Fabricação e implementação de uma plataforma de microscopia de força de tração sem referência

Summary

Este protocolo fornece instruções para implementar a litografia multifóton para fabricar matrizes tridimensionais de marcadores de referência fluorescente incorporados em hidrogéis de poli (etileno glicol) para uso como microscopia de força de tração, livre de referências Plataformas. Usando estas instruções, a medida da tensão material 3D e o cálculo de trações celulares são simplificados para promover medidas da força da tração da elevado-produção.

Abstract

Quantificar a deformação material induzida por células fornece informações úteis sobre como as células se sentem e respondem às propriedades físicas de seu microambiente. Embora existam muitas abordagens para medir a cepa material induzida por células, aqui fornecemos uma metodologia para monitorar a deformação com resolução de submícron de forma livre de referência. Usando um processo de padronização fotolitográfica ativado de dois fótons, demonstramos como gerar substratos sintéticos mecanicamente e bioativamente ajustáveis contendo matrizes incorporadas de marcadores de energia fluorescente para medir facilmente três dimensões ( 3D) perfis de deformação de material em resposta a tracções superficiais. Usando esses substratos, os perfis de tensão celular podem ser mapeados usando uma única pilha de imagens 3D de uma célula de interesse. Nosso objetivo com esta metodologia é tornar a microscopia de força de tração uma ferramenta mais acessível e mais fácil de implementar para pesquisadores que estudam processos de mecanotransdução celular, especialmente os recém-chegados ao campo.

Introduction

A microscopia de força de tração (TFM) é o processo de aproximação das tracções celulares, utilizando campos de deslocamento interpolados de marcadores de geração de células, gerados por uma célula aderente e contrátil. Usando TFM, a influência de pistas mecânicas no ambiente extracelular em importantes processos celulares como proliferação, diferenciação e migração pode ser investigada^{1,2,3,4 ,5,6,7,8}<....

Protocol

1. fotopolimerização de um hidrogel base PEGDA

1. Coleta de reagentes
   1. Colete o lítio Phenyl-2, 4, 6-trimetilbenzoilfosforato (colo), 3,4 kDa poli (etileno) diacrilato de glicol (Pegda), n-vinil pirrolidona (NVP), alexafluor 488 rotulado Pegda (PEG-488), alexafluor 633 rotulado Pegda (PEG-633), e peptídeo pegylated RG PEG-RGDS) de seus respectivos freezers e trazer cada um para a temperatura ambiente.
   2. Em tubos de microcentrífuga âmbar separados, meça 3 mg de LAP, 10 mg de PEGDA, 5 mg de PEG-488, 20 mg de PEG-633 e 6 mg de peptídeo RGDS.
2. Preparação da solução pré-polímero
   1. Di....

Results

Ao longo do protocolo, há uma série de pontos de verificação que fornecem feedback para avaliar a qualidade do procedimento de padronização. Para fornecer alguma introspecção a respeito de como avaliar o progresso em cada um destes checkpoints, nós fornecemos resultados representativos de um experimento real. Os resultados evidenciam a aplicação deste protocolo realizado em um hidrogel fotomodelado preparado para análise de TFM de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Os resultados incluem dados brutos d.......

Discussion

O objetivo deste protocolo é fornecer um fluxo de trabalho que alivia grande parte da dificuldade associada à geração e análise de dados de TFM. Uma vez preparados, os hidrogéis fotomodelados são simples de usar, exigindo apenas conhecimento de práticas padrão de cultura tecidual e microscopia de fluorescência. O aspecto livre de referência permite a navegação descuidadas em hidrogéis carregados de células e elimina etapas de processamento de imagens complicadas, como registro de imagem entre imagens de referência e defo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Filtro de Seringa Acrodisc, 0.2 μ m Membrana de Supor,	Mortalha	PN 4602	Permite a filtragem de soluções de macrómeros antes da síntese do gel de base e das etapas subsequentes de litografia.
Acrilato-Silano Funcionalizado #1.5 CoverSlips	in-house	in-house	Os acrilatos permitem a ligação do hidrogel base à superfície do vidro para imobilizar os hidrogéis. Veja a referência: 21-24
Axio-Observer Z1 com Apotome	Zeiss		Microscópio de campo amplo com módulo de iluminação estruturada usado para capturar imagens para TFM.
Chameleon Vision ii	Coherent Inc.		Equipado em microscópio de varredura a laser usado para litografia multifotônica.
Fita Dupla Face, 9500PC, 6.0 mil	3M		Liga-se lamínulas funcionalizadas de acrilato-silano a placas de Petri.
Flexmark90 PFW Liner	FLEXcon	FLX000620	Permite o revestimento de fita dupla face, permitindo a alimentação da fita no plotter.
LSM-880	Zeiss		Microscópio de varredura a laser usado para litografia multifotônica.
MATLAB	Mathworks	R2018a	Executa scripts personalizados para gerar instruções de litografia para microscópio e para análise de dados TFM.
Modelo SC Plotter	USCutter	SC631E	Corta fita dupla face em anéis para ligar lamínulas a placas de Petri.
Objetiva C-Apocromática 40x/1,20 W Corr M27	Zeiss		Equipado tanto em microscópio de campo amplo quanto em microscópio de varredura a laser para ser usado tanto para litografia quanto para TFM.
PEG-AF633	in-house	in-house	Variante PEG de acrilato marcada com fluoróforo para criar marcadores fiduciais. Ver referência: 21
PEG-DA	em>in-house	in-house	Material de base para hidrogéis. Consulte a referência: 21
PEG-RGDS	in-house	in-house	RGDS marcada com peptídeo para promover a adesão celular. Veja a referência: 21
Placas de Petri	CELLTREAT	229638	furos de 8mm são cortados no centro de cada placa usando uma broca de perfuração para encaixar os hidrogéis de base.
Kit de Elastômero de Silicone Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Para criar espaçadores para controlar a espessura do hidrogel base (também conhecido como PDMS).
Seringa, Leur-Lok, 1 mL	BD	309628	Permite a filtragem de soluções de macrômeros antes da síntese do gel de base e das etapas subsequentes da litografia.
Lâmpada UV	UVP	Blak-Ray® B-100AP	Polimeriza hidrogel base.
1-vinil-2-pirrolidinona (NVP)	Sigma-Aldrich	V3409-5G	Acelerador radical e co-monômero. Melhora a incorporação de fluoróforo peguilado durante a litografia.