Descrevemos uma abordagem de imagem para a determinação do estado oligomérico médio de oligomeros de receptores marcados por mEGFP induzidos pela ligação de ligand na membrana plasmática das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B).
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Artigo de método
Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, poucos métodos são aplicáveis para detectar eventos de agrupamento e medir o grau de agrupamento. Aqui, descrevemos uma abordagem de imagem para determinar o estado oligomérico médio de homocomplexos do receptor marcado pelo mEGFP na membrana das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B). A N&B é um método semelhante à espectroscopia fluorescência-correlação (FCS) e fótons contando histograma (PCH), que são baseados na análise estatística das flutuações da intensidade da fluorescência da fluorofia difundindo dentro e fora de uma iluminação volume durante um tempo de observação. Em particular, a N&B é uma simplificação da PCH para obter informações sobre o número médio de proteínas em misturas oligoméricas. As amplitudes da flutuação da intensidade são descritas pelo brilho molecular do fluorophore e pelo número médio de fluorophores dentro do volume da iluminação. Assim, a N&B considera apenas o primeiro e segundo momentos da distribuição de amplitude, ou seja, a intensidade média e a variação. Esta é, ao mesmo tempo, a força e a fraqueza do método. Como apenas dois momentos são considerados, a N&B não pode determinar a fração molar de oligomeros desconhecidos em uma mistura, mas estima apenas o estado médio de oligomerização da mistura. No entanto, ele pode ser aplicado a séries de tempo relativamente pequenas (em comparação com outros métodos de momento) de imagens de células vivas em uma base pixel-a-pixel, simplesmente monitorando as flutuações de tempo da intensidade da fluorescência. Ele reduz o tempo eficaz por pixel para alguns microssegundos, permitindo a aquisição no intervalo de tempo de segundos a milissegundos, o que é necessário para cinética de oligomerização rápida. Finalmente, grandes áreas celulares, bem como compartimentos subcelulares podem ser explorados.
Introdução
Descrevemos uma abordagem de imagem total de reflexão interna fluorescência-número e brilho (TIRF-N&B) para determinar o estado oligomérico médio das moléculas receptoras na membrana plasmática das células vivas, com o objetivo de vincular a montagem do receptor dinâmica para a função biológica das proteínas (Figura 1).
Após a ligação extracelular do ligand, os receptores iniciam a transdução de sinal intracelular dependendo de sua conformação, oligomerização, potenciais co-receptores e composição da membrana. Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, reconhecida como um evento-chave na sinalização celular1,2,3,4,5,6, 7,poucos métodos podem detectar eventos de agrupamento e medir o grau de agrupamento experimentalmente8,9. O volume confocal (x, y - 300 nm, z 900 nm) é insuficientemente resolvido para provar a interação molecular e stoichiometria, mesmo após a otimização por algoritmos de restauração de imagem10. A composição sub-unitária de oligomeros proteicos não pode ser resolvida de forma puramente espacial, mesmo por métodos de super-resolução em x,y resolução de 20-70 nm, como PALM11, STORM12,e STED13. Além disso, sua resolução temporal (na ordem dos minutos por imagem) não pode seguir a cinética na faixa de segundos. Único molécula passo-branqueamento resolve a stoichiometria de oligomeros de proteína apenas se eles são imóvel14.
Um dos métodos mais versáteis para medir a densidade e o oligomerização de proteínas fluorescentes marcadas dentro de imagens individuais é a análise de distribuição de intensidade espacial (SpIDA), que depende da amostragem espacial. É aplicável a células quimicamente fixas e vivas, e permite a análise de várias regiões de interesse da célula simultaneamente usando microscopia fluorescência padrão15. Alternativamente, métodos momentâneos, como espectroscopia fluorescência-correlação (FCS)16,fótons contando histograma (PCH)17, e Número e Brilho (N&B)18,19, são adequados para oligomer quantitativo Medidas. Esses métodos analisam as flutuações de intensidade da fluorescência que podem ser observadas no tempo em que os fluorofforas se difundem dentro e fora de um volume de iluminação. As amplitudes das flutuações de intensidade podem ser descritas exclusivamente pelo brilho molecular do fluorofforre (ε) e pelo número médio de fluorofônicos (n) dentro do volume de iluminação17 (Figura 2). Normalmente, o coeficiente de difusão dos fluorofforos e o número médio de moléculas (inversamente relacionadas ao valor G(0) dentro do volume de iluminação podem ser obtidos pela FCS20. No entanto, uma vez que o tempo de difusão apenas escalas com a raiz cúbica da massa, FCS não é suficientemente sensível para detectar alterações na massa molecular21. Na prática, a FCS de cor única não consegue detectar a dimerização dos receptores de membrana. PCH resolve misturas de diferentes oligomeros com precisão. Usando mais de dois momentos da distribuição da amplitude, detecta moléculas do brilho diferente que ocupam o mesmo volume da iluminação. Digitalização FCS22 e desenvolvimentos, como a interessante par-correlação de brilho molecular (pCOMB) abordagem23, introduzido para estender a gama de aplicabilidade dos métodos de correlação fluorescência em sistemas biológicos24 , permanecem métodos de ponto único sem a capacidade de medições rápidas em uma grande área de uma célula, exigindo muitas observações consecutivas em cada pixel e aquisição de dados na ordem de segundos.
A N&B é uma versão simplificada do PCH que considera apenas o primeiro e segundo momentos da amplitude da distribuição de fluorescência, ou seja, a intensidade média, e a variação, σ2 (Figura 2)18,19 e, por causa disso, não pode determinar a fração molar de oligomeros desconhecidos em uma mistura, mas estima somente o estado médio do oligomerization da mistura. No entanto, a N&B tem a vantagem de trabalhar com uma série de imagens de imagens de células vivas relativamente menores do que a PCH em uma base pixel-a-pixel, simplesmente monitorando as flutuações no tempo da intensidade da fluorescência. Como a N&B reduz o tempo por pixel para alguns microssegundos, ela pode seguir cinética de oligomerização rápida sobre grandes áreas celulares, permitindo a aquisição de imagem em uma escala de tempo de segundos em microscopia de varredura de raster (por exemplo, confocal, 2 fótons) e milissegundos em microscopia baseada em câmera (por exemplo, TIRFM).
Vários relatos demonstraram a capacidade da N&B de quantificar o número de subunidades em aglomerados de proteínas por meio de imagens de regiões celulares estendidas. Os clusters Paxillin-EGFP foram detectados nos locais de adesão nas células CHO-K125,e a agregação intracelular do peptídeo httex1p patogênico foi descrita nas células COS-726. A N&B foi aplicada para seguir a oligomerização ativa da ligand do receptorErbB 27,e o efeito do ligand FGF21 em Klothob (KLB) e fgfr1c em célulasHeLa 28. A combinação de imagens tirf e análise de N&B foi usada para mostrar que a dinamina-2 é principalmente tetramérica em toda a membrana celular29. Aplicamos a N&B a imagens de varredura de raster e TIRF para provar a dimerização conduzida por ligand dos receptores de membrana celular uPAR e FGFR130,31.
Métodos de correlação de fluorescência, como N&B, FCS e PCH, são baseados na noção de que, em um volume aberto, o número de bolhas de partículas segue uma distribuição de Poisson. Como somente os fótons que os fluorofônicos emitem podem ser detectados, o valor médio para uma intensidade 
de fluorescência medida versus o tempo em um pixel da imagem, é o produto do número médio de fluorofosforas no volume de iluminação, n, e sua brilho molecular, ε17:
onde o ε é expresso como o número de fótons emitidos por unidade de tempo (convencionalmente por segundo) por molécula quando a molécula está no centro do volume de iluminação.
O brilho é propriedade de cada fluorofofóbico em uma determinada aquisição criada, enquanto a intensidade é a soma de todas as contribuições de todos os fluorofos. Em competições biológicas, o brilho aumentará com o aumento do número de fluorofos que flutuam junto, dando a informação no estado do oligomerization da proteína fluorescente-etiquetada. As amplitudes de flutuação em um determinado pixel é medido a partir da variação do sinal de fluorescência, σ2:
Onde a média do quadrado 
de intensidade, e o quadrado 
da média de intensidade, são computados a partir dos valores de intensidade individual em cada pixel de cada quadro:
onde K é o número de quadros totais na série de tempo. Experimentalmente, é necessário calcular para toda a série de imagens a variação que descreve a dispersão dos valores de intensidade individual em cada pixel de uma única imagem em torno do valor de intensidade média. A variação inclui todas as flutuações de diferentes origens. Em uma primeira aproximação, a variação devido às partículas de difusão no volume de iluminação, σ20,pode ser separada da variância devido ao ruído do tiro do detector, σ2d. As duas variações são independentes; assim, a variação total é dada por sua soma:
A variação, devido a flutuações moleculares dentro e fora do volume de detecção, é linearmente dependente do brilho e intensidade moleculares:
Reorganizando eq. 6 de acordo com o eq. 1:
De acordo com o conceito típico de espectroscopia de correlação de fluorescência, a equação 7 afirma que a variação devido ao número de flutuações depende do quadrado do brilho das partículas.
Em seguida, a variação devido às flutuações do detector é uma função linear da intensidade detectada, a suposição de que o detector é operado abaixo de seu limite de saturação19:
No caso dos detectores de contagem de fótons =1e c=0, assim a variação do detector é igual à intensidade média:
Para aplicar esses conceitos a medições reais em células vivas, Gratton e colegas18 definem o brilho aparente, B, para cada pixel como a proporção da variação sobre a intensidade média:
B é o parâmetro que é medido experimentalmente. Neste trabalho, imagens de séries de tempo de receptores FGFR1 na membrana plasmática das células HeLa são capturadas pela microscopia TIRF e o brilho aparente médio, B, é determinado pela análise de N&B. Então, após a adição de FGF2, séries de tempo consecutivos são capturadas para acompanhar as mudanças na auto-montagem das moléculas receptoras na superfície da membrana após a estimulação do receptor com o ligand canônico.
No entanto, uma vez que o detector do microscópio TIRF é uma câmera EMCCD, a expressão para o brilho aparente precisa ser modificada como19:
onde o deslocamento é o deslocamento da intensidade da eletrônica da deteção que é uma característica das ajustes do detetor. A variação e a intensidade média de um detector analógico são, respectivamente, dadas por:
onde G é o ganho analógico em níveis digitais (DL/fótons), S, os níveis digitais por fóton19, é dado pela inclinação de uma intensidade versus variação parcela para uma fonte de luz com intensidade constante (sem flutuações temporais). O fator γ está relacionado à forma do volume de detecção de pixels. De acordo com Hassler et al.32,o fator γ é igual a 0,3 para imagens TIRF trabalhando no ganho máximo da câmera de detecção19. Os parâmetros de deslocamento, S e G são características da câmera e do microscópio. O brilho aparente, B, é obtido reorganizando eq. 11 de acordo com eq. 12 e 13:
Experimentalmente, o ε é uma função complexa da intensidade do laser e da eficiência de detecção do sistema. No entanto, uma vez que B / S é linearmente dependente de ε, só é importante determinar o valor relativo do ε para um determinado modo de detecção:
onde o ε' é proporcional ao ε. Ainda assim, uma calibração é realizada usando uma referência interna.
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Protocolo
1. Preparação da amostra
- Dia 1. Células HeLa semente em meio completo em uma concentração de 100.000-200.000 células / mL em pratos de fundo de vidro. Sementes 6-8 replicar pratos.
Nota: Neste exemplo, o meio é complementado com 10% de calor inativado Fetal Bovine Serum (FBS), 1 mM piruvado de sódio, 100 U/100 μg penicilina/estreptomicina. Vários pratos de replicar são preparados. - Dia 2-3. Quando as células estão em sub-confluência, transfect metade dos pratos com o plasmídeo de proteína e a segunda metade com plasmídeos de referência (monomer e dimer), em meio livre de soro.
Nota: A transfecção é feita em meio livre de soro complementado com antibióticos, 0,1% De Soro Bovi Albumin e 25 mM HEPES buffer, sem Fenol Red. - Dia 3-4. Verifique se as células transfeccionadas são aderentes ao fundo dos pratos e a membrana celular é fluorescente. Descarte pratos com células cobertas de vegetação ou com fluorescência muito baixa.
Nota: Não deixe que as células cresçam demais. As células devem ser bem distribuídas e ser aderidas à área de vidro do prato (Figura 1A). Os pratos inferiores de vidro pré-revestidos podem ser usados favorecendo a adesão celular. A cultura celular é testada para contaminação por micoplasma antes de qualquer experimento. Neste exemplo, as células são transfeccionadas com plasmplasmida (A207K)mEGFP-FGFR1 e as células de referência são transfectadas com plasmsiem GPI-(A207K) e plasmplas mEGFP de GPI usando protocolos padrão. Para a microscopia de células vivas, recomenda-se um meio livre de indicadores; 25 mM tampão HEPES é adicionado para evitar alterações de pH durante a imagem.
2. TIRF Imaging - Alinhamento da Linha Laser e Otimização da Iluminação TIRF
- Quatro horas antes do experimento, ativar a incubadora de temperatura do microscópio em 37 °C.
- Ligue o microscópio, computadores e câmeras e esperar que as câmeras atinjam a temperatura de trabalho adequada.
Nota: A temperatura de trabalho da câmera utilizada neste estudo é de -75 °C. - Coloque uma pequena gota de óleo no objetivo. Coloque um prato de amostra no lugar. Feche as portas da incubadora e deixe a temperatura do prato equilibrar (~ 10 min).
- Ligue a lâmpada de epifluorescência e o laser de 488 nm.
- Selecione o modo de contraste de epifluorescência para explorar a amostra, pesquisando uma célula para se concentrar no ocular.
Nota: O uso de uma lâmpada fluorescente para procurar pilhas através do ocular não é imperativo. Uma linha laser apropriada pode ser usada preferivelmente. - Selecione o filtro adequado para coletar a emissão verde através da câmera do microscópio (Band Pass Ex 490/20 (500) Band Pass Em 525/50, ou similar.
- Mude da porta ocular para a câmera (câmera #1 na Figura 1)no modo epifluorescência, refine o foco e a mudança para o modo TIRF. Os modos epifluorescência e TIRF podem ser nomeados com uma nomenclatura diferente, dependendo da marca do microscópio.
Nota: Pode haver problemas focando ou alinhando o laser se não houver marcadores fluorescentes na interface coverslip. Para alinhar o laser corretamente (essencial para a boa TIRF), concentre-se no deslizamento de capa. Muitas vezes é muito difícil determinar se o coverslip está em foco. Como sugestão, concentre-se nas bordas das células. - Ativar o alinhamento automático seguindo as instruções do microscópio TIRF.
Nota: Resumidamente, para passos de 2,4 a 2,8, primeiro encontrar as células através do ocular e se concentrar neles, em seguida, enviar a emissão para a porta da câmera do microscópio TIRF, re-foco das células na tela do computador microscópio e ativar o procedimento para o alinhamento a laser. O alinhamento consiste em encontrar o ângulo crítico em que a iluminação se torna evanescente(Figura 3). Microscópios comerciais podem ter protocolos de alinhamento ligeiramente diferentes e também ser totalmente automatizados; outros podem ter uma pequena câmera para facilitar a visualização das condições de ângulo crítico. - Escolha uma profundidade de iluminação adequada e otimize a direção do campo evanescente(Figura 3).
Nota: A profundidade de penetração é mantida constante para todos os controles e amostras.
3. TIRF Imaging: Captura da Série Time
- Defina uma região de interesse (ROI) de pelo menos 256 x 256 pixels.
Nota: Nesta configuração, a captura é feita com câmera #2 software que controla diretamente apenas a câmera (Veja a lenda da Figura 1). - Defina a exposição a 1 ms e o ganho em EM para 1.000 (este é o fator G no eq. 12 e 13). A tal velocidade, pode ser necessário ajustar ou aumentar a potência laser. Aqui a potência a laser é de 0,5 mW.
Nota: Dependendo do tipo da câmera e dos limites impostos pelo coeficiente de difusão da proteína, intensidade e fundo de fluorescência, os critérios gerais para definir a potência laser não são para saturar o detector, minimizar o clareamento de fotos e capturar como rápido possível em um S/N razoável. O ganho EM é sempre definido no máximo da câmera (ver Introdução). - Executar uma primeira seqüência de teste em condições iniciais e estima aproximadamente o valor S / N. As condições são aceitáveis em S/N = 2-3 ou superior, medida no primeiro quadro da série de primeira vez.
- Use o controle deslizante do sistema de divisão de emissões que conecta a câmera #2 ao microscópio para mascarar um lado da imagem (Figura 1B, Figura 4A-B)
Nota: Neste conjunto, um conector de imagem multicanal é instalado na câmera #2 para permitir a aquisição de duas imagens espacialmente idênticas simultaneamente. O sistema é equipado com slides para a montagem de diferentes filtros de emissão. Um dos controles deslizantes monta uma máscara preta para cobrir um lado da imagem. A área mascarada é usada para a calibração interna de cada série de tempo, para determinar os parâmetros da câmera (eq. 12 e eq. 13). Desta forma, não há necessidade de uma etapa de calibração independente e, importante, calibração é realizada em paralelo com a captura de cada série de tempo. Na ausência deste sistema, a câmera pode ser calibrada aplicando protocolos publicados33. - Selecione a opção de autosave do arquivo da câmera.
- Comece a aquisição da série de imagens. Adquirir um mínimo de 700 quadros em uma relação Mínima S / N de 2.
Nota: O número de quadros necessários para análise depende da estabilidade da amostra para o fotobranqueamento e da dispersão dos dados. Portanto, a qualidade de cada série de tempos é avaliada durante a análise de N&B. - Sem tirar o prato do microscópio, adicione o ligand.
- Selecione uma célula com uma membrana de fluorescência brilhante e comece rapidamente a primeira série da corrida cinética.
Nota: Se a adição do ligand é feito rapidamente, esta primeira captura define o ponto = 0 tempo da cinética ligand. O software registra a hora exata da captura. - Pesquise uma segunda célula e adquira o segundo ponto de encontro da cinética.
Nota: As rotinas de visita ao ponto estão disponíveis em alguns microscópios equipados com estágios motorizados x,y,z. Estes permitem a memorização de múltiplas posições no prato celular, e pode ajudar a manter um intervalo mais constante de tempo entre a imagem-série em diferentes células. - Capture uma nova célula para cada ponto de tempo da corrida cinética.
Nota: Após a captura, uma célula é parcialmente fotobranda e não pode ser re-imagem. Por causa disso, a cinética é obtida acombinando séries de tempo de muitas células, cada uma capturada em um momento diferente. - Para cada novo prato, repita o protocolo do passo 2.3 para 3.9.
Nota: Para pratos de referência, adicione um volume do veículo (PBS complementado com 0,01% de albumina de soro bovina) equivalente ao usado para o ligand.
4. Número e Brilho (N&B): Verificação de qualidade da Série Time
- Converter e salvar como . TIFF os arquivos adquiridos com o software da câmera (.sif arquivos neste exemplo).
- Importação. Tiff arquivos na rotina de software de análise, ativando a interface gráfica do usuário N & B (GUI) MATLAB.
Nota: Uma rotina de N&B executável matlab personalizada é usada aqui (análise de N&B na https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia). Abrindo um importado. O arquivo TIFF, a rotina gera a imagem de intensidade média, o perfil de intensidade média e permite inspecionar a série quadro a quadro(Figura Suplementar 1). Outros softwares estão disponíveis para análise de N&B (por exemplo, software SimFCS). - Descartar séries para as quais o perfil de intensidade média mostra mais de 10% de fotobranqueamento, e séries em que houve uma distorção ou tradução evidente da membrana celular durante a aquisição.
- Os frames de colheita que são evidente fora-de-foco.
Nota: Uma ferramenta de corte é implementada na rotina para descartar quadros individuais ou múltiplos dentro da série de imagens. Esta operação é permitida porque o tempo quadro-a-quadro não é crítico, enquanto o pixel habitar o tempo (tempo de exposição) é (ver Discussão). - Mantenha para a série de análise apenas com pelo menos 500 prazos.
5. Número e Brilho (N&B): Determinação dos Parâmetros da Câmera (Offset, σ e S)
- Ativar a rotina calibrar câmera.
- Selecione uma área de pelo menos 20 x 50 pixels na região de ruído do detector(Figura 4).
Nota: A rotina origina um histograma dos valores (também definido Nível Digital, DL) e retorna um enredo logarithm da Frequência versus Níveis Digitais. - No lote de frequência de registro versus nível digital, mova o cursor vermelho linear para delimitar o gaussiano e a parte linear da curva.
Nota: O cursor vermelho divide as duas seções da curva, e ativa a rotina retornando o deslocamento, que é o centro da função gaussiana da resposta da câmera, o σ do ajuste gaussian, e o fator S, que é a inclinação da parte linear da câmera respons e (Figura 4C-D).
6. Número e Brilho (N&B): Computação dos valores B na Região Selecionada de interesse (ROI)
- Ativar a chave B.
Nota: Essa ação gera a imagem de intensidade média(Figura 5,primeira coluna) e a imagem B em que cada valor B individual está associado ao pixel relacionado na imagem(Figura Suplementar 1). - Aplique um binning mínimo (2 2) para reduzir a dispersão dos dados e para gerar o histograma B-I (Figura 5,segunda coluna).
Nota: O histograma B-I representa a distribuição dos valores B de todos os pixels da imagem versus a intensidade do pixel. Y = B/S; X = ( - offset)/S (Figura Suplementar 1 e eq. 11 e 15). - Inspecione o histograma B-I usando o cursor quadrado interativo.
- Selecione um ROI quadrado para a análise(Figura 5,terceira coluna).
Nota: O cursor sincroniza uma máscara móvel na imagem de intensidade média, destacando os pixels que são selecionados dentro da área do cursor quadrado(Figura Suplementar 1). Por esta inspeção, é possível excluir da análise o fundo e as áreas com intensidade muito baixa. - Gerar o mapa B do ROI selecionado (Figura 5,quarta coluna).
- Salve o arquivo ASCII dos valores B associados à seleção.
- Importe o arquivo ASCII em um software gráfico para calcular a distribuição de frequência dos dados e obter o valor B médio ± S.E (Figura 5,quinta coluna).
Nota: Se os dados forem homogêneos, a distribuição de frequência dos valores B aproxima-se de uma distribuição gaussiana. - Aplique eq. 15 para derivar
o 
brilho médio = - 1 [((contagens/molécula) por tempo de permanência] para cada célula em cada ponto de tempo da corrida cinética. Normalizar os dados de acordo com:
onde
está o valor B médio medido no tempo "t" após adição de ligand, e 
é o valor B médio medido no momento t=0 (10-20 s após adição de ligand).
Nota: A normalização dos resultados permite a comparação direta de experimentos realizados em dias diferentes. Compensa diferenças no brilho medido devido ao poder do laser e às flutuações técnicas. - Trace o Brilho Médio Normalizado versus tempo de aquisição para construir a corrida cinética (Figura 6).
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Resultados
Os resultados de duas células representativas HeLa-mEGFP-FGFR1 semeadas no mesmo prato cultural são mostrados na Figura 5 e na Tabela Suplementar 1. As duas células foram capturadas no tempo 0 min(Figura 5A, superior) e 7 min(Figura 5A, inferior) após a adição do ligand FGF2.
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Discussão
A N&B requer várias precauções na escolha do modelo celular e da estratégia de rotulagem. Ele pode ser aplicado apenas para células vivas que permanecem aderidas de forma enova durante o tempo de captura de imagem. Flutuações extras devido ao deslocamento rígido de toda a célula podem ser tratadas com abordagens adequadas de restauração de imagem38. No entanto, geralmente quando uma célula se move, a membrana celular também se deforma, e a deformação da estrutura, produzindo grande variação extra,...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O CNIC é apoiado pelo Ministério de Ciencia, Innovación y Universidades e pela Fundação Pro CNIC, e é um Centro de Excelência Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Também somos apoiados pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) "Una manera de hacer Europa". A UC reconhece o apoio da Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, da Association for International Cancer Research (agora conhecida como Worldwide Cancer Research) e do Ministério da Saúde italiano. A.T. reconhece o "Fondazione Banca del Monte di Lombardia" por apoiar parcialmente seu trabalho com a Bolsa PV "Progetto Professionalità Ivano Becchi" 2011-2012.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio invertido rápido de 3 cores do TIRF de Leica AM TIRF MC, com alinhamento smi-automático de TIRF. O microscópio está equipado com um laser de diodo de 488 nm, uma objetiva TIRF de óleo 100x 1,46, filtros passa-banda Ex/Em em 490/20 e 525/50, incubadora de temperatura/CO2 e câmera Andor DU 8285 VP EMCCD. O microscópio é operado pelo software Leica LIF. | Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha | ||
| Albumina de soro bovino 98% mínimo | Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EUA | A7906-100G | |
| DMEM sem vermelho de fenol com 25 mM HEPES | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | 21063029 | Soro usado livre para microscopia |
| DMEM de alta glicose GlutaMAX I | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | 10566-016 | Usado para meio completo |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 10x (PBS) | Biowest, Nuaill, França | X0515-500 | |
| Sistema de divisão de emissão Photometrics DV2 | TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, EUA | ||
| Soro fetal bovino, qualificado, Brasil | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | 10270106 | suplemento inativado de 10% para meio completo |
| Fundo de vidro 35 mm estéril 1,5 pratos | MatTek, Ashland, MA, EUA | P35G-0.170-14-C | não revestido, espessura do vidro 0,17 mícrons |
| GraphPad Prism | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA | ||
| Carcinoma cervical humano (HeLa), células de componente animal (AC) sem soro | Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Alemanha | CB_08011102 | |
| iXonEM+ 897 EMCCD (retroiluminado) Câmera ANDOR controlada pelo software ANDOR Solis | Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, Reino Unido | Esta câmera, instalada em uma porta adicional do microscópio, é usada para adquirir o N& Série temporal B | |
| Matlab Executável N& B Unidade | de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, Madrid, Espanha | download em https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia | |
| MatLab v.2018b | The MathWorks, Inc. Natick, MA, EUA | a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Penicilina:Estreptomicina para cultura de tecidos 100x | Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, EUA | LONZA 17-602E | suplemento para meio em Penicilina / Estreptomicina 100 U / 100 µ g. |
| Vetor de expressão pN1-mEGFP-FGFR1 | Unidade de Pesquisa em Oncologia Ginecológica, Instituto Europeu de Oncologia IRCCS, Milão, Itália | Zamai et al., 2019 | |
| Vetor de expressão pN1-N-Gly-mEGFP-GPI | Unidade de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, Madrid, Espanha | Hellriegel et al., 2011 | |
| Vetor de expressão pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI | Unidade de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, Madrid, Espanha | Hellriegel et al., 2011 | |
| FGF2 recombinante | PeproTech EC, Ltd., Londres, Reino Unido | Solução de ligante: 20 ng/mL de FGF2 em PBS suplementado com 0,01% de BSA. | |
| Piruvato de sódio GIBCO | ThermoFisher Scientific | 11360070 | suplemento de 1 mM para meio |
| Reagente de transfecção TransIt-LT1 | MirusBio LLC, Madison, WI, EUA | MIR 2300 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol | GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA | 25200056 | |
| Tipo F Líquido de imersão 10 mL | Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha | 11513 859 | |
| UltraPure BSA (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | AM2618 | Suplemento a 0,1% para meio sem vermelho de fenol usado para transfecções |
Referências
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- Marsango, S., Ward, R. J., Alvarez-Curto, E., Milligan, G. Muscarinic receptor oligomerization. Neuropharmacology. 136 (Pt C), 401-410 (2018).
- Oishi, A., Cecon, E., Jockers, R. Melatonin Receptor Signaling: Impact of Receptor Oligomerization on Receptor Function. International Review of Cell and Molecular Biology. 338, 59-77 (2018).
- Thelen, M., Munoz, L. M., Rodriguez-Frade, J. M., Mellado, M. Chemokine receptor oligomerization: functional considerations. Current Opinion in Pharmacology. 10 (1), 38-43 (2010).
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