Este artigo apresenta um protocolo de centrifugação de velocidade diferencial em combinação com a centrífuga de gradiente de densidade para separar as mitocôndrias dos tecidos humanos de câncer de ovário e controlar os tecidos ovarianos para análise quantitativa de proteômica, resultando em uma amostra mitocondrial de alta qualidade e análise proteômica quantitativa de alta produção e alta reprodutibilidade de um proteoma mitocondrial de câncer de ovário humano.
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Artigo de método
Preparação das mitocôndrias dos tecidos do câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos para análise quantitativa proteômica
Neste artigo
Resumo
Resumo
O câncer de ovário é um câncer ginecológico comum com alta mortalidade, mas mecanismo molecular pouco claro. A maioria dos cânceres de ovário são diagnosticados em estágio avançado, o que dificulta seriamente a terapia. As mudanças mitocondriais são uma marca registrada dos cânceres de ovário humano, e as mitocôndrias são os centros de metabolismo energético, sinalização celular e estresse oxidativo. Insights aprofundados sobre as mudanças do proteoma mitocondrial em cânceres de ovário em comparação com o controle do tecido ovariano beneficiarão a compreensão aprofundada dos mecanismos moleculares do câncer de ovário e a descoberta de biomarcadores eficazes e confiáveis e alvos terapêuticos. Um método eficaz de preparação mitocondrial juntamente com uma tag isobaric para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) proteômica quantitativa são apresentados aqui para analisar o câncer de ovário humano e controlar proteomas mitocondriais, incluindo centrifugação de velocidade diferencial, centrifugação de gradiente de densidade, avaliação de qualidade de amostras mitocondriais, digestão de proteínas com trippsina, rotulagem de iTRAQ, fracionação de troca de cacionária forte (SCX), cromatografia líquida (LC), espectrometria de massa tandem (MS/ EM), análise de banco de dados e análise quantitativa de proteínas mitocondriais. Muitas proteínas foram identificadas com sucesso para maximizar a cobertura do proteoma mitocondrial do câncer de ovário humano e para alcançar o perfil de proteína mitocondrial expressa diferencialmente em cânceres de ovário humano.
Introdução
O câncer de ovário é um câncer ginecológico comum com alta mortalidade, mas claro mecanismo molecular1,2. A maioria dos cânceres de ovário são diagnosticados em estágio avançado, o que dificulta seriamente a terapia. As mudanças mitocondriais são uma marca registrada dos cânceres de ovário humano, e as mitocôndrias são os centros de metabolismo energético, sinalização celular e estresse oxidativo3,4,5,6,7. Insights aprofundados sobre as mudanças do ....
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Protocolo
Amostras de tecido ovariano, incluindo tecidos de câncer de ovário (n = 7) e controle normal tecidos ovarianos (n = 11) foram utilizados para este protocolo. O protocolo atual3,4,5 é aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Hospital Xiangya da Universidade Central do Sul, na China.
1. Preparação de mitocôndrias de tecidos humanos de câncer de ovário
- Prepare 250 mL do amortecedor mitocondrial da isolação misturando o mannitol de 210 mM, 70 mM sacarose, 100 mM cloreto de potássio (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diamina ácido tetraacético (EDTA),....
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Resultados
Houve uma diferença na preparação das mitocôndrias dos tecidos de câncer de ovário e controle dos tecidos ovarianos. Este estudo descobriu que era muito mais fácil preparar mitocôndrias de tecidos de câncer de ovário do que de controle tecidos ovarianos3,4. Algumas melhorias tiveram que ser feitas ao protocolo para a preparação das mitocôndrias dos tecidos ovarianos do controle. Primeiro, antes da homogeneização do tecido, era nec.......
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Discussão
Alterações mitocondriais são uma marca registrada do câncer de ovário. A preparação de amostras mitocondriais de alta qualidade do câncer de ovário humano e tecidos de controle para proteômica quantitativa em larga escala beneficia a compreensão aprofundada da função mitocondrial na patogênese do câncer de ovário e alterações na rede molecular mitocondrial, e ajuda a esclarecer seu mecanismo molecular para a descoberta subsequente da terapia alvo e biomarcadores eficazes com base em mitocôndrias4,.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Hunan Provincial Hundred Talent Plan (para X.Z.), o Xiangya Hospital Funds for Talent Introduction (to XZ), a National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 e 81272798 to XZ), as doações da China "863" Plan Projeto (Grant No. 2014AA020610-1 para XZ), e a Hunan Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 14JJ7008 to XZ). X.Z. concebeu o conceito para o presente manuscrito, obteve os dados de proteômica quantitativa iTRAQ de amostras de mitocôndrias, escreveu e revisou o manuscrito, coordenou o trabalho pertinente e foi responsável pelo apoio financeiro e correspondente Trabalho. H.L. preparou amostras de mi....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de ensaio de proteína BCA | Vazyme | E112 | é uma versão especial de 3 componentes de nossos populares reagentes BCA, otimizado para medir (A562nm) a concentração total de proteína de soluções de proteína diluída (0,5 a 20 microgramas/ml). |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Solarbio | A8020-5G | Fração de choque térmico, origem australiana, livre de protease, baixo ácido graxo, baixa IgG, pH 7, ≥ 98% |
| Centrifuge | XiangYi | TDZ4--WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | BioReagent, adequado para eletroforese, ≥ 98% (HPLC) (Sigma-Aldrich) |
| Ácido diamina tetracético (EDTA) | Sigma | 798681-100G | Anidro, fluxo livre, Redi-Dri, ≥ 98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-Dithiothreitol |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems (agora Thermo Fisher Scientific) | ||
| Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E0396-10G | BioXtra, ≥ 97 .0% |
| Homogeneizador | SilentShake | HYQ-3110 | |
| kit de reagentes iTRAQ | Applied Biosystems Applied Biosystems | iTRAQ Reagents– Guia de Referência Química, P/N 4351918A | |
| Centrífuga super-rápida de baixa temperatura | Eppendorf | 5424R | |
| Manitol | Macklin | M813424-100G | O manitol é um poliol (álcool polihídrico) produzido a partir da hidrogenação da frutose que funciona como adoçante, umectante e agente de volume. Possui baixa higroscopicidade e baixa solvência de óleo. |
| MASCOT motor de busca | Matrix Science, Londres, Reino Unido; versão 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-hidroxisuccinimida (SDT) | Sigma | 56480-25G | Purum, ≥ 97,0% (T) |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| Inibidor de protease de fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF) | Solarbio | P0100-1ML | PMSF é um inibidor de protease que reage com resíduos de serina para inibir tripsina, quimotripsina, trombina e papaína. |
| Cloreto de potássio | Macklin | P816354-25G | O cloreto de potássio, KCI, também conhecido como muriato de potássio e silvita, é um sólido cristalino incolor com um sabor salgado que derrete a 776° C (1420 DE). É solúvel em água, mas insolúvel em álcool. O cloreto de potássio é usado em fertilizantes, produtos farmacêuticos, fotografia e como substituto do sal. |
| Proteome Discover 1.4 | Matrix Science, Londres, Reino Unido | ||
| Membrana PVDF | Millipore | 05317 | É 1 rolo, 26,5 cm x 1,875 m, 0,45 µ m tamanho de poro, membrana de transferência hidrofóbica de PVDF com baixa fluorescência de fundo para western blotting. É compatível com sondas fluorescentes visíveis e infravermelhas. |
| Thermo Fisher Scientific | espectrómetro maciço de Q | ||
| É 5-μ m tamanho de partícula, comprimento 5cm × i.d. 4,6 mm (Supelco). | |||
| Ortovanadato de sódio (V) | Macklin | S817660-25G | O ortovanadato de sódio (Vanadato) é um inibidor competitivo geral das proteínas fosfotirosil fosfatases. A inibição pelo ortovanadato de sódio é reversível com a adição de EDTA ou por diluição. |
| Sucrose | Macklin | S824459-500G | Vetec grau de reagente, 99% |
| Thiourea | Sigma | 62-56-6 | ACS reagente, ≥ 99,0% |
| Tris base | Sigma | 10708976001 | base TRIS é útil na faixa de pH de 7,0-9,0. Tem um pKa de 8,1 a 25 graus C. |
| Tripsina (uso em cultura de células) | Gibco | 25200-056 | Esta formulação líquida de tripsina contém EDTA e vermelho de fenol. Gibco Tripsina-EDTA é feito de tripsina em pó, uma mistura irradiada de proteases derivadas do pâncreas suíno. Devido à sua força digestiva, a tripsina é amplamente utilizada para dissociação celular, passagem de cultura celular de rotina e dissociação de tecido primário. |
| Ureia | Sigma | U5378-100G | em pó, BioReagente, para biologia molecular, adequado para cultura celular |
Referências
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57(2017).
- Gadducci, A., et al.
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Reimpressões e permissões
