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Artigo de método

Isolamento e Cultura dos neurônios oculomotores, trochlear e motores espinhais de pré-natal Islmn:GFP Ratos Transgênicos

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DOI:

10.3791/60440

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12 de novembro de 2019

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1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este trabalho apresenta um protocolo para produzir culturas celulares homogêneas de neurônios motores oculomotores primários, trochlear e espinhais. Essas culturas podem ser usadas para análises comparativas das características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores oculares e espinhais.

Resumo

Neurônios oculomotores (CN3s) e neurônios trochlear (CN4s) apresentam notável resistência a doenças degenerativas do neurônio motor, como esclerose lateral amiotrófica (ELA) quando comparados aos neurônios motores espinhais (SMNs). A capacidade de isolar e cultura cn3s rato primário, CN4s, e SMNs proporcionaria uma abordagem para estudar os mecanismos subjacentes a esta vulnerabilidade seletiva. Até o momento, a maioria dos protocolos utiliza culturas géterogêneas celulares, que podem confundir a interpretação dos resultados experimentais. Para minimizar os problemas associados às populações de células mistas, as culturas puras são indispensáveis. Aqui, o primeiro protocolo descreve em detalhes como purificar e cultivar eficientemente CN3s/CN4s ao lado de contrapartes de SMNs dos mesmos embriões usando o dia embrionário 11.5 (E11.5) IslMN:GFP embriões transgênicos do rato. O protocolo fornece detalhes sobre a dissecção e dissociação de tecidos, isolamento celular baseado em FACS e cultivo in vitro de células dos núcleos CN3/CN4 e SMN. Este protocolo adiciona um novo sistema de cultura CN3/CN4 in vitro aos protocolos existentes e, simultaneamente, fornece uma cultura SMN pura e de espécies combinadas para comparação. Análises com foco nas características morfológicas, celulares, moleculares e eletrofisiológicas dos neurônios motores são viáveis neste sistema de cultura. Este protocolo permitirá a pesquisa nos mecanismos que definem o desenvolvimento do neurônio motor, a vulnerabilidade seletiva, e a doença.

Introdução

A cultura dos neurônios motores primários é uma ferramenta poderosa que permite o estudo do desenvolvimento neuronal, função e susceptibilidade a estressores exógenos. As culturas dos neurônios motores são particularmente úteis para o estudo de doenças neurodegenerativas, como a esclerose lateral amiotrófica (ELA)1,2,cujos mecanismos de doença são incompletamente compreendidos. Curiosamente, apesar da morte celular significativa de neurônios motores espinhais (SMNs) em pacientes com ELA e camundongos modelo ALS, morte celular em neurônios oculomotores (CN3s) e neurônios trochlear (CN4s) são relativamente escassos1,3,4,5,6,7,8,9. Portanto, análises comparativas de culturas puras de CN3s/CN4s e SMNs poderiam fornecer pistas importantes sobre mecanismos subjacentes à vulnerabilidade relativa. Infelizmente, uma grande barreira para tais análises tem sido a incapacidade de crescer culturas purificadas desses neurônios motores.

Muitos protocolos foram descritos para a purificação de SMNs de modelos animais. A maioria desses protocolos utiliza centrifugação de gradiente de densidade10,11,12 e/ou p75NTR-técnicas de triagem de células baseadas em anticorpos13,14,15,16. A centrifugação do gradiente da densidade explora o tamanho maior de SMNs relativo a outras pilhas espinal, visto que o p75NTR é uma proteína extracellular expressada exclusivamente por SMNs na medula espinal. Quase 100% de culturas smn puras foram geradas por um ou ambos os protocolos11,12,14. No entanto, esses protocolos não têm sido bem-sucedidos na geração de culturas CN3/CN4 porque cn3s/CN4s não expressam p75NTR,e outros marcadores específicos do CN3/CN4 não foram identificados. Eles também são menores do que as SMNs e, portanto, mais difíceis de isolar com base no tamanho. Em vez disso, estudos in vitro de CN3s ou CN4s têm contado com a dissociada17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, e fatia27,28 culturas, que são compostas de tipos de células heterogêneas, e não existem protocolos para o isolamento e cultura dos CN3primários ou CN4s.

Aqui, um protocolo é descrito para a visualização, isolamento, purificação e cultivo de CN3s, CN4s e SMNs do mesmo dia embrionário 11,5 (E11,5) IslMN:GFP camundongos transgênicos29 (Figura 1, Figura 2A). IslMN:GFP rotula especificamente os neurônios motores com um GFP farnesylated que localiza a membrana celular. Este protocolo permite a comparação de espécies e idade-combinados de vários tipos de neurônios motores, a fim de elucidar mecanismos patológicos na doença do neurônio motor.

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Protocolo

Todos os experimentos que utilizam animais de laboratório foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório e com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso animal do Boston Children's Hospital.

1. Criação de acasalamentos cronometrados antes da dissecação

  1. Para gerar camundongos embrionários pré-natais para a colheita do neurônio motor, pesar cada rato fêmea e configurar acasalamento cronometrado entre adultos IslMN:GFP camundongos transgênicos 11,5 dias antes do dia de isolamento do neurônio. Com o objetivo de desenvolver este protocolo, foram utilizados 129S1/C57BL/6J IslMN:GFP, com idades compreendidas entre os 2 e os 9 meses, e o acasalamento cronometrado foi criado à noite.
  2. Examine camundongos fêmeas para plugues vaginais na manhã seguinte. Considere a data em que a ficha é identificada como dia embrionário (E) 0,5.
  3. Pesar camundongos fêmeas e examinar para filhotes usando ultra-som (ver Tabela de Materiais)entre E8,5-11. Verifique se há sinais de acasalamento bem sucedido.
    1. Confirme o acasalamento bem sucedido detectando o ganho de peso em camundongos fêmeas (geralmente >1.5 g em E9.5 se houver mais de 5 a 6 embriões).
    2. Confirmar visualmente embriões ultra-som. Os embriões são facilmente detectáveis por ultra-som após e9,5. Os ultra-sons são conduzidos somente nas fêmeas que ganharam o peso porque são mais frequentemente grávidos do que aquelas que não fazem.
      Nota: Os ratos fêmeas podem ganhar o peso para razões à excepção da gravidez, assim que o ganho de peso sozinho não é um indicador de confiança da gravidez. A confirmação do ultra-som impede o sacrifício desnecessário das fêmeas que não estão grávidas mas não é crucial se indisponível.

2. Condições de dissecação e preparação de instrumentos

  1. Realize todo o revestimento (exceto a limpeza ácida dos coverslips), preparação de mídia, dissociação de tecidos (exceto centrífuga e incubação) e trabalho cultural em uma capa de fluxo laminar para garantir a esterilidade dos neurônios motores embrionários e de mídia.
  2. Com atenção cuidadosa à técnica estéril, conduza a dissecção do tecido fora de uma capa de fluxo laminar com risco mínimo de contaminação.
  3. Esterilizar uma placa de dissecação, um par de tesouras microdissecting, um par de pinças de vestir o polegar, dois pares de pinças dumont #5, uma faca microdissecting, e uma colher perfurado moria mini imergindo em 70% de etanol antes de usar.

3. PDL/Revestimento de laminina de pratos/coverslips

Nota: A cultura dissociava os neurônios motores primários em 96 placas de poço, dependendo do número de células necessárias para a aplicação. As células podem ser imagemdas diretamente na placa de cultura do tecido sem o uso de coverslips se os poços são opticamente transparentes e as espessuras são compatíveis com imagens.

  1. Para aplicações que exigem coverslips, preparar acid-cleaned, esterilizado, e ar-secado coverslips pelo menos 2 dias antes do isolamento do neurônio como descrito anteriormente30. Lotes de coverslips podem ser preparados desta forma com bastante antecedência dos experimentos e podem ser armazenados até 6 meses sem impacto na qualidade experimental.
  2. Prepare uma solução de trabalho de 20 μg/mL poly D-lysine (PDL) em soline tamponado de fosfato (PBS) 2 dias antes do isolamento do neurônio.
    1. Aliquot PDL (1 mg/mL) com antecedência e armazenar a -20 °C como uma solução de estoque.
  3. Cubra a superfície de cada deslizamento de cobertura ou o poço da placa de cultura do tecido com solução de trabalho de solução PDL suficiente (por exemplo, 100 μL por poço em 96 placas de poço ou 500 μL por poço em 24 placas de poço com ou sem lábios). Incubar durante a noite em 37 °C.
  4. No dia seguinte, lave 3x com água esterilizada.
    1. Selar as placas com filme de parafina e armazenar as placas lavadas PDL revestido em 4 °C por até 1 mês, se eles são secos completamente após a lavagem final.
  5. Prepare uma solução de trabalho com 10 μL de lamina (1,1-1,2 mg/mL) em 1,2 mL da PBS.
    1. Estoques de laminina Aliquot (1,1-1,2 mg/mL) com antecedência e armazenam a -80 °C.
  6. Cubra a superfície de cada deslizamento de cobertura ou bem com solução de laminado suficiente para revestir uniformemente a superfície. Incubar por pelo menos 2 h a 37 °C antes do uso.
    Nota: Placas e lábios revestidos de laminadopodem ser armazenados até 1 semana a 37 °C, mas a laminina revestida na ré é preferida. Retire a laminado diretamente antes de revestimento30. Laminin não deve ser autorizado a secar. Se as placas devem ser armazenadas por mais de várias horas, elas devem ser embrulhadas em filme de parafina.

4. Preparação de dissecação, mídia de cultura do neurônio motor e soluções de dissociação

Nota: Concentrações nos parênteses indicam as concentrações finais de cada reagente.

  1. Prepare o meio de dissecação.
    1. Descongele o soro de cavalo inativado de calor durante a noite a 4 °C, prepare 1 mL aliquots e guarde a -20 °C. Descongele alíquotas na RT diretamente antes de usar.
    2. Armazenar B27-suplemento (50x) em 1 mL adiantos a -20 °C. Descongele alíquotas na RT imediatamente antes do uso. Evite ciclos de congelamento/degelo.
    3. Armazenar suplemento de glutamina (100x) a 4 °C ou -20 °C. Divida em 0,5 mL aliquots se armazenar a -20 °C.
    4. Armazenar penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) em 1 mL adiantos a -20 °C. Descongele alíquotas na RT imediatamente antes do uso.
    5. Para tornar a dissecação média, misture 9,4 mL de Hibernate E com 200 μL de soro de cavalo (2%), 200 μL de suplemento 50x B27 (1x), 100 μL de suplemento de glutamina 100x (1x) (por exemplo, GlutaMAX) e 100 μL de 10.000 u/mL penicilina-streptomicia (100 U/mL). Use este meio para coletar tecidos dissecados e fazer a suspensão final de pilhas dissociadas.
    6. Adicione 500 μL do meio de dissecação a tubos individuais de microcentrífuga de 1,7 mL para a coleta de tecidos no dia anterior ao isolamento do neurônio. Prepare um tubo para cada tipo de tecido que será coletado (por exemplo, controle positivo, controle negativo, CN3/CN4, SMN) e guarde a 4 °C antes do uso.
    7. Combine 49 mL de hibernar e mídia de baixa fluorescência com 1 mL de suplemento B27 (1x) e preencher uma placa de 24 poços com este meio (2 mL / bem) um dia antes do isolamento do neurônio. Use este prato para coletar embriões de camundongos. Guarde a 4°C antes do uso.
  2. Prepare o meio da cultura do neurônio motor.
    1. Prepare 250 μL aliquots de 25 mM 2-mercaptoethanol no meio L15 de Leibovitz. Armazenar a -20 °C.
    2. Gerar 5 μL alíquotas de 100 μg/mL soluções de BDNF, CNTF e GDNF diluídos em água esterilizada. Armazenar a -80 °C e descongelar alíquos na RT imediatamente antes do uso.
    3. Prepare a solução de forskolin de 10 mM adicionando 64 μL de dimetil sulfoxida (DMSO) a 5 mg (1,0670 μM) de forskolin e vórtice bem para dissolver completamente. Em seguida, adicione a água esterilizada (1.003 mL) para a solução DMSO e vórtice bem. Armazenar 12 μL alíquotas de 10 mM forskolin a -20 °C e descongelar alíquos em RT imediatamente antes do uso.
    4. Prepare 12 μL aliquots de 100 mm isobutylmethylxanthine (IBMX) diluído em DMSO. Armazenar a -20 °C e descongelar alíquos na RT imediatamente antes do uso.
    5. Para tornar o meio da cultura do neurônio motor, misture 9,4 mL de médio neurobasal com 200 μL de soro de cavalo (2%), 200 μL de suplemento 50x B27 (1x), 100 μL de suplemento de glutamina 100x (1x), 100 μL de 10.000 U/m: penicilina-estreptomicina (100 U/mL) e 20 μL de 25 mM 2-mercaptoethanol (50 μM), de preferência diretamente antes do uso. Esta etapa pode ser realizada até 1 dia antes do isolamento do neurônio.
    6. Pouco antes do uso, adicione 1 μL cada um de 100 μg/mL BDNF (10 ng/mL), CNTF (10 ng/mL) e GDNF (10 ng/mL) e 10 μL de 10 mM forskolin (10 μM) e 10 μL de 100 mMMIBMIbmX (100 μM) ao meio de cultura do neurônio motor. Pré-aqueça o meio a 37 °C.
  3. Prepare as soluções de dissociação.
    1. Prepare a solução de papaina (20 u/mL papain e 0,005% DNase) e uma solução inibidora albumina-ovomucoide (1 mg/mL inibidor ovomucoid, 1mg/mL albumina e 0,005% DNase) seguindo as instruções do fabricante.
    2. Prepare 500 μL aliquots de cada um dos inibidores ovomucoides e soluções de papain e armazenar a -80 °C. Descongele alíquos a 37 °C imediatamente antes do uso.

5. Discção do cérebro central e da medula espinhal

Nota: Realize todas as seguintes etapas, exceto para os passos 5.1.1-5.1.3 e 5.1.5-5.1.6 um estómicroscópio de dissecção de dessecção de fluorescência. O tempo total de dissecação por experimento é tipicamente de 3 a 5 h, dependendo da proficiência na técnica de dissecação e do número de neurônios motores necessários para cada experimento.

  1. Dissecção do midbrain ventral
    1. Eutanásia um rato grávido aproximadamente 11.5 dias postfertilization pelo gás do dióxido de carbono e pela deslocação cervical.
    2. Pulverizar o abdômen completamente com etanol e remover o útero usando tesoura de microdisseca estéril e fórceps de vestir o polegar. Lave o útero brevemente em PBS estéril, em seguida, transferir para a placa de dissecação cheia de PBS estéril pré-refrigerados.
    3. Retire o IslMN:GFP-embriões positivos cuidadosamente do útero usando tesoura supressão estéril, pinças de vestir o polegar e as pinças de #5 Dumont em PBS estéreis gelados a luz brilhante do microscópio. Usando uma colher estéril moria mini-perfurado, transferir cada embrião para um poço separado de uma placa de 24 poços cheio sem hibernação pré-refrigeradas-E médio de baixa fluorescência complementada com 1x B27. Mantenha a placa de 24 poços no gelo.
    4. Transfira um embrião para uma placa de dissecação estéril e cubra-o completamente com a solução de sal equilibrado de Hank (HBSS) estéril gelado.
    5. Certifique-se de que as etapas de dissecação sejam realizadas a iluminação do microscópio de isotiocianato (FITC) de fluorescenina (FITC). Usando uma pinça, retire a cauda e a face do embrião sem danificar o midbrain(Figura 2Ba). Coloque o embrião propenso com membros escarranchados por baixo e cauda apontando para a frente do microscópio, em direção ao dessetor (indicado por um asterisco, Figura 2Bb).
    6. Usando pinças, fenda abrir o telhado do ventrículo quarto, a fim de gerar uma pequena abertura. Use esta abertura para ligar pinças no espaço criado entre o quarto ventrículo e seu telhado. Dissecar ao longo da superfície dorsal do rostral embrião para o córtex e lateral para a placa do piso e coluna motora (Figura 2Ca,b). Abra o tecido dissecado de forma aberta para revelar os núcleos CN3 e CN4 positivos da GFP.
      Nota: Um pequeno pedaço de tecido do midbrain ventral contendo mesenchyme, CN3 e CN4 agora será exposto.
    7. Separe cuidadosamente o midbrain ventral do embrião e retire o tecido meningeal usando pinças e uma faca de microdissecting. Dissecar os núcleos bilaterais GFP-positivos CN3 e CN4 longe da placa de assoalho e do outro tecido circunvizinho GFP-negativo usando pinças e uma faca microdissecting(figura 2D). Maximizar o número de neurônios motores GFP-positivos no tecido extisizado, mas evite tocá-los ou danificá-los.
    8. Se for desejada uma coleção de núcleos CN3 e CN4 separados, corte ao longo da linha média desses dois núcleos (linha pontilhada amarela na Figura 2D). Usando uma pipeta P1000, recolher o tecido do cérebro médio ventral dissecado com HBSS mínimo e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga rotulado de 1,7 mL preenchido com disseção média (ver passo 4.1.5). Guarde no gelo até a dissociação.
    9. Continue reunindo midbrains ventral de embriões adicionais no mesmo tubo até que o número total atenda à exigência experimental (consulte o passo 8 para números de células ideais).
      Nota: Uma coleção agrupada de pelo menos 10 midbrains ventral produzindo aproximadamente 1 x 104 neurônios motores CN3/CN4 é recomendada porque os tecidos estão sujeitos a estresse durante a dissociação e classificação.
  2. Dissecção da medula espinhal ventral
    1. Mantenha o embrião propenso com a cabeça voltada para a frente do microscópio, em direção ao dessetor. Segure o embrião com um par de pinças e insira a ponta do outro par de pinças na parte caudal fechada do quarto ventrículo.
    2. Abra o resto do cérebro traseiro e da medula espinhal dorsalmente sobre toda a extensão rostrocaudal do embrião. Aberto cortando o tecido dorsal, a partir do quarto ventrículo e trabalhando em direção ao canal central da medula espinhal caudal usando as fórceps como tesoura (Figura 2Ca,b). Tome cuidado para evitar tocar ou danificar a medula espinhal ventral durante este procedimento.
    3. Segure o embrião com um par de pinças e beliscar a aba do tecido dorsal de cada lado com o outro par de pinças (Figura 2Ea, b).
      Nota: Os tecidos dorsais extirridos contêm pele dorsal, mesenchyme, gânglios de raiz dorsal (DRGs), cérebro dorsal e medula espinhal. Remova o máximo possível desses tecidos sem danificar os núcleos de SMN, porque eles são adesivos e podem prender SMNs durante a filtragem ou causar entupimento durante a classificação da FACS.
    4. Retire a medula espinhal ventral usando a faca de microdissese para perfurar diretamente abaixo do GFP positivo SMN. Levante a medula espinhal ventral com movimentos de serra em ambos os lados (Figura 2Fa,b). Corte a medula espinhal ventral flutuante transversalmente acima do C1, onde os primeiros projetos anteriores positivos do CHIFRE GFP positivos(Figura 2G). Além disso, corte transversalmente no limite superior do membro inferior (Figura 2G). Retire a parte cervical (C1)-lombar (L2-L3) da medula espinhal ventral após este procedimento.
    5. Coloque a medula espinhal ventral lado dorsal para cima e segure pressionando o tecido GFP-negativo entre as colunas GFP-positivo SMN com um par de pinças. Retire o restante ligado mesenchyme, DRGs, e medula espinhal dorsal, aparando ambos os lados da coluna GFP-positivo SMN com a faca de microdissese (Figura 2H). Tome cuidado para maximizar os neurônios motores GFP-positivos sem danificá-los.
    6. Usando uma pipeta P1000, colete o tecido da medula espinhal ventral dissecado com HBSS mínimo e coloque no tubo de microcentrífuga de 1,7 mL rotulado por SMN preenchido com disseção média. Guarde no gelo até a dissociação. Continue reunindo medulas espinhais ventral de embriões adicionais no mesmo tubo até que o número total atenda aos requisitos experimentais.
      Nota: A coleta de pelo menos três medulas espinhais ventrais que produzem aproximadamente 2,1 x 104 SMN é recomendada porque os tecidos estão sujeitos a estresse durante a dissociação e classificação.
    7. Coletar neurônios motores faciais e extremidades do IslMN: embriões de camundongos GFP como controles GFP-positivos e GFP-negativos para triagem celular ativada por fluorescência (FACS), respectivamente. As extremidades são GFP-negativas porque os axônios GFP-positivos dos SMNs não estenderam ainda nas extremidades nesta idade embrionária.

6. Dissociação do tecido

Nota: O tempo total de dissociação é tipicamente de 1,5 h por experimento.

  1. Papain a quente e solução inibidora albumina-ovomucoide alíquotas a 37 °C 30 min antes da dissociação.
  2. Gire brevemente para baixo tecidos microdissecados em uma baixa velocidade.
  3. Usando uma pipeta P100, retire cuidadosamente o máximo de Hibernate E possível, sem aspirar tecidos.
    Nota: Certifique-se de remover todos os resíduos Hibernate E após esta etapa para evitar reduzir a eficácia da dissociação papain na próxima etapa.
  4. Adicione o volume apropriado de solução de papaina(Tabela 1)a cada um dos tubos de microcentrírífuga de 1,7 mL contendo as amostras de tecido microdissecado.
    Nota: O volume apropriado de papain para a dissociação foi determinado a fim de maximizar a dissociação efetiva, minimizando o estresse nas células.
  5. Triturar suavemente 8x com uma pipeta P200. Executar todos os passos de trituração suavemente para preservar a viabilidade do neurônio motor.
  6. Incubar os tubos que contêm os tecidos por 30 min a 37 °C, agitando por dedo flicking 10x cada 10 min. Gentilmente triturar cada suspensão 8x com uma pipeta P200 após a incubação. Desça as células a 300 x g por 5 min.
  7. Para garantir a eficácia da inibição ovomucoiid na próxima etapa, use uma pipeta P1000 para remover e descartar o máximo possível de supernatant sem aspirar os tecidos.
  8. Resuspenda as pelotas no volume apropriado de solução inibidora albumina-ovomucoide(Tabela 1)triturando suavemente 8x com uma pipeta P200.
  9. Espere por 2 min para permitir que todos os pedaços restantes de tecido não dissociado para resolver para o fundo do tubo.
  10. Colete o máximo possível de supernatant sem aspirar tecidos não dissociados usando uma pipeta P200. Transfira o supernatant para tubos de microcentrífuga de 1,7 mL frescos.
  11. Se alguns pedaços de tecido permanecem não dissociados após o passo 6.10, repita passos 6.8-6.10 para os tecidos não dissociados que permanecem nos tubos de microcentrífuga original de 1,7 mL para maximizar o rendimento final de células dissociadas, minimizando o estresse nas células dissociado anteriormente, contido no supernatant da etapa 6.10.
  12. Desça as células a 300 x g por 5 min. Retire e descarte cuidadosamente o supernatant usando uma pipeta P1000.
  13. Resuspenda a pelota no volume apropriado de meio de dissecação(Tabela 1)canalizando 8x usando uma pipeta P1000. O volume apropriado de suspensão final foi determinado para que a densidade celular não exceda 107 células/mL, o que pode bloquear o fluxo da máquina de citometria de fluxo, mas também para que as células não sejam excessivamente diluídas, o que resulta em uma velocidade de classificação retardada.
  14. Filtrar as suspensões através de filtros de células de 70 μm para eliminar quaisquer grandes grupos ou tecido não digerido. Transfira as suspensões para tubos de teste de poliestireno de fundo redondo de 5 mL e guarde no gelo até que seja necessário.

7. Triagem celular ativada por fluorescência (FACS)

Nota: Este protocolo foi otimizado usando um classificador FACS equipado com um laser violeta de 15 mw 405 nm, um laser azul de 100 mw 488 nm, um laser laranja de 75 mw 594 nm e um laser vermelho de 40 mw 640 nm. As células foram classificadas como fluido de bainha em PBS estéreis condições assépticas através de um bico de 100 μm. Para minimizar o estresse celular, a taxa de fluxo foi definida como uma pressão amostral de 1 a 3, de tal forma que foram adquiridos um máximo de 1.000 a 4.000 eventos por segundo. O tempo total da FACS é tipicamente de 1 a 2 h por experimento.

  1. Configurar tensões para a frente e para o lado dispersar para que a população celular pode ser visualizado corretamente. A configuração de tensões apropriadas para a classificação celular é complexa e requer um operador facs experiente.
  2. Para distinguir diferentes populações celulares, as células do lote com base no tamanho determinado pela Área de Dispersão Avançada (FSC-A) versus complexidade interna, conforme determinado pela Área de Dispersão Lateral (SSC-A). Desenhe um portão em torno das células vivas, como indicado na Figura 3Aa e Figura Ba para excluir detritos e células mortas. Agrupar as células dentro da região fechada como população 1 (P1).
  3. Para excluir grupos celulares e dobradas, as células P1 do lote em seguida com base na largura de dispersão lateral (SSC-W) versus o SSC-A. Portão da população de células individuais como população 2 (P2) (Figura 3Ab e Figura Bb).
  4. Células P2 do lote baseadas na largura dianteira da dispersão (FSC-W) contra o FSC-A e portam a população de únicas pilhas como a população 3 (P3) (figura 3Ac e figura Bc).
    NOTA: O uso de dois portões consecutivos em 7,3 e 7,4 exclui grupos celulares e dobradas (FSC-W alto e fsc-a alta).
  5. Células Gate P3 com base em GFP versus alofitacina (APC). O canal APC detecta a autofluorescência. Gating neste canal evita capturar células autofluorescentes. Use células GFP-negativas para ajustar a tensão para canais fluorescentes FITC/GFP. Idealmente, portões de posição para essas populações celulares em torno de 102. Selecione limites de portão para gfp-positivo população 4 (P4) individualmente para cada tipo de neurônio motor (Figura 3Anúncio e Figura Bd).
    Nota: Defina o portão GFP muito maior para SMNs do que para CN3s/CN4s, a fim de obter uma cultura pura (Figura 3Anúncio e Figura Bd). Uma porta mais baixa do GFP para culturas de SMN conduz à contaminação das culturas por neurônios do glia e do non-motor. Isto é provável porque há expressão gfp de baixo nível em alguns neurônios glia e não-motor devido a um promotor com vazamento. A porcentagem de células GFP-positivas em comparação com o total de células é tipicamente de 0,5 a 1,5% para CN3s/CN4s e 1,5 a 2,5% para SMNs. Se a dissecação foi bem sucedida, esses números podem ser usados como referência para determinar a posição apropriada para o portão POSITIVO GFP (Figura 3Ae e Figura Seja).
  6. Executar FACS de acordo com o protocolo do fabricante. Coletar células P4 em tubos de microcentrífuga de 1,7 mL frescos preenchidos com 500 μL de meio de cultura do neurônio motor. Guarde no gelo até o revestimento.
    Nota: Embora as células possam ser classificadas diretamente nos poços, isso resulta em um número desigual de células por poço. Classifique as células em tubos de microcentrífuga de 1,75 mL e, em seguida, placa manualmente, a fim de alcançar uma distribuição de revestimento mais uniforme.

8. Cultura dos Neurônios Motores Primários Purificados

  1. As suspensões cn3/CN4 e SMN isoladas pela FACS com o meio de cultura do neurônio motor pré-aqueçam a 37 °C a densidades de 5 x 103 e 1 x 104 células/mL, respectivamente.
    Nota: Um embrião E11.5 produz aproximadamente 1 x 103 CN3/CN4 e 7 x 103 SMN. No entanto, esses rendimentos dependem fortemente da pureza dos tecidos dissecados, do rigor da dissociação celular e do limite adequado dos portões gfp durante a FACS.
  2. Transfira 96 placas de poço pré-revestidas com PDL e laminina da incubadora de cultura de tecido de 37 °C para o capô de fluxo laminar e pirata de laminado laminado de cada poço. Use pratos e lábios covers imediatamente sem lavar.
  3. Adicione 200 μL de suspensões diluídas CN3/CN4 e SMN em cada poço de placas de poço sinie/96 revestidas de PDL/laminado. As densidades celulares finais devem ser de 1 x 103 e 2 x 103 células/poço para CN3/CN4 e SMN, respectivamente.
    Nota: A densidade inicial de revestimento de SMNs em 96 placas de poço (2 x 103 células/poço) é o dobro da cn3s/CN4s (1 x 103 células/poço) para obter números e densidades de neurônios motores finais semelhantes em 2 e 9 dias in vitro (DIV) (4-6 x 102 e 2-4 x 102 células por poço, respectivamente).
  4. Neurônios culturais em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2.
  5. Alimentar os neurônios a cada 5 dias, removendo metade da mídia antiga (100 μL) e substituindo com o mesmo volume de meio de cultura do neurônio motor fresco. Certifique-se de que os processos neuronais se tornem visíveis em 1 DIV e se tornem mais grossos e mais longos por 14 DIV(Figura 4). Corpos celulares neuronais tornam-se ampliados e tendem a se agregar em culturas de longo prazo, particularmente para SMNs (Figura 4).
    Nota: Realize todas as mudanças de médio e solução, deixando metade do volume médio original, a fim de evitar a desapego de células cultivadas. Isso inclui fixação e imunocitoquímica (ICC) etapas. Se todos os meios são removidos, não obstante como delicadamente, a maioria das pilhas destacarão e serão lavadas afastado.

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Resultados

O objetivo deste protocolo era purificar e cultura altamente tanto cn3s primários / CN4s e SMNs a longo prazo para permitir análises comparativas dos mecanismos subjacentes distúrbios do neurônio motor (ver Figura 1 e Figura 2 para visão geral).

Uma vez que os neurônios foram isolados com sucesso e crescidos na cultura, quase puro cn3 primário/cn4 e smn culturas foram o...

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Discussão

Historicamente, estudos in vitro de neurônios motores CN3 e/ou CN4 têm contado com culturas heterogêneas como dissociada17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26,e ...

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Divulgações

Os autores declaram nenhum conflito de interesses.

Agradecimentos

Agradecemos a Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, EUA) por instrução em técnicas de dissecação da SMN; O Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, a Immunology Division Flow Cytometry Facility da Harvard Medical School, o Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women's Hospital Flow Cytometry Core e Boston Children's Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, membros adicionais do laboratório de Engle e membros do consórcio do Projeto ALS para assistência técnica e discussão ponderada. Este estudo foi apoiado pelo Projeto ALS. Além disso, a R.F. foi financiada pela Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant No exterior e pela bolsa de treinamento do NIH Em Genetics T32 GM007748; J.J. foi apoiado pelo programa de treinamento NIH/NEI nas Bases Moleculares de Doenças Oculares (5T32EY007145-16) através do Schepens Eye Research Institute e pelo Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) através do Boston Children's Hospital; M.C.W foi apoiado pela NEI (5K08EY027850) e pela Children's Hospital Ofthalmology Foundation (Faculty Discovery Award); e.C.E. é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor 488-conjugado com cabra anti-rato IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110011:400
Alexa Fluor 594-conjugado F(ab')2 cabra anti-coelho IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-110721:400
B27 Suplemento (50x), sem soroThermo Fisher Scientific17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow CytometerBD Bioscience- Possui 4 sistemas de laser equipados com lasers de 405, 488, 594 e 640 nm.
BD Falcon 70μ m Filtros de células de nylonCORNING352350Para filtrar as células dissociantes antes do FACS.
Tubos de ensaio de fundo redondo BD Falcon com tampa de pressãoCORNING352054
BDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.Microplaca de cultura de células CYT-207
, 96 poços, PS, fundo F (poço de chaminé)Greiner Bio-One International655090Tentamos vários pratos de 96 poços e este foi o melhor para cultura e análises após os
vidros de cobertura circular ICC para microscopiaKarl Hecht & Assistente1001/14Utilizamos esta lamínula por a área ser grande (diâmetro: 14 mm).
CNTF HumanoProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-272
Ácido ciclopiazônico de Penicillium cyclopiumSigma-AldrichC1530CPA. Um dos estressores do ER.
4′,6-diamidino-2-fenilinodol (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306
Dimetil sulfóxidoSigma-AldrichD2650DMSO
Dumont #5 Fórceps Inox Tamanho da ponta 0,05 mm x 0,01 mm Pontas Biologie Instrumentocirúrgico RobozRS-5015
ForskolinThermo Fisher ScientificBP25205
GDNF HumanProSpec-Tany TechnoGene, Ltda.CYT-305
Suplemento GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050-061
Hanks' Solução salina balanceada (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175-095
Hibernate EBrainBitsHE
Hibernate E baixa fluorescênciaBrainBitsHELFA fluorescência que dificulta a observação das expressões GFP do embrião deve ser baixa.
Soro de cavalo, inativado pelo calor, origem neozelandesaThermo Fisher Scientific26050-070
IBMXTocris Cookson2845Isobutilmetilxantina
LamininaThermo Fisher Scientific23017-015
Leibovitz' s L15 médioFisher Scientific11415064
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Micro Tesoura de DissecaçãoRoboz Instrumento CirúrgicoRS-5913
Micro Faca 4.75" 1.7 mm x 27 mm lâminaRoboz Instrumento CirúrgicoRS-6272
Moria Mini Colher Perfuradade Ciências Finas10370-19
Anticorpo monoclonal de camundongo para β-tubulina neuronal classe III (TUBB3)BioLegend8012021:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti microscópio de fluorescência de células vivas e software ElementsNikon-Differentialimagens de contraste de interferência e imagens imunocitoquímicas das culturas de células foram capturadas com estes equipamentos
Ácido Nítrico 90%, Fumegante (ACS Certificado)Fisher ScientificA202-212Para enxaguar lamínulas
Olympus 1.7 mL Microtubos, TransparenteGenesee Scientific22-281Estes são os tubos que descrevemos "tubos de microcentrífuga de 1.7 mL" no contexto.
Sistema de dissociação de papaínaWorthington Biochemical CorpLK003150solução de papaína e solução de inibidor de alubumina-ovomucoide são preparadas a partir deste kit.
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-023
Poli D-lisina (PDL)MilliporeSigmaA-003-E
Anticorpo monoclonal de coelho para ilhota1Abcamab1095171:200
SMZ18 e SMZ1500 estereomicroscópios de zoom com DS-Ri1 câmeraNikon-Dissectionfoi realizada e imagens de embriões e tecidos dissecados são capturadas sob esses microscópios de fluorescência.
Encapsulante de silicone preto Sylgard 170 - kit A+B 0,9 kgDow Corning1696157Fazemos pratos de dissecação usando este kit.
Pratos tratados com TC, 100 mm x 20 mmGenesee Scientific25-202Fazemos pratos de dissecação usando este prato.
Pinça de Curativo Thum 4,5" Serrilhada 2,2 mm Largura da PontaRoboz Instrumento CirúrgicoRS-8100
Transdutor para LOGOQ e VETGE HealthcareL8-18i-RSPara ultrassom em camundongos fêmeas
Máquina de ultrassom veterináriaGE HealthcareLOGOQ e VETPara ultrassom em camundongos fêmeas
Microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM série 700 e Zen SoftwareCarl Zeiss-A imagem confocal do embrião foi capturada com esses equipamentos
Ferramentas

Referências

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