Rastreamento genético clonal usando o mouse confetti para estudar tecidos mineralizados

Resumo

Este método descreve o uso do modelo do rato do R26-confetti (confetti) para estudar tecidos mineralizado, cobrindo todas as etapas da estratégia de melhoramento à aquisição da imagem. Incluído é um protocolo geral que pode ser aplicado a todos os tecidos moles e um protocolo modificado que pode ser aplicado a tecidos mineralizados.

Resumo

Rotulando uma célula individual no corpo para monitorar quais tipos de células ele pode dar origem e rastrear sua migração através do organismo ou determinar sua longevidade pode ser uma maneira poderosa de revelar mecanismos de desenvolvimento e manutenção de tecidos. Uma das ferramentas mais importantes atualmente disponíveis para monitorar células in vivo é o modelo de mouse confetti. O modelo do Confetti pode ser usado para etiquetar genetically pilhas individuais em ratos vivos com várias proteínas fluorescentes em uma maneira tipo-específica da pilha e para monitorar seu Fate, assim como o Fate de seu progênie sobre o tempo, em um processo chamado traçado genético clonal ou traçado de linhagem clonal. Este modelo foi gerado há quase uma década e contribuiu para uma melhor compreensão de muitos processos biológicos, particularmente relacionados à biologia de células-tronco, desenvolvimento e renovação de tecidos adultos. No entanto, preservar o sinal fluorescente até a coleta de imagens e a captura simultânea de vários sinais fluorescentes é tecnicamente desafiador, especialmente para o tecido mineralizado. Esta publicação descreve um protocolo passo-a-passo para o uso do modelo confetti para analisar a cartilagem da placa de crescimento que pode ser aplicada a qualquer tecido mineralizado ou não mineralizado.

Introdução

Os métodos melhorados para monitorar o comportamento da pilha são desejáveis aumentar a eficiência experimental ao usar modelos animais. Uma das abordagens mais informativas para monitorar o comportamento celular in vivo é o rastreamento de linhagem clonal com cepas de mouse multicolor repórter¹, incluindo o amplamente utilizado R26-confetti (confetti) mouse². Através da rotulagem genética de células individuais com proteínas fluorescentes e seguindo essas células ao longo do tempo, pesquisadores em muitos campos usaram o mouse confetti para revelar insights sobre uma infinidade de diferentes sistemas biológicos.

O rato do Confetti é um sistema loxp-baseado do repórter em que o recombinação dependente do ADN de CRE causa a expressão permanente de uma de diversas proteínas fluorescentes possíveis em uma maneira estocástico². O alelo do R26-confetti inclui o promotor ubiquitously expresso de cagg, que se encontra imediatamente a montante de um^R-Cassette neo loxp-flanked², cuja a seqüência do poliadenilação termine a transcrição³, seguida pelo Brainbow 2,1 construir⁴. Daqui, o recombinação CRE-negociado simultaneamente impostos especiais consumo a^R-gaveta neo e conduz à produção de determinadas proteínas fluorescentes dependendo de que partes da construção de brainbow 2,1 são extirpada. Esta característica faz o rato do confetti extremamente adaptável porque pode ser usado para alvejar toda a população celular em um rato para que uma tensão específica de CRE está disponível. O cruzamento de uma estirpe CRE tecido-específica com a estirpe de R26-confetti fornece a especificidade da rotulagem. No entanto, a cepa CRE também deve ser induzível (por exemplo, creert ou CreERT2, que necessitam de ligação tamoxifeno para permitir que eles entrem no núcleo e induzem recombinação de DNA⁵) para que a rotulagem pode ser alcançada em pontos de tempo especificado. Assim, uma população celular pode ser rotulada injetando a prole resultante CreERT-positivo/confetti-positivo com tamoxifeno no ponto de tempo desejado e rastreada até uma certa idade, quando os tecidos de interesse podem ser coletados para análise. Após o processamento tecidual, as células com rótulo fluorescentamente podem ser visualizadas diretamente pela microscopia confocal, de modo que a progêia de cada célula inicialmente rotulada possa ser separada da descendência gerada por qualquer outra célula identificada com base em sua fluorescência específica rótulos, permitindo assim a avaliação da clonalidade (ou seja, rastreamento genético clonal).

Devido à flexibilidade do modelo de confetes, tem sido aplicado para estudar o desenvolvimento e a manutenção de diversos tecidos na saúde e na doença^{2,6,7,8,9, 10,11}. Uma maneira comum de usar o modelo é rotular uma determinada população de células e determinar quais tecidos eles (e/ou sua descendência) contribuíram para. Um tal achado usando esta aproximação era que o dente adulto é compreendido das pilhas com uma origem glial⁶. Outra aplicação do modelo é estudar a homeostase de células-tronco. Por exemplo, o modelo confetti revelou que nichos de células-tronco nas criptas intestinais gradualmente se tornam monoclonais porque alguns clones de células-tronco são dominantes durante a competição entre as células-tronco². O modelo também pode ser usado para avaliar a proliferação celular, o que é particularmente útil para estudar lentamente dividindo as células. Por exemplo, a formação clonal na cartilagem articular¹² foi avaliada, e os efeitos a curto prazo de um antagonista de ouriço em condrócitos de placa de crescimento em camundongos de cinco semanas de idade foram estudados¹³.

Apesar da relativa simplicidade do modelo Confetti, o sinal fluorescente pode ser tecnicamente desafiador para preservar até a coleta de imagens, particularmente ao analisar os tecidos mineralizados. Aqui, o protocolo descreve um modelo otimizado para usar o mouse confetti com o osso pós-natal (até 6 meses de idade), permitindo que as proteínas fluorescentes sejam visualizadas diretamente pela microscopia confocal sem a necessidade de imunodetecção. Este protocolo simplificado pode ser aplicado a tecidos não mineralizados. Além disso, é incluída uma descrição de como armazenar as amostras, a fim de preservar o sinal fluorescente por um período prolongado de pelo menos 3 anos. Um esboço do protocolo é apresentado na Figura 1.

Protocolo

Todo o trabalho do rato foi aprovado pelo Comitê de ética em experimentos com animais (Stockholm North Committee/Norra Djurförsöksetiska Nämd) e conduzido de acordo com as disposições e diretrizes da Agência de animais da Suécia para experimentação animal.

1. reprodução do rato

1. Para gerar a estirpe, atravesse o R26-confetti mouse com a linha de interesse CRE. Wean os filhotes aos 21 dias de idade.
   Nota: os camundongos podem ser usados para reprodução a partir de aproximadamente 8 semanas de idade, ou de acordo com as diretrizes locais. A genotipagem (não descrita aqui) pode ser realizada a partir de biópsias coletadas no desmame. A idade ao desmame pode ser ajustada de acordo com as diretrizes locais.

2. confetti rotulagem

Nota: esta estratégia de rotulagem é apropriada para tensões induzível de CRE do tamoxifeno.

1. Prepare uma solução de até 2,5 mg/mL de tamoxifeno em óleo de milho em um frasco de vidro. Dissolver por aquecimento a 37 ° c em um forno por até 60 min, agitando a cada 5 min usando um Vortex até que o pó tenha dissolvido.
   Nota: para doses elevadas de tamoxifeno, podem ser preparadas soluções até 20 mg/mL utilizando este método.
2. Conservar a 4 ° c por até 3 meses, protegida da luz.
3. Induzir recombinação administrando 50 μL de 2,5 mg/mL de tamoxifeno dissolvido em óleo de milho intraperitonealmente no primeiro dia pós-natal (P1).
   Nota: em princípio, tamoxifeno pode ser administrado em qualquer idade, tão cedo quanto a geração de F1. A dose de tamoxifeno deve ser variada com base na expressão CRE, na idade do rato e na aplicação experimental. Mais informações podem ser encontradas na seção de discussão. Os camundongos negativos CRE tratados da mesma maneira podem ser usados como um controle negativo para sinais fluorescentes do confetti.
   Cuidado: Assegure-se de que os manipuladores de animais sejam avisados do uso de tamoxifeno e assegure que os materiais da gaiola sejam eliminados de acordo com as diretrizes ambientais e de segurança locais.

3. coleção do tecido

1. Eutanizar camundongos no dia pós-natal 27 (P27), preenchendo gradualmente o espaço contendo os camundongos com dióxido de carbono até pelo menos 80% em volume e mantendo essa concentração por 3 min. realize luxação cervical. Mantenha os camundongos no gelo durante a dissecção dos outros animais.
2. Dissecar o tecido de interesse. Delineado abaixo está um protocolo para a coleta das placas de crescimento femoral proximal tibial e distal e cartilagem articular do joelho, adequado para camundongos pós-natal até a idade de 6 meses.
   1. Retire a pele ao redor dos membros posteriores até o pé, usando tesouras afiadas e pinças dentadas.
   2. Aproximadamente aparar o músculo e tecido adiposo das pernas com tesouras afiadas.
      Nota: não limpe os ossos perfeitamente, porque os tecidos circundantes fornecem alguma sustentação estrutural ao seccionamento, mas asseguram-se de que toda a pele esteja removida.
   3. Usando um bisturi, corte através do tecido mole, onde a parte superior da perna encontra o corpo até que a cabeça femoral é visível, em seguida, cortar os ligamentos na articulação do quadril para remover a perna.
      Nota: Alternativamente, se não for possível encontrar a cabeça femoral, corte o fêmur perto do quadril com uma tesoura forte.
   4. Dissecar o pé do resto da perna usando um bisturi ou tesoura afiada.

4. fixação e processamento do tecido

Nota: com base no tecido de interesse, siga um dos dois protocolos detalhados abaixo (4,1 para tecidos moles ou 4,2 para tecidos de camundongo mineralizado com idade de aproximadamente 45 dias, conforme detalhado abaixo). Para ambos os métodos, armazene as amostras dissecadas na solução salina de formaldeído/fosfato (PBS) de 3,7% em gelo, enquanto dissecando os animais remanescentes.

1. Para os tecidos moles e tíbias mineralizada e fémures até a idade de aproximadamente P45, fixar o tecido em pré-arrefecido 3,7% formaldeído/PBS para 6 h, rolando suavemente em um rotator a 4 ° c. Use um volume pelo menos 10x maior do que o do tecido. Continue diretamente para a etapa 4,3.
2. Para os tecidos mineralizados, incluindo as tíbias e fémures sobre a idade de aproximadamente P45, é necessária uma etapa de descalcificação.
   1. Prepare 1 L de solução de EDTA/dH₂o de 10% com o pH ajustado para 8, 5 usando hidróxido de sódio. Em seguida, diluir o formaldeído para 3,7% usando esta solução. A concentração de trabalho de EDTA será de 9%.
   2. Fixar o tecido colocando em pré-arrefecido 3,7% formaldeído/PBS durante a noite, suavemente rolando em um rotator a 4 ° c.
   3. Coloque o tecido em solução pré-arrefecida 3,7% formaldeído/9% EDTA/dH₂o (pH 8, 5) e Rode suavemente a 4 ° c num volume de pelo menos 10x maior do que o tecido. Repita este passo colocando os ossos em fresco, pré-arrefecido 3,7% formaldeído/9% EDTA/dH₂o para 3x durante o próximo 48 h.
      Nota: esta curta descalcificação é suficiente para permitir o corte do fêmur e ossos da tíbia de até 6 meses de idade camundongos. Para tecidos mais densamente mineralizados, a descalcificação pode ser necessária para melhorar a histologia.
3. Transfira o tecido em 30% de sacarose/dH₂o. Certifique-se de encher o recipiente até a borda, e Gire suavemente durante a noite a 4 ° c. Use um volume pelo menos 10x maior do que o do tecido. O tecido flutuará frequentemente quando colocado primeiramente nesta solução e afunda-se à parte inferior do frasco pela manhã.
4. Para remover a solução de sacarose residual, lave brevemente o tecido removendo-o da solução de sacarose com fórceps e cobrindo completamente a amostra com aproximadamente 5 ml de composto de temperatura de corte ideal (OCT) por vários segundos.
5. Preencha um cryomold pré-rotulado com OCT e posicione o tecido na parte inferior. Trabalhe rapidamente para evitar que as amostras se sentem à temperatura ambiente por muito tempo.
   Observação: é importante colocar a amostra em uma orientação conveniente para a etapa de corte. Para aumentar as chances de seccionamento através de colunas de placa de crescimento inteiro após o rastreamento com Col2CreERT: Confetti, coloque o lado medial voltado para baixo usando a cabeça femoral como um guia, e posicione a amostra como plana para o fundo do molde como possível.
6. Incorpore a amostra colocando o molde no gelo seco e aguardando a OCT para solidificar inteiramente. Coloc os cryomold tão lisos como possível para evitar o movimento/deslizamento do tecido no molde. Uma vez terminado, armazene as amostras a-20 ° c, se elas não forem usadas imediatamente.
   Nota: use dentro de 12 semanas, porque com a idade os blocos tornam-se mais difíceis de seção.

5. seccionamento

Nota: realize crioseccionamento utilizando um criostat com lâminas descartáveis adequadas para tecidos duros. Qualquer criostat padrão é adequado.

1. Retire o bloco do molde e prenda-o ao mandril aplicando Oct entre a parte superior do bloco e o mandril e refrigerar no criostato em-20 ° c por pelo menos 5 minutos, de modo que o Oct solidified completamente.
2. Precool o suporte da amostra e o suporte da lâmina a-20 ° c e coloc então a amostra/mandril no suporte do mandril e a lâmina no suporte da lâmina para equilibrar por diversos min.
   Nota: as temperaturas especificadas podem ser variadas por vários graus, dependendo do criostat e do tecido de interesse.
3. Use o criostat para aparar o bloco e corte seções de tecido de uma espessura adequada para permitir a visualização dos clones no tecido de interesse.
   1. Para a análise de placas de crescimento pós-natal, prepare seções de 30 − 160 μm e colete-as em slides. Alguns modelos de criostat só podem permitir a coleta de seções grossas usando a configuração de corte.
4. Seque as lâminas à temperatura ambiente até estarem completamente secas.
   Nota: a duração desta etapa pode variar com base nas propriedades do tecido e na espessura da seção. A temperatura da sala também é susceptível de afectar a velocidade desta etapa.
5. Armazene os slides a-20 ° c por até 36 meses, ou se estiver processando imediatamente, prossiga para a etapa 6,2.

6. preparação e montagem da corrediça

1. Retire a lâmina do congelador e coloque a temperatura ambiente horizontalmente num porta-lâmina. Permita que qualquer condensação evate.
2. Remova a OCT usando uma pipeta Pasteur para aplicar suavemente a PBS à temperatura ambiente no slide. Quanto mais espessa for a seção, mais tempo será necessário. Para seções de espessura de 160 μm, realize duas enxaguações: incubar uma vez por 15 min e retire o líquido e, em seguida, aplique PBS fresco por 5 min e retire o líquido.
   Nota: esta etapa é remover a OCT e pode ser variada com base nas propriedades do tecido e na espessura da seção, conforme apropriado. A temperatura da sala é susceptível de afectar a velocidade desta etapa.
3. Monte as lâminas em uma solução de 75% 2, 2-thiodiethanol/dH₂O na temperatura ambiente com os deslizamentos de tampa longos de 60 milímetros.
   Nota: as corrediças podem ser preparadas imediatamente antes da imagem latente, mas o sinal fluorescente é estável por 1 − 2 semanas se mantido fora da luz em uma câmara humidificada em 4 ° c.

7. imagem latente pela microscopia confocal

1. Configure o microscópio.
   1. Ligue o microscópio e abra o software. Clique no botão Iniciar sistema .
   2. Selecione os canais clicando primeiro em configuração inteligente na guia aquisição e, em seguida, selecionando os três canais correspondentes à proteína fluorescente vermelha (RFP), proteína fluorescente amarela (YFP) e proteína fluorescente ciano (CFP) o Rumo da tintura . Clique em melhor sinal , em seguida, aplicar para selecionar os lasers.
      Nota: o conteúdo da guia aquisição é mostrado no arquivo suplementar 1a. Se os canais necessários não estiverem presentes, adicione-os usando o botão '+' o título do corante . A informação necessária a respeito do laser, dos comprimentos de onda da excitação, e da escala de comprimentos de onda gravados da emissão é mostrada para as três proteínas fluorescentes do confetti no arquivo suplementar 1B-D.
   3. Selecione a lente objetiva 20x o título objetivo na guia modo de aquisição .
2. Localize a placa de crescimento ou outro tecido de interesse.
   1. Para fornecer uma exibição distinta, primeiro selecione o canal RFP clicando em seu nome na guia canais . Isso faz com que os detalhes do canal RFP a ser exibido na guia caminho de luz . Clique na caixa de seleção ao lado de T-PMT.
      Nota: o canal T-PMT mostra a luz laser não refletida, que é usada para visualizar as partes não fluorescentes do tecido.
   2. Coloque a corrediça no suporte da corrediça e posicione a placa do crescimento ou o outro tecido do interesse diretamente entre o trajeto claro e a lente objetiva.
   3. A fim de simplificar a localização do tecido, desmarque os canais YFP e CFP usando as caixas de seleção o título de faixas da guia canais .
   4. Selecione o canal T-PMT clicando em seu nome no título faixas . Clique em Live na guia aquisição e aumente o ganho (Mestre) para o canal T-PMT, a fim de visualizar a seção de tecido na tela, que é mostrada em escala de cinzentos.
   5. Mova a posição do slide usando o joystick para localizar a região de interesse e, em seguida, concentre-se usando o botão de microscópio apropriado.
   6. Clique em parar na guia aquisição para desativar a exposição a laser.
3. Defina os parâmetros de imagem.
   1. Use as caixas de seleção na guia canais para selecionar um dos canais e clique em Live na guia aquisição para exibir a imagem desse canal na tela. Em seguida, usando o botão de clique esquerdo do mouse, ajuste as barras deslizantes para definir o intervalo de sinal fluorescente emitido que é coletado, a potência do laser (barra deslizante o título de lasers ), ganho (Mestre) e offset digital no Guia canais para visualizar as células rotuladas por confetes na tela. Os valores de diretriz para todos esses parâmetros são fornecidos no arquivo suplementar 1B-D para RFP, YFP e CFP. Complete este passo para cada canal, um por um.
      Nota: para garantir que o sinal visualizado não é autofluorescência, uma seção de um animal CRE negativo pode ser usada como um controle negativo durante esta etapa. Como T-PMT foi combinado com o laser RFP (passo 7.2.1) ajustando o poder do laser para RFP afetará o sinal de T-PMT.
   2. Ajuste o tamanho do furo de pino para aumentar a deteção da fluorescência se necessário.
      Nota: quanto maior o tamanho do furo de pino, o sinal mais fluorescente é detectado na direção Z. Uma diretriz para isso é a unidade arejada resultante (UA), que é automaticamente indicada abaixo do indicador pinhole , onde 1 au é ideal para a qualidade de imagem. Aumentar a UA muito prejudicará a análise posterior, pois torna-se mais difícil distinguir as células individuais na direção Z).
   3. Verifique a configuração para garantir que os sinais gravados não se sobreponham.
      1. Clique nas caixas de seleção na guia canais para selecionar todos os três canais e pressione o botão snap na guia aquisição .
      2. Na imagem resultante, role entre os canais exibidos clicando nas caixas de destaque azul acima de cada canal listado na guia dimensões . Verifique manualmente a sobreposição entre os canais na tela. Se os sinais se sobrepõem (por exemplo, se cada célula vermelha também é amarela), retorne ao início da etapa 7,3 e repita, ajustando os parâmetros para os canais sobrepostos até que eles possam ser distinguidos uns dos outros. Assegure-se de que para cada etiqueta (isto é, RFP, YFP, ou CFP), pelo menos um clone possa ser visualizado que contenha somente um dos rótulos.
4. Adquira a imagem.
   1. Selecione a guia modo de aquisição para especificar a qualidade da imagem usando o tamanho do quadro, velocidadee valores de número de média .
      Observação: as configurações típicas para esses experimentos são indicadas no arquivo suplementar 1a. Reduzindo o zoom o título da área de digitalização dentro da guia aquisição pode aumentar o campo de visão sem alterar o tempo necessário para a aquisição de imagem.
   2. Na guia aquisição , no título aquisição dimensional , clique na caixa de seleção Z-Stack . Abra a guia z-Stack para definir o intervalo entre as imagens na direção z para 2,5 μm.
   3. Para definir os locais corretos, selecione apenas o RFP/T-PMT na guia canais e clique em Live para visualizar os clones vermelhos com um contorno visível do tecido. Defina a primeira e última fatia clicando em definir primeiro e defina Last na fatia correspondente, ajustando o foco usando o botão do microscópio.
   4. Clique na guia digitalização de mosaico dentro da guia aquisição e insira o número total de blocos nas direções horizontais e verticais nas respectivas caixas.
   5. Para captura de imagem, selecione todos os canais desejados na guia canais e clique no botão snap para coletar uma única imagem ou o botão Iniciar experimento para coletar uma varredura Z Stack/Tile.
5. Depois que a imagem tiver sido adquirida, clique em arquivo e salvar como e salvar a imagem em um tipo de arquivo que preserva o máximo de informações sobre as configurações de microscópio possível, para permitir posterior revisão e reutilização.
6. Realize análises adicionais usando o software de análise de imagem.

Resultados

Para rotular condrócitos na cartilagem epifisária e visualizar sua expansão clonal com a idade usando a administração de tamoxifeno em P1, Col2CreERT: camundongos confetti foram rotulados, e seus membros posteriores foram coletados em P27. A seção central foi determinada pela visualização do ligamento cruzado (Figura 2a) e os clones na placa de crescimento tibial proximal foram visualizados (Figura 2b). Estes dados mostram que as pilhas individuais que eram Col2-positive em P1 e se tornaram etiquetadas com as proteínas fluorescentes do confetti quando o tamoxifeno foi administrado, submeteu-se à expansão clonal, e remanesceu subseqüentemente na placa do crescimento até P27. As alterações iniciais na expansão clonal de um ponto de tempo de desenvolvimento semelhante podem ser observadas na Figura 1 de uma publicação recente¹³.

Para dar um exemplo do sinal fluorescente após o armazenamento a longo prazo (etapa 5,5), a seção coletada foi armazenada imediatamente após (veja a Figura 2a, B) por mais de 3 anos antes que estêve preparada e imaged (Figura 2C, vídeo 1) .

Para demonstrar alguns problemas comuns com o protocolo, uma seção quebrada durante a etapa de criseccionamento é mostrada na Figura 3a. A região da seção (entre a placa de crescimento e a cartilagem articular) Expandida na Figura 3B mostra que esta dose de tamoxifeno leva a um nível tão elevado de recombinação nesta área que impediria a análise clonal.

Figura 1: visão geral experimental. Fluxograma Resumindo os principais estágios do método. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: confetti imagens de um Col2CreERT: confetti mouse. (A) amostras de Col2CreERT: camundongos confetes foram processados sem descalcificação ou a etapa de armazenamento a longo prazo. A seção central foi localizada usando o ligamento cruzado como um marcador. Esta imagem foi visualizada usando uma varredura da telha após ter detectado RFP com T-PMT (barra da escala = 300 μm). (B) colunas clonais são mostradas dentro da tíbia proximal da placa de crescimento visível em (a), após a reconstrução 3D. (C) uma corrediça adjacente àquela mostrada em (a) e (B) prendida no armazenamento a longo prazo por mais de 3 anos foi processada para a imagem latente e a reconstrução 3D. RFP, YFP e CFP são mostrados em (B) e (C) (barras de escala = 50 μm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: desafios ao usar o método. (A) aslinhas tracejadas brancas descrevem uma divisão na seção através da placa de crescimento de Col2CreERT: ratos confetti (barra de escala = 50 μm). A área dentro da caixa branca é mostrada em (B) (barra de escala = 25 μm). O RFP, o YFP e o CFP são mostrados em ambos os painéis, e o canal de luz laser não refletido (T-PMT) também é mostrado em (a) para visualizar o tecido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: reconstrução tridimensional de uma placa de crescimento de Col2CreERT: confetti mouse. Uma corrediça preparada de um Col2CreERT: o rato do confetti foi prendido no armazenamento a longo prazo após o seccionamento por mais de 3 anos, e processado então para a imagem latente. A reconstrução tridimensional foi conduzida automaticamente com o software da análise de imagem e exportada como um vídeo. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.

Arquivo complementar 1: set-up típico do microscópio confocal. (A) osprincipais controles presentes na aba de aquisição . (B−D) os parâmetros do laser, o comprimento de onda da excitação, e a escala de comprimentos de onda gravados da emissão são mostrados para três proteínas fluorescentes do confetti. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O modelo de confetti foi utilizado extensivamente para o estudo dos^{tecidos de cartilagem}mineralizada^12,13,14 e para descrever o protocolo otimizado. Os ratos² do confetti com uma cópia ou duas cópias do ALELO do R26-confetti podem ser usados para produzir e experimentos. Recombinação em camundongos com um alelo da construção Brainbow 2,1 dará quatro rótulos potenciais: proteína fluorescente vermelha (RFP, citoplasmática), proteína fluorescente amarela (YFP, citoplasmática), proteína fluorescente ciano (CFP, membrana localizada) e verde proteína fluorescente (GFP, núcleo-localizado), enquanto recombinação nos camundongos confetti homozygous (ou seja, contendo duas cópias da construção Brainbow 2,1) dará 10 saídas de cor possíveis (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + CFP, RFP + GFP, YFP + YFP, YFP + CFP, YFP + GFP, PCP + PCP, PCP + GFP, GFP + GFP). Entretanto, porque os eventos da excisão e da inversão do ADN ocorrem em uma maneira estocástico, o recombinação para produzir GFP ocorre em somente uma fração pequena das pilhas, como relatado previamente², e difere aparentemente pelo Cell-Type ou pela linha de CRE usada^{2, 12,13}. Assim, dada a baixa ocorrência de eventos de recombinação que levam à expressão do GFP, seis saídas de cor são as mais comuns em camundongos homozzygous confetti.

Uma consideração importante ao planejar experimentos com o mouse Confetti é encontrar uma cepa CRE adequada. Primeiro, uma vez que o alelo confetti tem vários sites loxP, um evento de recombinação não exclui um segundo⁴. Isso significa que se uma célula é rotulada e divide para produzir um clone de uma cor, um segundo evento de recombinação em uma de suas células filhas geraria uma cor diferente, mascarando assim a expansão clonal verdadeira. Assim, cepas não inducible CRE, onde a enzima está sempre ativa se o promotor correspondente está ativo, não são aconselháveis. Em segundo, em algumas tensões a expressão de CRE recombinase vem frequentemente à custa de uma proteína endógena, criando desse modo um phenotype do seus próprios (por exemplo, para o Prg4-GFPCreERT2 batida-na tensão do rato em que os ratos abrigam dois alelos do CRE¹⁵), assim uma única cópia do alelo CRE é desejável. Em todos os experimentos descritos, uma única cópia do Col2CreERT¹⁶ foi realizada tanto pelo macho quanto pelo pai feminino para gerar Col2CreERT: ratos confetes, conforme descrito¹³. Em seguida, a especificidade da linha CRE para o tipo de célula de interesse é uma consideração importante. Por exemplo, Col2CreERT é chondrocyte-specific, mas etiqueta diversas populações distintas dos condrócitos na cartilagem pós-natal adiantada¹⁷. Finalmente, a atividade de diferentes cepas de CRE pode mudar consideravelmente com a idade animal, pois a atividade endógena do promotor utilizado para alterações da expressão CRE, mesmo em células do mesmo tipo (por exemplo, Prg4-GFPCreERT2, que pode exigir um aumento número de doses de tamoxifeno para rotular células da zona superficial como camundongos com¹⁵anos de idade).

O número de pilhas etiquetadas será refletido pela quantidade de tamoxifeno dado, assim que não é sempre desejável dar a dose máxima porque distinguir clones de se pode ser difícil. Porque a expressão CRE irá variar a regulação de diferentes promotores, bem como com a idade, a dosagem de tamoxifeno terá de ser ajustado para otimizar a rotulagem. É importante notar que as células não são imediatamente fluorescentes ao desencadear recombinação porque o tempo é necessário para que a recombinação ocorra e as proteínas fluorescentes resultantes se acumulem suficientemente para a imagem. Uma escala larga das horas (entre 24 − 72 h) é precisada, que parece ser influenciada pela linha de CRE, pelo Cell-Type, e pela idade animal. Uma vez que o tamoxifeno pode ser biologicamente activo por muito tempo após a administração¹⁸ é sempre aconselhável verificar exaustivamente a eficiência de recombinação em cada modelo.

Durante a etapa da microscopia confocal, a excitação das proteínas fluorescentes do confetti exige a penetração do tecido pela luz do laser. Porque os tecidos diferentes têm propriedades diferentes, a luz do laser não pôde penetrar seções grossas de 160 μm de todos os tecidos. No entanto, essas seções grossas podem ser usadas para a cartilagem da placa de crescimento, como usado na Figura 2, Figura 3. Observe que cada microscópio é diferente e é improvável que as configurações descritas (arquivo complementar 1) funcionem perfeitamente sem pequenos ajustes. Um dos principais desafios é distinguir as diferentes proteínas fluorescentes para garantir que não haja contaminação de um canal para outro. Por exemplo, o sinal no canal YFP causado pela fluorescência proveniente do GFP se sobrepõe entre os canais YFP e RFP. Os canais do YFP e do CFP também devem ser cuidadosamente verificados. Isso pode ser feito de várias maneiras. Primeiramente, a escala da emissão de comprimentos de onda claros fluorescentes que são gravadas para cada proteína fluorescente pode ser estreitada. Em segundo lugar, ajustar a potência do laser em combinação com o ganho digital pode otimizar o sinal. Neste estudo estas etapas eram suficientes, mas confiam em um sinal fluorescente forte. Isto significa que, em teoria, o processamento de tecido ineficiente pode reduzir a atividade das proteínas fluorescentes, ou uma fonte fraca de luz laser pode prejudicar a separação de canais.

Uma das vantagens do mouse Confetti é que ele pode ser combinado com um grande número de cepas geneticamente mutantes que estão disponíveis para que o impacto de genes específicos na dinâmica clonal pode ser estudado^{10,11,12 ,13,14,19,20}, embora com algumas limitações. Por exemplo, a recombinação dos alelos confetes e o gene de interesse não podem ser separados ao usar mutantes baseados em CRE loxP combinados com rastreamento de linhagem clonal. No entanto, tais eventos de recombinação coincidindo podem ser efetivos^10,14,20. Por exemplo, esta possibilidade foi usada para explorar o número aumentado da pilha na zona de descanso dos ratos que seguem a ablação chondrocyte-específica pós-natal de TSC1 na placa²¹ do crescimento e revelaram a relação clonal entre estas pilhas sobre o tempo ¹³. Adicionalmente, a análise clonal tecido-específica que usa ratos do Confetti pode ser usada com os ratos do mutante do non-CRE loxp-baseados¹¹, e é igualmente possível combinar estas aproximações com^{8,9 farmacológicos ,13} e/ou modelos cirúrgicos⁸ para visualizar respostas clonais a outras perturbações funcionais. As oportunidades mais adicionais levantam-se ao combinar seções etiquetadas confetti com imunodetecção de proteínas endógenas pela imunofluorescência. Tal análise permite a identificação de células rastreadas e sua colocalização com um marcador conhecido. Com o método de fixação aqui descrito, é possível realizar a imunofluorescência e ainda visualizar a fluorescência das proteínas fluorescentes do confete^12,13. Entretanto, nos artigos mencionados, a recuperação do antígeno não foi exigida. Os métodos ásperos da recuperação do antígeno, tais como a ebulição no tampão do citrato, conduzem a uma perda completa da fluorescência do confetti. Embora as proteínas fluorescentes do confetti possam então ser detectadas usando anticorpos²², uma perda de identidade clonal pode ocorrer.

Em resumo, usar o modelo confetti para rotular células in vivo é uma ferramenta informativa para analisar o destino dessas células ao longo do tempo. O método descrito fornece uma maneira rápida e eficiente de Visualizar diretamente a expressão da proteína fluorescente em tecidos mineralizados.

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2,2-tiodietanol	Sigma	MKCF9328
lamínulas de cobertura de 60 mm de comprimento	Mendel-Glä zer	220588
Microscópio confocal de varredura a laser	Zeiss	LSM 710
Óleo de milho	Sigma	C8267
Cryomold (padrão)	Sakura	4557
Cryostat	Thermo	Modelo: NX70
Lâminas de criostato descartáveis	Histolab	207500014	Especificamente para uso com tecidos duros
EDTA	Scharlan	AC0960005P
Concentrado de formaldeído	Merck	8.18708.1000
Frascos de vidro	Sigma	V7130	Pode ser usado para diluição de tamoxifeno e para fixação e processamento de tecidos
Software Imaris	Oxford Instruments	N/A	Software de análise de imagem para reconstrução 3D
Isoflurano	Zoetis	11-8162
OCT	Sakura	102094-104
Pipeta Pasteur	Sarstedt	86.1171
PBS	Gibco	14200075
Hidróxido de sódio	Merck	1.06498.1000
Sacarose	Sigma	S0389
Superfrost UltraPlus slides	Mendel-Glä software Zeiss	Freeware de
Tamoxifen		T5648
Zen2		para a microscopia confocal da exploração do laser