Dinâmica de oligomerização dos receptores de superfície celular em células vivas pela microscopia de fluorescência de reflexão interna total combinada com análise de número e brilho

Resumo

Descrevemos uma abordagem de imagem para a determinação do estado oligomérico médio de oligomeros de receptores marcados por mEGFP induzidos pela ligação de ligand na membrana plasmática das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B).

Resumo

Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, poucos métodos são aplicáveis para detectar eventos de agrupamento e medir o grau de agrupamento. Aqui, descrevemos uma abordagem de imagem para determinar o estado oligomérico médio de homocomplexos do receptor marcado pelo mEGFP na membrana das células vivas. O protocolo é baseado na microscopia de Fluorescência Total de Reflexão Interna (TIRF) combinada com análise de Número e Brilho (N&B). A N&B é um método semelhante à espectroscopia fluorescência-correlação (FCS) e fótons contando histograma (PCH), que são baseados na análise estatística das flutuações da intensidade da fluorescência da fluorofia difundindo dentro e fora de uma iluminação volume durante um tempo de observação. Em particular, a N&B é uma simplificação da PCH para obter informações sobre o número médio de proteínas em misturas oligoméricas. As amplitudes da flutuação da intensidade são descritas pelo brilho molecular do fluorophore e pelo número médio de fluorophores dentro do volume da iluminação. Assim, a N&B considera apenas o primeiro e segundo momentos da distribuição de amplitude, ou seja, a intensidade média e a variação. Esta é, ao mesmo tempo, a força e a fraqueza do método. Como apenas dois momentos são considerados, a N&B não pode determinar a fração molar de oligomeros desconhecidos em uma mistura, mas estima apenas o estado médio de oligomerização da mistura. No entanto, ele pode ser aplicado a séries de tempo relativamente pequenas (em comparação com outros métodos de momento) de imagens de células vivas em uma base pixel-a-pixel, simplesmente monitorando as flutuações de tempo da intensidade da fluorescência. Ele reduz o tempo eficaz por pixel para alguns microssegundos, permitindo a aquisição no intervalo de tempo de segundos a milissegundos, o que é necessário para cinética de oligomerização rápida. Finalmente, grandes áreas celulares, bem como compartimentos subcelulares podem ser explorados.

Introdução

Descrevemos uma abordagem de imagem total de reflexão interna fluorescência-número e brilho (TIRF-N&B) para determinar o estado oligomérico médio das moléculas receptoras na membrana plasmática das células vivas, com o objetivo de vincular a montagem do receptor dinâmica para a função biológica das proteínas (Figura 1).

Após a ligação extracelular do ligand, os receptores iniciam a transdução de sinal intracelular dependendo de sua conformação, oligomerização, potenciais co-receptores e composição da membrana. Apesar da importância e ubiquidade da oligomerização do receptor, reconhecida como um evento-chave na sinalização c....

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Dia 1. Células HeLa semente em meio completo em uma concentração de 100.000-200.000 células / mL em pratos de fundo de vidro. Sementes 6-8 replicar pratos.
   Nota: Neste exemplo, o meio é complementado com 10% de calor inativado Fetal Bovine Serum (FBS), 1 mM piruvado de sódio, 100 U/100 μg penicilina/estreptomicina. Vários pratos de replicar são preparados.
2. Dia 2-3. Quando as células estão em sub-confluência, transfect metade dos pratos com o plasmídeo de proteína e a segunda metade com plasmídeos de referência (monomer e dimer), em meio livre de soro.
   Nota: A transfecção é feita em me....

Resultados

Os resultados de duas células representativas HeLa-mEGFP-FGFR1 semeadas no mesmo prato cultural são mostrados na Figura 5 e na Tabela Suplementar 1. As duas células foram capturadas no tempo 0 min(Figura 5A, superior) e 7 min(Figura 5A, inferior) após a adição do ligand FGF2.

Discussão

A N&B requer várias precauções na escolha do modelo celular e da estratégia de rotulagem. Ele pode ser aplicado apenas para células vivas que permanecem aderidas de forma enova durante o tempo de captura de imagem. Flutuações extras devido ao deslocamento rígido de toda a célula podem ser tratadas com abordagens adequadas de restauração de imagem^38. No entanto, geralmente quando uma célula se move, a membrana celular também se deforma, e a deformação da estrutura, produzindo grande variação extra,.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio invertido rápido de 3 cores do TIRF de Leica AM TIRF MC, com alinhamento smi-automático de TIRF. O microscópio está equipado com um laser de diodo de 488 nm, uma objetiva TIRF de óleo 100x 1,46, filtros passa-banda Ex/Em em 490/20 e 525/50, incubadora de temperatura/CO2 e câmera Andor DU 8285 VP EMCCD. O microscópio é operado pelo software Leica LIF.	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha
Albumina de soro bovino 98% mínimo	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EUA	A7906-100G
DMEM sem vermelho de fenol com 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	21063029	Soro usado livre para microscopia
DMEM de alta glicose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	10566-016	Usado para meio completo
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 10x (PBS)	Biowest, Nuaill, França	X0515-500
Sistema de divisão de emissão Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, EUA
Soro fetal bovino, qualificado, Brasil	GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	10270106	suplemento inativado de 10% para meio completo
Fundo de vidro 35 mm estéril 1,5 pratos	MatTek, Ashland, MA, EUA	P35G-0.170-14-C	não revestido, espessura do vidro 0,17 mícrons
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA
Carcinoma cervical humano (HeLa), células de componente animal (AC) sem soro	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Alemanha	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (retroiluminado) Câmera ANDOR controlada pelo software ANDOR Solis	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, Reino Unido		Esta câmera, instalada em uma porta adicional do microscópio, é usada para adquirir o N& Série temporal B
Matlab Executável N& B Unidade	de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, Madrid, Espanha		download em https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, EUA		a href="https://www.mathworks.com/products/matlab.html">https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicilina:Estreptomicina para cultura de tecidos 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, EUA	LONZA 17-602E	suplemento para meio em Penicilina / Estreptomicina 100 U / 100 µ g.
Vetor de expressão pN1-mEGFP-FGFR1	Unidade de Pesquisa em Oncologia Ginecológica, Instituto Europeu de Oncologia IRCCS, Milão, Itália		Zamai et al., 2019
Vetor de expressão pN1-N-Gly-mEGFP-GPI	Unidade de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, Madrid, Espanha		Hellriegel et al., 2011
Vetor de expressão pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI	Unidade de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, Madrid, Espanha		Hellriegel et al., 2011
FGF2 recombinante	PeproTech EC, Ltd., Londres, Reino Unido		Solução de ligante: 20 ng/mL de FGF2 em PBS suplementado com 0,01% de BSA.
Piruvato de sódio GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	suplemento de 1 mM para meio
Reagente de transfecção TransIt-LT1	MirusBio LLC, Madison, WI, EUA	MIR 2300
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	GIBCO Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	25200056
Tipo F Líquido de imersão 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanha	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	Suplemento a 0,1% para meio sem vermelho de fenol usado para transfecções

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