tektronix | DPO71304SX | |
Implantable pulse generator (IPG), Infinity | Abbott | 6660ANS | |
Knitted polyester graft | Meadox Medical Inc | 92220 | 20mm in diameter |
Medical Grade Polyethylene Micro Tubing | Amazon.com | BB31695-PE/13-10 | OD 0.156", ID 0.094" |
Metal female pin | Allied Electronics & Automation | 220-S02-100 | |
Metal male pin | CDM electronics | 220-p02-1 | |
Prefabricated coiled leads | Medical innovations Inc. | ||
Silastic Laboratory Tubing | Cole-Parmer | 2415569 | OD 0.125", ID 0.062" |
Silastic Medical Adhesive Silicone | Dow corning | Type A, 2 oz | |
Stainless steel monofilament wire | The Harris Products Group | type 316 | 0.008" (coated), 0.005" (bare) |
Sterile Disposable Biopsy Punch (4mm) | Sklar Instruments | 96-1146 | |
Strip connector | CDM electronics | 2.6 x 11.6 x 101.5 mm | single row, round, through hole |
Teflon-coated multi-filament stainless steel wire | Medwire | Part 316, ss7/44T | |
Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol – 5mL | Zoetis | 004866 | |
Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan – 1 Gal. | Zoetis | 540561 | |
Zero-degree rigid endoscope | Karl Storz | 8712AA |