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Summary

Apresentamos um dispositivo microfluídico centrífuga movido a motor que pode cultivar esferóides celulares. Usando este dispositivo, esferóides de tipos de células únicas ou múltiplas podem ser facilmente coculturados condições de alta gravidade.

Abstract

Uma cultura tridimensional de células esferóides pode obter resultados mais úteis em experimentos celulares porque pode simular melhor microambientes celulares do corpo vivo do que a cultura celular bidimensional. Neste estudo, fabricamos uma plataforma elétrica de laboratório em um CD (disco compacto), chamada de sistema de cultura esferóide de base microfluídica (CMS), para criar esferóides de células tridimensionais (3D) implementando força centrífuga alta. Este dispositivo pode variar velocidades de rotação para gerar condições de gravidade de 1 x g a 521 x g. O sistema CMS tem 6 cm de diâmetro, tem cem 400 microwells μm, e é feito moldando com polidimetilsiloxano em um molde de policarbonato pré-feito por uma máquina de controle numérica de computador. Uma parede de barreira na entrada do canal do sistema CMS usa força centrífuga para espalhar as células uniformemente dentro do chip. No final do canal, há uma região de deslizamento que permite que as células entrem nos micropoços. Como demonstração, os esferóides foram gerados pela monocultura e pela cocultura de células-tronco derivadas do adiposo humano e dos fibroblastos pulmonares humanos em condições de alta gravidade usando o sistema. O sistema CMS usou um esquema de operação simples para produzir esferóides de cocultura de várias estruturas de concêntricos, Janus e sanduíche. O sistema CMS será útil em biologia celular e estudos de engenharia de tecidos que exigem esferóides e cultura organóide de tipos de células únicas ou múltiplas.

Introduction

É mais fácil simular microambientes in vivo biológicos com cultura celular esferóide tridimensional (3D) do que com cultura celular bidimensional (2D) (por exemplo, cultura celular convencional da placa de Petri) produzir experimental fisiologicamente mais realista resultados¹. Os métodos de formação esferóide atualmente disponíveis incluem a técnica de queda suspensa^2,a técnica de sobreposição líquida^3,a técnica de celulose carboxtil^4,a técnica microfluídica baseada em força magnética^5,e o uso de biorreatores⁶. Embora cada método tenha seus próprios benefícios, é necessária uma melhora adicional na reprodutibilidade, produtividade e geração de esferóides da cocultura. Por exemplo, enquanto a técnica microfluídica baseada em força magnética⁵ é relativamente barata, os efeitos de fortes campos magnéticos em células vivas devem ser cuidadosamente considerados. Os benefícios da cultura esferóide, particularmente no estudo da diferenciação e proliferação de células-tronco mesenchymal, têm sido relatados em vários estudos^7,8,9.

O sistema microfluídico centrífuga, também conhecido como laboratório-em-um-CD (disco compacto), é útil para controlar facilmente o fluido dentro e explorar a rotação do substrato e, portanto, tem sido utilizado em aplicações biomédicas, como imunoensaios¹⁰, Ensaios colorimétricos para detectar marcadores bioquímicos¹¹, ensaios de amplificação de ácido nucleico (PCR), sistemas automatizados de análise de sangue¹²e dispositivos microfluídicos centrífugas de todos em^{um 13.} A força motriz que controla o fluido é a força centrípeta criada pela rotação. Além disso, várias funções de mistura, valving e divisão de amostras podem ser feitas simplesmente nesta única plataforma de CD. No entanto, em comparação com os métodos de análise bioquímica acima mencionados, houve menos ensaios aplicando plataformas de CD para células culturais, especialmente esferóides¹⁴.

Neste estudo, mostramos o desempenho do sistema de esferóides microfluídicos (CMS) de base microfluífuga por monocultura ou cocultura de células-tronco derivadas do adiposo humano (hASC) e fibroblastos pulmonares humanos (MRC-5). Este artigo descreve em detalhes a metodologia de pesquisa¹⁵do nosso grupo. Assim, a plataforma de cultura esferóide lab-on-a-CD pode ser facilmente reproduzida. Um sistema gerador cms compreendendo um chip de cultura CMS, um suporte de chip, um motor DC, uma montagem de motor, e uma plataforma rotativa, é apresentado. A montagem do motor é impressa em 3D com estireno butadiene acrilonitrile (ABS). O suporte de chip e a plataforma rotativa são CNC (controle numérico de computador) usinado com o PC (policarbonato). A velocidade de rotação do motor é controlada de 200 a 4.500 rpm codificando um algoritmo de PID (proporcional-integral-derivado) baseado na modulação da pulso-largura. Suas dimensões são de 100 mm x 100 mm x 150 mm e pesa 860 g, tornando mais fácil de manusear. Usando o sistema CMS, os esferóides podem ser gerados várias condições de gravidade de 1 x g a 521 x g,de modo que o estudo da promoção de diferenciação celular alta gravidade pode ser estendido de células 2D^16,17 a 3D Spheroid. A cocultura de vários tipos de células também é uma tecnologia fundamental para efetivamente imitar o ambiente in vivo^18. O sistema CMS pode facilmente gerar esferóides de monocultura, bem como esferóides de cocultura de vários tipos de estrutura (por exemplo, concêntricos, Janus e sanduíche). O sistema CMS pode ser utilizado não só em estudos esferóides simples, mas também em estudos organóides 3D, para considerar estruturas de órgãos humanos.

Protocol

1. Fabricação de chips de cultura microfluídica (CMS) de base microfluídica (CMS)

1. Faça moldes de PC para as camadas superior e inferior do chip de cultura CMS por usinagem CNC. Dimensões detalhadas do chip são dadas na Figura 1.
2. Misture a base pdms e pdms agente de cura em uma proporção de 10:1 (w/ w) para 5 min e coloque em um desidratador para 1 h para remover bolhas de ar.
3. Depois de derramar a mistura PDMS nos moldes do chip de cultura CMS, retire as bolhas de ar para mais de 1 h e cure em uma câmara de calor a 80 °C por 2 h.
4. Coloque-os no aspirador de plasma aspirado com as superfícies a serem ligados de frente e expô-los ao plasma assistido pelo ar a uma potência de 18 W para 30 s.
5. Ligue as duas camadas do chip de cultura CMS e coloque-o na câmara de calor a 80 °C por 30 min para aumentar a força de adesão.
6. Esterilizar o chip de cultura CMS em um esterilizador de autoclave em 121 °C e 15 psi.

2. Preparação celular

1. Descongele o 1 mL do frasco contendo 5 × 10⁵-1 × 10⁶ hASCs ou células MRC-5s em um banho de água a 36,5 °C por 2 min.
2. Adicione 1 mL do Modied Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco a um frasco e misture suavemente com uma pipeta de 1.000 μL.
3. Coloque 15 mL do DMEM pré-aquecido a 36,5 °C em uma placa de Petri de 150 mm de diâmetro usando uma pipeta e adicione as células do frasco.
4. Após 1 dia, aspirar o DMEM e substituir por 15 mL de DMEM fresco. Posteriormente, alterar a mídia a cada 2 ou 3 dias.
5. Para separar as células da placa de Petri, adicione 4 mL de trippsina para as placas de Petri e colocá-los em uma incubadora em 36,5 ° C e 5% CO₂ para 4 min.

3. Formação esferóide da monocultura

1. Coloque 2,5 mL de 4% (w/v) solução plurônica F-127 no buraco de entrada do chip de cultura CMS (Figura 2A),enquanto gira o chip em 500-1.000 rpm e, em seguida, girar o chip em 4.000 rpm por 3 min usando o sistema CMS (Figura 2B).
   NOTA: O revestimento plurônico impede o acessório da pilha à porta da entrada quando a microplaqueta girar. Certifique-se de que o ar não está preso nos micropoços.
2. Incubar o chip de cultura CMS preenchido com solução plurônica durante a noite a 36,5 °C em 5% CO₂.
3. Retire a solução plurônica, lave a solução plurônica restante com DMEM e seque o chip por 12 h em um banco limpo.
4. Adicione 2,5 mL de DMEM ao chip de cultura CMS e gire o chip em ~ 4.000 rpm por 3 min para prewetting o interior do chip.
5. Pare a rotação e retire 100 μL de DMEM para abrir espaço para injetar a suspensão celular.
6. Adicione 100 μL de suspensões celulares que contêm 5 × 10⁵ hASCs ou 8× 10⁵ MRC-5s por pipetting Uniformemente distribuir as células por pipetting 3-5x para resuspensão.
7. Gire o chip a 3.000 rpm para 3 min para prender as células em cada microwell por força centrífuga.
   NOTA: Velocidade rotacional excessiva pode causar fuga celular através de buracos de ejeção de solução.
8. Cultura as células por 3 dias na incubadora em 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO₂, girando em 1.000-2.000 rpm. Mude a cultura a cada dia.

4. Formação esferóide da cocultura

1. Formação de esferóides concêntricos
   1. Adicione as primeiras células, 2,5 × 10⁵ hASCs, e girar o chip em 3.000 rpm. Após 3 min, adicione as segundas células, 4 × 10⁵ MRC-5s, e gire o chip em 3.000 rpm para 3 min. Injetar um total de 100 μL de suspensões celulares por pipetting. Quando as células são injetadas, mudar a velocidade de rotação para 500-1.000 rpm.
   2. Cultura as células da incubadora a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO₂ girando em 1.000-2.000 rpm. Os esferóides concêntricos são criados dentro de 24 h. Para a cultura a longo prazo, mude o meio da cultura diário.
2. Formação esferóide de Janus
   1. Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as primeiras células, 2,5 × 10⁵ hASCs, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.
   2. Incubar o chip a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO₂ girando em 1.000-2.000 rpm para 3 h.
   3. Adicione 100 μL das suspensões celulares contendo o segundo conjunto de células, 4 × 10⁵ MRC-5s, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.
   4. Cultura as células da incubadora a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO₂ girando em 1.000-2.000 rpm. Os esferóides Janus são criados dentro de 24 h. Para a cultura a longo prazo, mude o meio da cultura diário.
3. Formação do sferoide do sanduíche
   1. Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as primeiras células, 1,5 × 10⁵ hASCs, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.
   2. Incubar o chip a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO₂ girando em 1.000-2.000 rpm para 3 h.
   3. Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as segundas células, 3 × 10⁵ MRC-5s, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.
   4. Incubar o chip a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO₂ girando em 1.000-2.000 rpm para 3 h.
   5. Adicione 100 μL de suspensões celulares contendo as terceiras células, 1,5 × 10⁵ hASCs, por pipetting enquanto o chip gira em 500-1.000 rpm. Em seguida, gire o chip em 3.000 rpm por 3 min.
   6. Cultura as células da incubadora a 36,5 °C, >95% umidade, e 5% CO₂ girando em 1.000-2.000 rpm. Os esferóides sanduíche são criados dentro de 12 h. Para a cultura a longo prazo, mude o meio da cultura diário.

5. Coloração celular

1. Aqueça a corantes de fluorescência celular à temperatura ambiente (20 °C).
2. Adicione 20 μL de anidro dimitilsulfoxida (DMSO) por frasco para fazer uma solução de 1 mM.
3. Diluir a fluorescência a uma concentração de trabalho final de 1 μM usando DMEM.
4. Adicione a fluorescência à suspensão celular e retire suavemente usando uma pipeta.
5. Incubar 20 min a 36,5 °C, umidade de >95%, e 5% CO₂.

Representative Results

Discussion

O CMS é um sistema fechado em que todas as células injetadas entram no micropoço sem resíduos, tornando-o mais eficiente e econômico do que os métodos convencionais de geração esferóide à base de microwell. No sistema CMS, a mídia é substituída a cada 12-24 h através de um buraco de sucção projetado para remover a mídia no chip (Figura 3A). Durante o processo de sucção da mídia, quase nenhuma mídia escapa de dentro do micropoço devido à tensão superficial entre a mídia e a parede do microwell. Um usuário pode facilmente remover a mídia presa pressionando perto da região de micropoço do chip com um dedo, porque o chip feito de PDMS é elástico e flexível. As células do micropoço permanecem estáveis sem escapar, mesmo com múltiplas mudanças na mídia. Para alcançar a mesma qualidade de esferóide em todos os 100 microwells, a rotação do dispositivo não deve ser excêntrica, e o chip deve ser axisiétrico. Caso contrário, um número variável de células pode entrar em cada poço e o tamanho e a forma do esferóide podem diferir. No sistema de micropoço convencional, porque o ar é muitas vezes preso no microwell, é necessário remover as bolhas de ar. No entanto, o sistema CMS não requer o processo de remoção da bolha porque a alta força centrífuga gerada pela rotação faz com que a mídia empurre as bolhas e espremê-las das microesferas.

O sistema CMS também tem suas limitações em comparação com os métodos convencionais. O sistema CMS requer um espaço de cultura maior (por exemplo, grande espaço de incubadora), pois compreende um motor, plataforma rotativa e um controlador, e seu tamanho total é de aproximadamente 100 mm x 100 mm x 150 mm (Figura 2B). Além disso, causa uma vibração leve, mas persistente. Esperamos que a miniaturização do sistema (espero que semelhante ao tamanho de 6 placas de poço) vai resolver esses problemas.

Note-se que os esferóides cultivados podem ser coletados separando as duas camadas de plasma do sistema CMS (Figura 9). A ligação das duas camadas é forte o suficiente para evitar que a mídia vaze durante a operação do sistema. No entanto, devido à pequena área de ligação, é separável à mão. Os esferóides podem ser simplesmente coletados da camada inferior por pipetting.

O sistema CMS tem melhor reprodutibilidade e produtividade do que os métodos convencionais de geração esferóide. Os métodos convencionais, tais como o microwell normal ou métodos de gotículas suspensas, são trabalhosos. No entanto, no sistema CMS, é muito mais fácil aumentar o número de esferóides, simplesmente aumentando o tamanho do chip. Com este dispositivo, também é possível gerar organóides que exigem cultura de tipos multicelulares, o que não é fácil de fazer nos métodos de cultura convencionais. Além das células deste estudo (hASC e MRC-5), cms poderia ser usado para a produção de esferóides usando vários outros tipos de células que podem formar esferóides.

Materials

3D printer	Cubicon	3DP-210F
Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC)	ATCC	PCS-500-011
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	Contained 1% of completed medium and buffer
CellTracker Green CMFDA	Thermo Fisher Scientific	C2925	10 mM
CellTracker Red CMTPX	Thermo Fisher Scientific	C34552	10 mM
Computer numerical control (CNC) rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
DC motor	Nurielectricity Inc.	MB-4385E
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020	Contained 10% of completed medium
human lung fibroblasts (MRC-5)	ATCC	CCL-171
Inventor 2019	Autodesk		3D computer-aided design program
Petri dish Φ 150 mm	JetBiofill	CAD010150	Surface Treated
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	11/6/9003	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Polycarbonate (PC)	Acrylmall	AC15PC	200 x 200 x 15 mm
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Trypsin	Gibco	12604021