Fluorescência de reflexão interna total de alta taxa de transferência e microscopia de reconstrução óptica estocástica direta usando um chip fotônico

Desde a demonstração inicial da microscopia de localização de molécula única, muitas variações foram desenvolvidas para resolver diferentes desafios^1,2,3. Um desafio que permaneceu, no entanto, é o grande campo de visão de imagem dSTORM. Muitas configurações dSTORM usam a mesma lente objetiva para excitar a amostra e imaginá-la. A fim de aumentar o campo de visão, uma lente de baixa ampliação é necessária. As lentes objetivas de baixa ampliação e baixa abertura numérica (NA) geralmente têm uma grande profundidade de campo, resultando em um sinal maior fora do plano que reduzirá a precisão da localização. Os objetivos da TIRF são comumente usados para aumentar o contraste de imagem, reduzindo a fluorescência fora do avião. Através da TIRF, a excitação é limitada a uma espessura óptica de aproximadamente 150 nm da superfície por meio de um campo evanescente⁴. As lentes objetivas da TIRF exigem um grande NA, resultando em um pequeno campo de visão (FOV) (por exemplo, 50 x 50 μm^2),o que limita significativamente a taxa de produção. Há, no entanto, maneiras alternativas de gerar um campo evanescente.

Um guia óptico de onda é uma estrutura que irá confinar e guiar a luz se for acoplado à estrutura. Mais comumente, guias de onda são usados em telecomunicações à base de fibra. Grande esforço tem sido feito para desenvolver guias de onda integrados 2D como um componente principal dos circuitos integrados fotônicos. A tecnologia avançou a um ponto onde a fabricação de guias de onda ópticos estruturados nano-estruturados de baixa perda pode ser feito rotineiramente^5. Hoje, várias fundições em todo o mundo podem ser usadas para desenvolver circuitos integrados fotônicos. Guias de ondas guiam a luz através da total reflação interna também exibindo um campo evanescente na superfície. Pelo projeto cuidadoso da estrutura do waveguide, uma intensidade elevada pode ser conseguida no campo evanescente. Uma amostra colocada diretamente no topo da superfície do guia de onda também pode ser iluminada pelo campo evanescente para aplicações de imagem. O campo evanescente será gerado ao longo de todo o comprimento e largura do guia de onda, e, portanto, pode ser feito arbitrariamente grande⁶.

Apresentamos uma nova abordagem à TIRF dSTORM que oferece um campo de visão arbitrariamente grande. Em vez de usar uma lente TIRF para excitação e coleta, nós excitamos usando o campo evanescente de guias de onda ópticos. Isso desacoplar a extensão de luz de excitação e coleta, permitindo a liberdade total ao longo do caminho de luz da coleção sem comprometer a secção óptica para um determinado comprimento de onda fornecido pela iluminação do chip waveguide. Lentes de baixa ampliação podem, assim, ser usadas para imagem regiões muito grandes no modo TIRF, embora um NA menor reduza a resolução lateral. Além disso, a imagem multicolorida também é muito simplificada usando guias de onda^7,já que vários comprimentos de onda podem ser guiados e detectados sem reajustar o sistema. Isto é vantajoso para dTEMPESTADE, porque os baixos comprimentos de onda podem ser usados para realçar o fluorophore que pisca e para a imagem latente multicolor. Vale a pena notar que a profundidade de penetração do campo evanescente mudará em função do comprimento de onda, embora não afete a forma como o procedimento de imagem é realizado. O chip é compatível com imagens de células vivas⁸ e é ideal para aplicações como a integração de microfluídicos. Cada chip pode conter dezenas de guias de onda, que podem permitir que o usuário se aimagem em diferentes condições ou aplicar armadilhas ópticas⁹ e espectroscopia Raman¹⁰.

O sistema baseado em chip funciona igualmente bem para imagens limitadas por difração e superresolução. Uma abordagem semelhante foi introduzida em 2005 usando um prisma para gerar a excitação evanescente de campo^4. O chip fotônico também excita através do campo evanescente, mas com técnicas modernas de fabricação de guias de onda, pode-se gerar padrões de luz exóticos com guias de onda. A atual implementação de nanoscopia baseada em chip é limitada apenas a imagens 2D, já que o campo de excitação está bloqueado dentro da superfície do guia de onda. O desenvolvimento futuro terá como objetivo aplicações 3D. Além disso, outras técnicas de super-resolução, como microscopia de iluminação estruturada, estão sendo desenvolvidas usando o mesmo microscópio baseado em chip^11.

1. Preparação da camada de polidimiotilsiloxano (PDMS)

1. Prepare uma mistura de 10:1 de Sylgard 184 monomer e agente de cura.
2. Coloque a mistura em uma câmara de vácuo até que as bolhas de ar se foram.
3. Despeje 1,7 g de mistura PDMS no centro de uma placa de Petri de 3,5 polegadas (diâmetro).
4. Coloque a placa de Petri no vácuo chuck de um coater spin.
5. Casaco de spin a placa de Petri para 20 s em 900 rpm, com uma aceleração de 75 rpm/s.
6. Cure o prato em uma placa quente a 50 °C por pelo menos 2 h.

2. Preparação da amostra

1. Limpeza do guia de ondas
   1. Prepare 100 mL de uma diluição de 1% do concentrado de detergente de limpeza(Mesa de Materiais)em água desionizada (DI).
   2. Coloque o chip em uma placa de Petri de vidro usando uma pinça de wafer e cubra completamente com a solução detergente.
   3. Coloque a placa de Petri em uma placa quente a 70 °C por 10 min.
   4. Enquanto ainda estiver na placa quente, esfregue a superfície com um cotonete de tecido de sala limpa.
   5. Retire o chip da placa de Petri. Enxágüe com pelo menos 100 mL de água DI.
   6. Enxágüe com pelo menos 100 mL de isopropanol, tomando cuidado para que o solvente não seque na superfície para evitar manchas de evaporação.
   7. Enxágüe com pelo menos 100 mL de água DI. Afunde o chip com uma arma de nitrogênio.
2. Preparação da câmara
   1. Prepare uma camada de 150 μm polydimethylsiloxane (PDMS) em uma placa de Petri (seção 1).
   2. Use um bisturi para cortar um quadro de 1,5 cm x 1,5 cm da camada PDMS.
   3. Levante o quadro da placa de Petri com uma pinça. Depositá-lo plana em um chip limpo e polido. A amostra está agora pronta para a semeadura celular.
3. Rotulagem fluorescente
   1. Prepare os seguintes produtos químicos: solução shina tampoada de fosfato, solução de tine (s), dstorm imagem tampão.
   2. Após a semeadura celular, retire o chip da mídia.
   3. Use uma pipeta para remover qualquer excesso de líquido de fora da câmara PDMS.
   4. Retire o fluido atual de dentro da câmara PDMS com uma pipeta, adicionando aproximadamente 60 μL de PBS limpo ao mesmo tempo.
      NOTA: O montante adicionado à câmara terá de ser alterado de acordo com o tamanho da câmara. Tenha cuidado para não remover todos os meios de comunicação da superfície celular.
   5. Substitua o PBS com 60 μL de PBS limpo e deixe-o incubar para 1 min.
   6. Repita o passo anterior, deixando-o incubar por 5 min desta vez.
   7. Retire o PBS e substituí-lo por 60 μL da solução de tinuoso. Deixe a amostra incubar por cerca de 15 minutos, protegendo-a da luz.
      NOTA: Esta etapa pode ter que mudar significativamente, dependendo do corante fluorescente usado. Usamos CellMask Deep Red para rotular a membrana celular para este experimento
   8. Lave a amostra com PBS como nos passos 2.3.3-2.3.5.
   9. Retire o PBS e substituí-lo por 40 μL do buffer de imagem ao mesmo tempo.
      NOTA: Existem vários amortecedores de imagem diferentes para diferentes corantes fluorescentes.
   10. Coloque um coverslip em cima, impedindo que bolhas de ar se formem por baixo. Pressione delicadamente o coverslip de encontro à câmara de imagem para remover todo o excesso de meios.
   11. Use uma pipeta para remover qualquer excesso de mídia fora do coverslip. Limpe a área fora do coverslip com um cotonete úmido de água para evitar cristais formados por resíduos de mídia de imersão seca.

3. Procedimento de imagem

1. Configuração de componentes
   NOTA: Esta versão da configuração consiste em três componentes principais: o microscópio, estágio de acoplamento e estágio de amostra. Veja a Tabela de Materiais.
   1. Use um microscópio com um suporte de filtro, fonte de luz branca, câmera e revólver objetivo.
   2. Use um estágio de acoplamento piezo de 3 eixos com um laser acoplado à fibra e uma lente de acoplamento.
   3. Use um estágio manual de amostra de um eixo com ponta e inclinação e um suporte de vácuo.
   4. Monte o acoplamento e o estágio da amostra em um estágio motorizado de 2 eixos para a tradução da amostra.
2. Acoplamento do guia de onda
   1. Coloque o chip no vácuo chuck com a faceta do acoplamento para o objetivo de acoplamento. Certifique-se de que o chip está a aproximadamente uma distância focal do objetivo de acoplamento.
   2. Ligue a bomba de vácuo.
   3. Ligue o laser para 1 mW. Ajuste aproximadamente a altura da microplaqueta de modo que o feixe bata a borda dela. Desligue o laser.
   4. Ligue a fonte de luz branca. Escolha uma lente objetiva de baixa ampliação (por exemplo, 10x). Concentre o microscópio em um guia de ondas.
   5. Traduza o microscópio ao longo do guia de onda para ver se ele está bem alinhado com o caminho óptico. Mova o microscópio para a borda de acoplamento.
   6. Ligue o laser a 1 mW ou menos. Traduza o microscópio ao longo da borda do acoplamento para encontrar a luz do laser. Concentre o feixe na borda do chip.
   7. Ajuste o estágio de acoplamento ao longo do caminho óptico na direção que reduz o tamanho do ponto do feixe de laser até que ele desapareça. O feixe está agora acima ou abaixo da superfície do chip.
   8. Ajuste a altura do estágio de acoplamento até que o ponto do feixe reapareça e seja maximizado.
   9. Repita os dois passos anteriores até que o laser forma um local focado.
   10. Mova o local focado para o guia de onda de interesse.
   11. Traduza o microscópio a uma curta distância da borda para que a mancha de feixe focada não seja mais visível. Desligue a luz branca.
   12. Ajuste o contraste. Se o guia de onda está guiando, a luz dispersa ao longo do guia de onda deve ser claramente visível.
   13. Ajuste os eixos do estágio de acoplamento para maximizar a intensidade de luz dispersada. Desligue o laser.
   14. Ligue a luz branca. Ajuste o contraste, se necessário.
   15. Navegue até a região de imagens.
3. Imagens limitadas de difração
   1. Concentre-se com o objetivo de imagem desejado. Desligue a luz branca.
   2. Insira o filtro de fluorescência e vire a potência laser para 1 mW.
   3. Ajuste o tempo de exposição da câmera para aproximadamente 100 ms. Ajuste o contraste conforme necessário. Certifique-se de que o acoplamento ainda é otimizado.
   4. Localizar uma região de interesse para a imagem. Ligue o palco piezo looping para a média de modos fora.
      NOTA: 20 μm scan range com um tamanho de passo de 50 nm é adequado para a maioria das estruturas de guia de onda.
   5. Capturar pelo menos 300 imagens.
   6. Carregue a pilha de imagens capturadas para Fiji usando uma pilha virtual. A partir do menu de imagem em Fiji, escolha Stacks e z-projeto.
   7. Calcule a imagem da TIRF escolhendo o tipo de projeção de intensidade média.
4. d D D Imagens da TEMPESTADE
   1. Ligue o laser para 1 mW e definir o tempo de exposição da câmera para 30 ms.
   2. Ajuste o contraste e o foco.
   3. Aumentar a potência do laser até piscar é observado.
      NOTA: Isso pode demorar um pouco, dependendo da intensidade do campo evanescente.
   4. Zoom em uma pequena região da amostra.
   5. Ajuste o contraste.
   6. Capture algumas imagens para ver se os piscas estão bem separados.
   7. Ajuste o tempo de exposição da câmera para piscar ideal.
      NOTA: Otimizar piscar é uma tarefa complexa, mas um monte de literatura adequada está disponível¹².
   8. Ligue o loopr de palco piezo.
   9. Registre uma pilha de imagem de pelo menos 30.000 quadros, dependendo da densidade piscando.
5. d D D Reconstrução da imagem DA TEMPESTADE
   1. Abra Fiji e carregue a pilha dSTORM como imagens virtuais.
   2. Ajuste o contraste, se necessário.
   3. Use a ferramenta retângulo para selecionar a área para reconstruir.
   4. Análise open run no plugin Thunderstorm¹³ em Fiji.
   5. Defina as configurações básicas da câmera em Tempestade correspondente ao dispositivo. Os parâmetros padrão restantes são geralmente satisfatórios.
   6. Comece a reconstrução.
      NOTA: Para o campo de visão completo, os dados podem precisar ser divididos em subpilhas, devido ao tamanho do arquivo grande.
   7. Filtre a lista de localização fornecida pelo software de reconstrução para remover localizações inespecíficas. Apple uma correção de deriva adicional, se necessário.

A microscopia tirf é uma técnica popular, pois remove a fluorescência fora do plano, aumenta o contraste e, portanto, melhora a qualidade da imagem e é menos fototóxica em comparação com outras técnicas de microscopia baseadas em fluorescência. Em comparação com a abordagem tradicional baseada em objetivos, a microscopia baseada em chip oferece excitação tirf sem a produção limitada que geralmente é acompanhada com uma lente TIRF. Uma visão geral da configuração apresentada pode ser encontrada na Figura 1A. Apresentamos imagens de difração limitada, bem como dSTORM de células endotélias sinusoidal hepáticas (LSEC) extraídas de camundongos. Um grande campo de visão da imagem de LSECs com microtubulina rotulada também é apresentado, demonstrando as capacidades de imagens de alta geração. Uma configuração convencional dSTORM usando uma lente TIRF de imersão de óleo (ampliação de 60x ou 100x) normalmente imagens de uma área de 50 μm x 50 μm, que é 100 vezes menor do que a imagem baseada em chip na Figura 2, imagemcom um objetivo de 25x, 0,8 NA.

Neste método, usamos guias de onda Si3N4 multi-moded para excitação. Os chips utilizados consistem em uma camada orientadora gravada em tiras de 150 nm Si3N4 depositada em uma camada oxidada de 2 μm de um chip de silício. Um esquema do chip pode ser encontrado na Figura 1B. As larguras do guia de onda podem variar entre 200 e 1000 μm. Os detalhes da fabricação podem ser encontrados em outra parte8. Através da interferência entre os modos de propagação, a luz da excitação não terá uma distribuição de intensidade homogênea, mas sim um padrão espacialmente variável. A Figura 2A apresenta uma imagem com padrões de modo claramente visíveis. Este padrão de interferência vai mudar com a posição do feixe de laser na borda do guia de onda. A fim de alcançar excitação homogênea nas imagens finais, usamos uma fase piezo para oscilar ao longo da faceta acoplada. Ao longo do procedimento de imagem, existe variação suficiente dos padrões de interferência para que possam ser em média, removendo as flutuações de intensidade na imagem. A pilha de imagem consistirá em várias imagens, como na Figura 2A,embora com padrões diferentes, mas quando calculada em média, a pilha produzirá uma imagem com excitação homogênea, como a Figura 2B. Uma abordagem alternativa é usar afinação adiabatic para alcançar ampla, único moded waveguides8,14, que remove a necessidade de média de modo. No entanto, vários milímetros de comprimento de afinação são necessários para manter a condição de modo único para alcançar uma largura de guia de onda de 100 μm. Guias de onda multi-moded contornar essa necessidade de afinação e não deixam limitações na largura da estrutura. Além do padrão de iluminação, o índice de refração altamente eficaz dos modos permite possibilidades sem precedentes para a microscopia de iluminação estruturada11 e os métodos de microscopia de flutuação7.

O primeiro passo na imagem é coletar uma imagem limitada difração. O experimento resulta em uma pilha de cerca de 300 imagens e a imagem final é feita tomando a média da pilha. Na Figura 2,apresentamos difração limitada e dSTORM imagem de LSECs rotulado com CellMask Deep Red usando um 60x, 1,2 NA objetivo de imersão de água. A Figura 2A mostra iluminação inhomogénea causada pela média insuficiente do modo. A média de modo susucesso é exibida na Figura 2B. A Figura 2C é uma imagem de TEMPESTADE dda mesma região, com a região marcada mostrada na Figura 2D. As células endotélias sinusoidal do fígado têm poros nano-feitos medida na membrana15do plasma, que podem ser vistas aqui. Uma análise fourier da correlação do anel forneceu uma definição de 46 nm.

A Figura 3 apresenta uma imagem dSTORM de uma região de 500 μm x 500 μm, demonstrando as capacidades de alta geração da técnica. Uma imagem ampliada da Figura 3A,correspondente a um típico campo de visão da TEMPESTADE,é apresentada juntamente com a imagem limitada difração na Figura 3B. Uma correlação de anel Fourier para estimar a resolução foi realizada, produzindo um valor de 76 nm.

Figura 1: Sistema de imagem e guia de ondas. (A)Fotografia do sistema de imagem. A amostra é colocada em um chuck de vácuo no estágio da amostra, com a faceta do acoplamento do guia de onda para o objetivo de acoplamento. Um laser acoplado de fibra e um objetivo de acoplamento é colocado em cima de um estágio piezo 3D. Uma torre da lente com lentes de imagem captura a imagem de acima e retransmite-a a uma câmera. (B) Esquemático do guia de onda com acoplamento e lentes de imagem. A lente de acoplamento casais luz no guia de onda. As amostras (contas de laranja) são mantidas dentro de uma câmara PDMS selada. O campo evanescente ao longo do guia de ondas vai excitar a amostra e o objetivo de imagem irá capturar a fluorescência emitida. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Imagens de Difração limitada e dSTORM. (A)Imagem de células endotélias sinusoidal hepáticas com média de modo insuficiente, resultando em um padrão de excitação claramente visível. (B) A mesma região de(A),mas com média de modo suficiente, resultando em excitação homogênea. (C) Difração imagem limitada do insero em (B); (D) dSTORM imagem da mesma região. (E) Inset de (D), mostrando claramente as fenestrations na membrana plasmática da célula. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: dIMAGEM STORM de LSECs de rato. (A)Grande campo de visão dSTORM imagem de Alexa 647 tubulin manchado em lsecs rato. Barra de escala = 50 μm. (B) Maior região marcada de (A)comparando difração limitada (canto inferior esquerdo) e dimagem STORM (canto superior direito). (C)Menor região marcada de (A). Barra de escala = 1 μm. A imagem tem uma resolução de 76 nm. Adaptado com permissão de Helle et al. 20196. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

B.S. Ahluwalia solicitou patente GB1606268.9 para nanoscopia óptica baseada em chip. Os outros autores não declaram interesses financeiros concorrentes.