Estimativa estereológica do comprimento da fibra cholinergica no Núcleo Basalis de Meynert do Cérebro do Rato

Resumo

O comprimento da fibra neuronal dentro de uma estrutura tridimensional de uma região cerebral é um parâmetro confiável para quantificar a integridade estrutural neuronal específica ou a degeneração. Este artigo detalha um método de quantificação estereológica para medir o comprimento da fibra cholinergicdentro do núcleo basalis de Meynert em camundongos como exemplo.

Resumo

O comprimento de axônons cholinergic ou outros axônticos neuronais em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com a função específica da região. A estereologia é um método útil para quantificar perfis neuronais de várias estruturas cerebrais. Aqui fornecemos um protocolo de estereorologia baseado em software para estimar o comprimento total das fibras colinérgicas no núcleo basalis de Meynert (NBM) do cérebro do forebrain basal. O método usa uma sonda de bola espacial para estimativas de comprimento. As fibras colinérgicas são visualizadas pelo sistema de detecção de acetiltransferase de colina (ChAT) com o sistema de detecção de peroxidase-diaminobenzidina (HRP-DAB). O protocolo de coloração também é válido para estimativa de fibras e números de células em várias regiões cerebrais usando software de estereologia. O protocolo de estereorologia pode ser usado para estimativa de quaisquer perfis lineares, como fibras colececeptivas, fibras dopaminérgicas/catecolaminergicas, fibras sorotonergicas, processos ascicitos ou até mesmo perfis vasculares.

Introdução

Estimativas quantitativas de comprimento e/ou densidade de fibras nervosas no cérebro são parâmetros importantes de estudos neuropatológicos. O comprimento dos axônhonas cholinergicgic, dopaminergice e sorotonergicos em várias regiões cerebrais são frequentemente correlacionados com as funções específicas da região. Como a distribuição desses axôlos é geralmente heterogênea, a estereorologia baseada em design é usada para evitar viés durante a amostragem. A sonda de bola espacial da estereorologia foi projetada para fornecer medidas eficientes e confiáveis de estruturas semelhantes a linhas, como fibras neuronais em uma região de interesse¹. A ....

Protocolo

Todos os procedimentos para o uso desses animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais do Centro de Idosos de Kansas City. Camundongos de 18 meses de idade superexpressam proteína precursora beta-amilóide sueca (APPswe) e seus companheiros de lixo C57/BL6 WT foram usados para os experimentos. Detalhes da reprodução e genotipagem são dados em He et al.⁸.

1. Perfusão e processamento de tecidos

1. Camundongos anestesiados utilizando uma injeção intraperitoneal com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Beliscar os dedos para confirmar a falta de resposta antes de continuar

Resultados

Os resultados representativos são mostrados na Tabela 1 e Figura 5. O Grupo C, que foi decodificado como APPswe Group (APP), teve comprimento de fibra significativamente menor (Figura 5B) e densidade de comprimento de fibra(Figura 5C) em comparação com seus companheiros de lixo tipo selvagem (WILD). Os resultados mostraram que não houve diferença significativa no volume do NBM entre.......

Discussão

Aqui demonstramos um método para estimar a densidade de fibras cholinergic no NBM usando uma sonda de esfera espacial (esfera). Esta sonda estima o comprimento total da fibra na região de interesse. O comprimento total pode ser dividido pelo volume da região para obter a densidade da fibra. Para estimar o volume da região, utilizou-se o método de contagem de pontos Cavalieri. O método de contagem de pontos Cavalieri é um estimador imparcial e eficiente de um volume de referência 3D para qualquer região. O método calcula .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit ABC	Vector Laboratories	PK6100
Anticorpo Anti-ChAT	Millipore, MA, EUA	AB144P
anti-cabra IgG-B	Santacruz Biotechnology	SC-2347
Soro Bovino,	Adulto Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	B9433
Cryostat	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, EUA
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5652
Etilenoglicol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	324558
Glicerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	G2025
Peróxido de hidrogênio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	H1009
Immpact-DAB kit	Vector Laboratories	SK4105	Solução aprimorada de substrato de peroxidase DAB
Ketamine	Westward Pharmaceuticals, NJ, EUA	0143-9509-01
Microscópio	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, EUA	AF6000	Equipado com platina motorizada e câmera digital colorida IMI-tech
Meio de incorporação de temperatura de corte ideal (OCT)	Microscopia Eletrônica, PA, EUA	62550-12
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	P6148
Meio de montagem de permontagem	Electron Microscopy Sciences, PA, USA	17986-01
Stereologer Software	Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA	Stereologer2000	Instalado em um computador desktop Dell.
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T8787
Trizma Base	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T1503	Tris base
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	T5941	Tris hydrochloride
Xylazine	Bayer, Leverkusen, Germany	Rompun
Xilenos, Grau histológico	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	534056