Um modelo reversível da hipertensão ocular óleo-induzida do silicone nos ratos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir hipertensão ocular e neurodegeneração glaucomatous nos olhos do rato por injeção intracameral de óleo de silicone e o procedimento para a remoção de óleo de silicone da câmara anterior para retornar pressão intraocular elevada para Normal.

Resumo

A pressão intraocular elevada (OPP) é um fator de risco bem documentado para glaucoma. Aqui descrevemos um novo método eficaz para induzir consistentemente a elevação estável de IOP em camundongos que imita a complicação pós-operatória do uso de óleo de silicone (SO) como um agente de tamponada na cirurgia de vitreoretinal humana. Neste protocolo, SO é injetado na câmara anterior do olho do rato para bloquear a pupila e evitar o fluxo de humor aquoso. A câmara posterior acumula humor aquoso e isso, por sua vez, aumenta o IOP do segmento posterior. Uma única injeção de SO produz elevação de IOP confiável, suficiente e estável, o que induz neurodegeneração glaucomatous significativa. Este modelo é uma verdadeira réplica do glaucoma secundário na clínica oftalmológica. Para imitar ainda mais o ambiente clínico, assim pode ser removido da câmara anterior para reabrir a via de drenagem e permitir o fluxo de humor aquoso, que é drenado através da malha trabecular (TM) no ângulo da câmara anterior. Como o IOP retorna rapidamente ao normal, o modelo pode ser usado para testar o efeito da redução do IOP nas células ganglionares da retina glaucomatous. Este método é simples, não requer equipamentos especiais ou procedimentos de repetição, simula de perto situações clínicas e pode ser aplicável a diversas espécies animais. No entanto, pequenas modificações podem ser necessárias.

Introdução

A perda progressiva de células ganglionares da retina (RGCs) e seus axônios é a marca registrada do glaucoma, uma doença neurodegenerativa comum na retina¹. Afetará mais de 100 milhões de indivíduos de 40 a 80 anos até 2040^2. O IOP continua a ser o único fator de risco modificável no desenvolvimento e progressão do glaucoma. A fim de explorar a patogênese, progressão e tratamentos potenciais de glaucoma, um modelo de hipertensão ocular experimental/glaucoma confiável, reproduzível e indutor que reproduz as principais características dos pacientes humanos é imperativo.

O IOP depende da entrada aquosa do humor à câmara anterior do corpo ciliary na câmara posterior e da saída através do meshwork trabecular (TM) no ângulo da câmara anterior. Ao chegar a um estado estável, o IOP é mantido. Quando o fluxo excede ou é menor do que a saída, o IOP sobe ou cai respectivamente. Ao diminuir a saída aquosa, quer occluding o ângulo da câmara anterior ou por danificar o TM, vários modelos de glaucoma foram estabelecidos^{3,4,5,6,7,8,9,10}. Esses modelos estão normalmente associados a danos irreversíveis do tecido ocular, e o alto OPE na câmara anterior também causa complicações indesejadas, como edema córnea e inflamação intraocular, que dificultam a realização e interpretação da imagem ocular da retina.

Para desenvolver um modelo que supere essas deficiências, nos concentramos no glaucoma secundário bem sudocumenta causado pelo óleo de silicone (SO) que ocorre como uma complicação pós-operatória da cirurgia vitreoretinal humana^11,12. Assim é usado como um tamponade em cirurgias da retina por causa de sua tensão de superfície elevada. No entanto, Assim pode fisicamente ocluir a pupila, porque é mais leve do que os fluidos aquosos e vítreos, o que impede o fluxo aquoso para a câmara anterior. A obstrução causa elevação do IOP na câmara posterior devido à acumulação aquosa do humor. Isso nos motivou a desenvolver e caracterizar um novo modelo de camundongo hipertensão ocular baseado na injeção intracameral SO e no bloco pupilar^13,com características-chave do glaucoma secundário: bloco pupillar eficaz, elevação significativa do IOP que pode retornar ao normal após a remoção de SO e neurodegeneração glaucomatous.

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para hipertensão ocular induzida por SO no olho do rato, incluindo injeção e remoção de SO e medição de IOP.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Stanford.

1. Indução ocular da hipertensão pela injeção intracameral de SO

1. Prepare uma micropipette de vidro para injeção intracameral SO puxando um capilar de vidro com um puxador de pipeta para gerar uma micropipette. Corte uma abertura na ponta da micropipette e afie ainda mais a ponta com uma máquina de micromoedor para fazer um bisumo de 35°e 40°.
2. Polonês as bordas do bisume e remover todos os detritos, lavando com água. Autoclave a micropipette antes de usar.
3. Prepare a agulha da paracentese para a entrada da córnea. Para fazer isso, anexar uma agulha de 32 G para uma seringa de 5 mL em um bloqueio Luer, e fixá-lo ainda mais com fita adesiva. Dobre a ponta do bisumo da agulha de bruços a 30°.
4. Prepare o injetor SO, anexando e garantindo uma ponta contundente 18 G agulha em uma seringa de 10 mL em primeiro lugar. Em seguida, anexar um tubo de plástico com a agulha de 18 G em uma extremidade e encher-se com SO, conforme necessário através da outra extremidade.
5. Anexar a micropipette esterilizada para o tubo de plástico e empurre o desentupidor de seringa para encher toda a micropipette com SO.

2. Injeção intracameral so para um olho

1. Coloque um rato C57B6/J masculino de 9 a 10 semanas de idade em uma câmara de indução com 3% isoflurane misturado com oxigênio a 2 L/min por 3 min.
2. Intraperitoneally injetar 2,2,2-tribromoetanol em 0,3 mg / g peso corporal.
   NOTA: Ao contrário da cetamina/xilazine, 2,2,2-tribromoetanol não causa dilatação óbvia da pupila.
3. Verifique se há falta de resposta a uma pitada de dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do pés e a falta de movimento dos bigodes ou da cauda para determinar a força anestésica.
4. Coloque o mouse em uma posição lateral em uma plataforma de cirurgia. Para reduzir sua sensibilidade durante o procedimento, aplique uma gota de cloridrato de proparacaína de 0,5% à córnea antes da injeção.
5. Faça uma incisão de entrada com a agulha de paracentese 32 G no quadrante superotemporal, cerca de 0,5 mm do limbus.
6. Túnel através das camadas da córnea por cerca de 0,3 mm antes de perfurar na câmara anterior. Tenha cuidado para não tocar a lente ou íris.
7. Retire a agulha lentamente para liberar algum humor aquoso (cerca de 1 a 2 μL) da câmara anterior através do túnel (paracentese).
8. Espere ~ 8 min para diminuir ainda mais o IOP. Isso pode ser determinado medindo o olho de controle contralateral.
9. Insira a micropipette de vidro pré-carregada com SO através do túnel da córnea na câmara anterior, com o bisumo voltado para a superfície da íris.
10. Empurre o desentupidor de seringa lentamente para injetar SO na câmara anterior até que a gota SO cobre a maior parte da superfície da íris, ~ 2,3-2,4 mm de diâmetro.
11. Deixe a micropipette na câmara anterior para mais 10 s antes de retirá-la lentamente.
12. Empurre delicadamente a pálpebra superior para fechar a incisão da córnea para minimizar o escapamento assim.
13. Aplique pomada antibiótica (bacitracin-neomicina-polimixixina) à superfície dos olhos.
14. Durante todo o procedimento, umedeça freqüentemente a córnea com rasgos artificiais.
15. Mantenha o rato na almofada de aquecimento até que seja recuperado inteiramente da anestesia.

3. Remoção so

1. Prepare o sistema de irrigação.
   1. Prepare a solução de irrigação de acordo com as instruções do fabricante e coloque-a na garrafa de irrigação. Elevará a garrafa de solução irrigante para 110 a 120 cm acima da plataforma de cirurgia.
   2. Anexar uma administração IV definido para a garrafa de solução de irrigação. Retire as bolhas de ar da tubulação IV. Conecte uma agulha 33 G dobrada a 20° face até a tubulação IV.
2. Para preparar o sistema de drenagem, retire o desentupidor de uma seringa de 1 mL. Anexe uma agulha de 33 G à seringa e dobre a agulha a 20°.
3. Retire-se da câmara anterior.
   1. Intraperitoneally injetar 2,2,2-tribromoetanol (0,3 mg / g peso corporal). Check for the lack of response to the toe pinch to determine the anesthetic strength and the lack of movement of the whiskers or the tail.
   2. Coloque o mouse em uma plataforma de cirurgia e fixá-lo na posição lateral com fita adesiva. Aplique uma gota de cloridrato de proparacaína de 0,5% à córnea para reduzir sua sensibilidade.
   3. Faça duas incisões no quadrante temporal da córnea entre ~2 e 5 horas na borda da gota SO usando a agulha de paracentese de 32 G pré-feita.
   4. Insira uma agulha de irrigação 33 G conectada à solução irrigante através de uma incisão da córnea, velocidade máxima.
   5. Insira outra agulha de drenagem 33 G presa à seringa sem um desentupidor através da outra incisão da córnea para permitir que a gota SO saia da câmara anterior enquanto irriga com solução de irrigação.
   6. Retire a agulha de drenagem, em seguida, a agulha de irrigação.
   7. Injetar uma bolha de ar na câmara anterior para manter sua profundidade normal e pressione para fechar a incisão da córnea.
   8. Aplique pomada antibiótica em ambos os olhos.
   9. Mantenha o rato na almofada de recuperação do aquecimento até que seja recuperado inteiramente da anestesia.

4. Medição do IOP uma vez por semana

1. Coloque o mouse em uma câmara de indução perfundida com 3% isoflurane misturado com oxigênio em 2L/min por 3 min.
2. Intraperitoneally injetar xilazine e cetamina (0,01 mg xilazine/g, 0,08 mg quetamina/g).
3. Mantenha a córnea úmida aplicando lágrimas artificiais durante todo o procedimento.
4. Espere cerca de 15 min para permitir que a pupila para dilatar totalmente.
5. Medir o OPP de ambos os olhos usando um tonomômetro de acordo com as instruções do produto. Leve o tononter perto do olho do rato. Mantenha a distância da ponta da sonda para a córnea do rato em cerca de 3-4 mm. Pressione o botão de medição 6x para gerar uma leitura. Três leituras geradas por máquina são obtidas de cada olho para adquirir o IOP médio.
6. Sacrifique os animais em 8 semanas após a injeção de SO e realizar imunohistoquímica de toda a montagem retina, contagem RGC, nervo óptico (ON) seções semi-finas, e quantificação de axônios sobreviventes, que foram descritos antes^{de 13}.

Resultados

Logo após a injeção, podemos identificar facilmente camundongos que não produzem hipertensão ocular estável por causa das gotículas SO sendo muito pequenas (≤1,5 mm)¹³. Estes animais são excluídos dos experimentos subsequentes. Após os procedimentos de injeção, mais de 80% dos camundongos injetados SO acabam com gotículas maiores do que 1,6 mm. Medimos o OPP desses olhos de rato uma vez por semana durante 8 semanas após uma única injeção de SO. O OPP do olho que recebe SO permaneceu elevado, geral...

Discussão

Aqui demonstramos um procedimento simples, mas eficaz para induzir a elevação sustentada de OPP no olho do rato por injeção intracameral de SO. Este procedimento pode ser aprendido rapidamente por qualquer pessoa com experiência em microdissecção um microscópio. O principal risco potencial de falha é o vazamento de SO da incisão da córnea. No entanto, uma das vantagens do uso de SO é que, como a gota de óleo é visível e mensurável, podemos facilmente identificar camundongos que receberam gotículas pequenas demais para in...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloridrato de proparacaína a 0,5%	Akorn, Somerset
10mL syinge	BD		Luer-Lok Ponta
18G agulha	BD		com chanfro regular, comprimento da agulha: 25,4 mm
2,2,2-Tribromoetanol (Avertin)	Fisher Scientific	CAS # 75-80-9	50g
32G nano	BD	320122	BD Nano Ultra Fine Pen Needle-32G 4mm
agulha de oftalmologia 33G	TSK/ VWR	TSK3313/ 10147-200
5mL syinge	BD		Luer-Lok
Tip AnaSed Injection (xilazina)	Butler Schein		100 mg/ml, 50 ml
lágrimas artificiais	Alcon Laboratories	300651431414	Systane Ultra Lubricant Eye Drops
BSS PLUS Solução de irrigação	Alcon Laboratories
Extrator de micropipeta de vidro de duplo estágio	NARISHIGE	PC-10
EZ-7000 Sistema			Sistema EZ
Isoflurano	VetOne	502017	isoflurano, USP, 250ml/garrafa
IV Conjuntos de administração	EXELint/ Fisher	29081
INJEÇÃO DE CLORIDRATO	CETAMINA VEDCO	50989-996-06	KETAVED 100mg/ml * 10ml
máquina de chanfrar microgrind	NARISHIGE	EG-401
Miniatura EVA Tubing	McMaster-Carr	1883T4	0.05" ID, 0.09" OD, 10 ft. Comprimento
óleo de silício (SILIKON)	Alcon Laboratories	8065601185	1.000 mPa.s
Capilares de vidro padrão	WPI/ Fisher	1B150-4	4 in. (100mm) OD 1.5mm ID 0.84mm
TonoLab tonômetro	Colonial Medical Supply, pomada
antibiótica veterinária	Dechra Veterinary	1223RX	BNP pomada oftálmica, Vetropolycin

65080050clássico DE