Classificação celular ativada pela fluorescência para o isolamento de populações celulares escleracianas

Resumo

Os corais criam ecossistemas biodiversos importantes para humanos e organismos marinhos. No entanto, ainda não entendemos todo o potencial e função de muitas células de coral. Aqui, apresentamos um protocolo desenvolvido para o isolamento, rotulagem e separação de populações de células de corais pedregosos.

Resumo

Recifes de coral estão sob ameaça devido a estressores antropogênicos. A resposta biológica dos corais a esses estressores pode ocorrer a nível celular, mas os mecanismos não são bem compreendidos. Para investigar a resposta dos corais aos estressores, precisamos de ferramentas para analisar as respostas celulares. Em particular, precisamos de ferramentas que facilitem a aplicação de ensaios funcionais para entender melhor como as populações celulares estão reagindo ao estresse. No presente estudo, utilizamos a triagem celular ativada por fluorescência (FACS) para isolar e separar diferentes populações celulares em corais pedregosos. Este protocolo inclui: (1) a separação dos tecidos de coral do esqueleto, (2) a criação de uma única suspensão celular, (3) rotular as células de coral usando vários marcadores para citometria de fluxo, e (4) estratégias de gating e classificação celular. Esse método permitirá que os pesquisadores trabalhem em corais no nível celular para análise, ensaios funcionais e estudos de expressão genética de diferentes populações celulares.

Introdução

Recifes de corais são um dos ecossistemas mais importantes da Terra. Eles facilitam a biodiversidade fornecendo habitats críticos para peixes e invertebrados e são cruciais para sustentar comunidades antropogênicas, fornecendo alimentos e meios de subsistência econômicas através do turismo¹. Como principal construtor de recifes de corais, o animal de coral (Phylum: Cnidaria) também auxilia as comunidades costeiras, criando grandes estruturas de carbonato de cálcio que mitigam os danos causados por ondas e tempestades².

Corais como adultos são animais sessil que hospedam uma ampla gama de parceiros endossímbios, incluindo vírus, arqueias, bactérias, protistas, fungos e, mais notavelmente, membros da família algal dinoflagellate Symbiodiniaceae³. Mudanças no ambiente podem causar desequilíbrios nesta comunidade, muitas vezes levando a surtos de doenças e branqueamento de corais em que os simbióticos Simbióticos Simbiodiniaceae são expulsos da colônia de corais, eliminando assim a principal fonte de nutrição para os corais. Ambos os cenários costumam causar a morte do hospedeiro coral^4,,5,6. Os efeitos dos estressores induzidos por antropogênicos, como as rápidas mudanças climáticas, estão acelerando os eventos de morte em massa de corais, levando a um declínio global dos recifes de coral⁷.

Recentemente, muitos métodos diferentes foram desenvolvidos para ajudar a mitigar a perda de recifes de coral. Esses métodos incluem o não planejamento de corais nos recifes existentes, a travessia genética usando genótipos termicamente tolerantes e a manipulação celular das comunidades microbianas e simbióticas hospedadas dentro do coral^8,,9. Apesar desses esforços, muito ainda é desconhecido sobre a diversidade celular coral e a função celular^10,11,12,13. Uma compreensão completa da diversidade do tipo celular coral e da função celular é necessária para entender como o organismo coral se comporta sob condições normativas e estressantes. Os esforços para maximizar a eficiência de restauração e preservação se beneficiarão de uma compreensão aprimorada de como a diversidade celular e a função genética são acopladas.

Trabalhos anteriores sobre diversidade e função celular tem focado principalmente em estudos histológicos e amostragem de RNA de tecido inteiro^{14,,15,,16,,17}. Para obter maior detalhe sobre a função específica do tipo celular nos corais, é necessário que haja métodos para o isolamento de populações específicas de células de corais vivos. Isso tem sido feito com sucesso em organismos de modelos não clássicos por meio da tecnologia de citometria de fluxo ativada pela fluorescência (FACS)¹⁸. O FACS utiliza uma combinação de lasers sintonizados em diferentes comprimentos de onda para medir diferentes propriedades celulares endógenas no nível de célula única, como tamanho relativo da célula, granularidade celular e autofluorescência. Além disso, as células podem ser marcadas por compostos fluorescentes rotulados para medir propriedades específicas e desejadas^18,19.

Até agora, a aplicação da citometria de fluxo às células de coral tem sido principalmente para a análise de simbióticos simbiodiníacease e outras populações bacterianas utilizando sua forte autofluorescência natural^20,21,,22. O FACS também tem sido usado para estimar o tamanho do genoma do coral usando sinal de marcador de DNA fluorescente comparado com células do organismo modelo de referência^23,24. A aplicação eficiente do FACS fornece três ferramentas distintas que são úteis para estudos de biologia celular: 1) descrição morfológica e funcional de células únicas; 2) identificação, separação e isolamento de populações celulares específicas para estudos a jusante; e 3) a análise de ensaios funcionais no nível de célula única.

O desenvolvimento e a aplicação de vários marcadores fluorescentes exógenos para o estudo de células de coral permanece quase inexplorado. Tais marcadores podem incluir proteínas marcadas, substratos marcados para enzimas ou respostas fluorescentes a outros compostos. Esses marcadores podem ser usados para identificar tipos de células que possuem propriedades únicas, como destacar células que produzem quantidades variadas de um compartimento celular específico, como lysososomes. Um exemplo adicional é o uso de contas fluorescentes rotuladas para identificar funcionalmente células competentes para fagocitose, ou o engolfamento de um patógeno direcionado²⁵. Populações de células ativas em respostas de imunidade podem ser facilmente identificadas pelo FACS após o engolfamento dessas contas exógenas aplicadas. Enquanto os métodos histológicos tradicionais requerem tecido preservado e muitas horas para aproximar a porcentagem de células positivas para o engolfamento de contas, um ensaio funcional baseado em FACS para o engolfamento de patógenos pode ser realizado relativamente rapidamente em células vivas isoladas. Além de estudar respostas específicas das células ao estresse, essa tecnologia tem o potencial de esclarecer a expressão específica de genes e iluminar a história evolutiva e de desenvolvimento de tipos celulares inteiramente exclusivos dos cnidários, como calicoblasts e cnidocytes.

Recentemente, realizamos uma triagem intensiva de mais de 30 marcadores celulares que resultou na identificação de 24 capazes de rotular células de coral, das quais 16 são úteis para distinguir populações únicas^18,tornando-as clusters de diferenciação (CD). Aqui descrevemos o processo de isolamento das células de coral em Pocillopora damicornis desde a remoção de células do esqueleto de carbonato de cálcio até a identificação e isolamento de populações celulares específicas com FACS (Figura 1).

Protocolo

1. Dissociação de tecidos do esqueleto de coral via escova de ar e compressor

NOTA: Realize passos no gelo e proteja as mãos com luvas.

1. Monte o kit de aerógrafo conectando o compressor de ar, mangueira e escova de ar(Figura 2). Coloque o medidor de pressão entre 276-483 kPa.
   NOTA: O compressor recomendado e a mangueira de ar utilizada para este estudo foram predefinidos a uma pressão máxima de 393 kPa. O uso fora desta faixa de 276-483 kPa pode resultar na remoção inadequada celular do esqueleto ou ruptura das membranas celulares. Esta faixa pode diferir para cada espécie e pode exigir um teste de viabilidade. Um teste de viabilidade pode ser realizado com um subconjunto da pasta celular com um hemótmetro simples e um ensaio de exclusão de corante de 4′,6-diamidino-2-fenilômio (DAPI), visualizado em um microscópio composto.
2. Prepare 100 mL de mídia de coloração celular em um recipiente de vidro autoclavado e estéril adicionando 33 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato de 10x (PBS; sem cálcio e magnésio) a uma concentração final de 3,3x, 2 mL de soro de bezerro fetal (FCS; calor inativado a 56 °C por 30 min) a 2% do volume total, e 2 mL de tampão hepes de 1 M hepes para uma concentração final de 20 mM. Em seguida, cubra a 100 mL com água estéril.
   NOTA: A concentração de 3,3x PBS foi escolhida para imitar a salinidade da água do mar, como demonstrado em Rosental et al.¹⁸. Essa concentração precisa ser ajustada para que espécies encontradas em outros ambientes imitem sua salinidade.
3. Transfira 10 mL de mídia de coloração celular para uma garrafa de aerógrafo (rotulada "F" na Figura 2) e conecte a tampa do adaptador para o conector de aerógrafo.
   NOTA: Fragmentos maiores e espécies com camadas de tecido mais grossas podem exigir mais mídia para a remoção adequada do tecido.
4. Para as espécies de corais ramificadas demonstradas aqui, use um cortador ósseo para cortar ou cortar um fragmento de coral de aproximadamente 3-5 cm de comprimento ou 4 cm² na área.
   NOTA: O fragmento deve estar livre de macroalgas e outros organismos multicelulares, pois estes não podem ser removidos da amostra rio abaixo e contaminarão a amostra durante os processos de análise e triagem do FACS. Um fragmento de 1 cm de P. damicornis dá aproximadamente 2-10 x 10⁶ células após filtrar, colorar e lavar.
5. Coloque o fragmento de coral dentro de um saco de coleta de plástico e use o pincel de ar para pulverizar a mídia de coloração celular no coral (Figura 2). Continue esse processo até que a maior parte do esqueleto seja exposta. Remova o esqueleto restante do saco de coleta.

2. Dissociação de células do tecido coral

NOTA: Realize todas as etapas no gelo e proteja as mãos com luvas.

1. Filtre a pasta celular através de um coador de células de nylon de 40 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL, a fim de obter uma única suspensão celular.
   NOTA: Diferentes tamanhos de malha de coador de células podem ser mais apropriados para diferentes espécies. No entanto, tamanhos maiores podem resultar em dissociação inadequada do tecido devido à passagem de detritos e aglomerados celulares.
   1. Para espécimes com camadas mais grossas de muco, use o êmbolo esterilizado de uma seringa plástica de 1 mL e moer suavemente contra o filtro para quebrar aglomerados e ajudar as células a passar pelo coador. Enxágüe o coador e o êmbolo com a mídia de coloração celular no tubo de centrífuga.
2. Pelota as células por centrifugação a 4 °C a 450 x g por 5 min. Remova o sobrenaspetivo e resuspense as células em 1 mL de mídia de coloração celular.

3. Coloração celular

NOTA: Realize todas as etapas no gelo e proteja as mãos com luvas. As manchas apresentadas neste protocolo são para fins de representação. Manchas alternativas exigirão diferentes concentrações e tempos de incubação.

1. Transfira 500 μL de células resuspended para um tubo de fundo redondo de 5 mL e reserve como uma amostra de controle. Não adicione a mancha a esta alíquota.
2. À suspensão celular restante, adicione 0,42 μL de corante de viabilidade DAPI de 12 mM(Tabela de Materiais),1 μL de 5 μM de mancha de oxigênio reativo (ROS)(Tabela de Materiais)e 0,1 μL de mancha 0,2 μM lysossom(Tabela de Materiais). Pipeta bem para misturar e incubar no gelo por 30 minutos no escuro para evitar fotobleaching.
   NOTA: O DAPI é usado neste exemplo para funcionar como uma mancha de DNA e corante de viabilidade para o diferencial de gating de células mortas na máquina FACS. Isso pressupõe que o DAPI penetra células moribundas devido à integridade da membrana. A mancha ROS emite luz na faixa de 520 nm (verde), enquanto o marcador lyosomal emite luz a aproximadamente 668 nm (vermelho).
3. Pelota 500 μL das células manchadas por centrifugação a 4 °C a 450 x g por 5 min. Remova o sobrenaspetivo e resuspense a pelota em 500 μL de mídia de coloração celular. Transfira para um novo tubo de fundo redondo de 5 mL e armazene no gelo.

4. Startup FACS

NOTA: As etapas podem variar de acordo com a marca e o modelo do cítômetro devido a diferenças nos lasers e canais. Para este protocolo, foi utilizado um cicímetro com lasers de comprimento de onda de 405, 488, 535 e 640 nm. Os filtros apresentados neste protocolo são para fins de representação. Manchas de células alternativas podem exigir um conjunto diferente de filtros e lasers.

1. Comece a criar um novo modelo de projeto no software sorter e escolha o painel laser. Para a combinação representada de manchas e fluorescência natural, selecione todos os quatro lasers (405, 488, 535 e 640 nm).
2. Selecione os filtros apropriados para cada cor esperada representada no experimento.
   1. Para detectar a emissão de DAPI e ajudar na separação de células vivas e mortas, use um filtro com um bandpass (BP) de 450/50 (alcance de 425-475 nm) como um filtro DAPI, Hoeschst ou Pacific Blue.
   2. Para a detecção de luz emitida pelo sinal ROS verde, use um filtro com uma BP de 530/30 (faixa de comprimento de onda de 515-545 nm) como um isotocianato de fluoresceína (FITC) ou filtro de proteína fluorescente verde (GFP). Este filtro medirá a concentração de ROS em cada célula.
   3. Adicione um filtro adicional com uma BP de 670/30 (alcance de 655-685 nm) como um filtro de alofilia (APC) para a detecção da emissão de manchas lysosômicas.
      NOTA: O canal APC permitirá a medição da atividade fagocítica. Este canal também detectará a autofluorescência gerada pelas algas simbióticas de corais da família Symbiodiniaceae. Este sinal pode ser separado usando um canal adicional que tem um comprimento de onda mais longo do que o filtro APC, no entanto.
   4. Inclua um filtro que tenha uma BP de 780/60 (faixa de 750-810 nm), como a ficoerthrina mais usada, filtro de cianeto (APC-Cy7), que detecta a emissão de autofluorescência muito vermelha da Simbiodiniaceae e auxilia no isolamento de células aposomimégnóticas.

5. Configuração de gating FACS

NOTA: As etapas podem variar de acordo com a make e o modelo do cítômetro e o programa de aquisição acoplado ao cítmetro.

1. Na tela experimental do projeto do software de citometria, crie um gráfico de dispersão e selecione a dispersão para a frente (FCS) como a métrica para o eixo X e dispersão lateral (SSC) para o eixo Y.
   NOTA: O FCS se correlaciona com o tamanho da célula e o SSC se correlaciona com a granularidade. Isso permitirá a remoção da maioria dos detritos, pois a maioria será menor em tamanho do que as células intactas.
2. Defina os eixos em escalas logarítmicas ou biexponenciais, pois os tamanhos das células e a granularidade podem variar por várias ordens de magnitude(Figura 3A),particularmente em corais.

6. Análise FACS e isolamento celular

NOTA: As etapas podem variar de acordo com a make e o modelo do cítmetro e do programa de aquisição acoplado.

1. Coloque o controle (ou seja, o subconjunto celular não manchado) na câmara amostral do cítmetro e inicie o processo de leitura. Quando o computador começa a receber dados de cada célula ou evento, os pontos começarão a aparecer no gráfico de dispersão. Para limpar quaisquer detritos deixados nas câmaras de citômetros de experimentos anteriores, permita que aproximadamente 30 s passem antes de iniciar a análise.
2. No gráfico de dispersão, ajuste a tensão do tubo fotomultiplier (PMT) para centralizar os pontos.
   NOTA: A tensão pmt é usada para amplificar a força do sinal dos fótons que estão sendo medidos; se a tensão pmt for muito fraca, menos células serão lidas, e se a tensão pmt for muito forte, as células serão medidas perto do valor máximo e diferentes tipos de células serão indistinguíveis umas das outras. Uma tensão PMT adequada garante que eventos independentemente distintos preencham o gráfico de dispersão. A separação de eventos é mais fácil de visualizar projetando escalas logarítmicas ou biexponenciais em parcelas de dispersão FSC e SSC.
3. Comece a gravar os eventos. Para conservar a amostra, pausar a aquisição de dados após aproximadamente 15.000 eventos foram lidos. Na maioria dos casos, isso será adequado para visualizar os padrões globais da população celular. Registo mais eventos se analisar e isolar pequenas populações de células especializadas.
4. No primeiro gráfico de FSC e SSC, crie uma seleção, ou portão, das células em torno da marca de^{10 2} e mais alta no eixo FSC X. Qualquer coisa abaixo deste limiar é provavelmente detritos celulares. Desenhe portões retangulares, que é uma opção regular em programas de software de citometria de fluxo e bom para populações celulares claras e distintas. Para populações celulares que tomam uma forma mais irregular nas parcelas de dispersão, use uma opção de gating poligonal.
   NOTA: Um corte mínimo de 10² na dispersão dianteira deve selecionar para as menores células de coral, mas pode permitir a contaminação dos detritos. Para alterar isso, aumente o limite inferior do gating para ser mais conservador.
5. Crie um novo gráfico de dispersão expressando o filtro DAPI no eixo X e o filtro APC-Cy7 no eixo Y. Para fazer isso, selecione o portão para células intactas criadas na etapa 6.4, clique com o botão direito do mouse e selecione a opção de criar um novo gráfico de dispersão. Ajuste os eixos em escalas logarítmicas ou biexponenciais.
   NOTA: As etapas necessárias para criar um novo plot podem variar com diferentes programas de software.
6. Agora remova a amostra de controle da câmara do cítômetro e substitua-se pelas células manchadas. Permita que 30 s passem antes de iniciar a análise e registrar os dados. Grave aproximadamente 15.000 células antes de fazer uma pausa.
   NOTA: As populações distintas na extremidade superior da escala APC-Cy7 são aquelas com alta autofluorescência vermelha do Symbiodiniaceae. Nenhuma mancha é necessária para visualizar essas quebras populacionais, e elas também podem ser visualizadas no registro da amostra de controle(Figura 3C). Selecione para as populações somente de corais, aquelas mais baixas no eixo Y, para maior diferenciação.
7. Crie um novo gráfico de dispersão das células aposembióticas para visualizar as concentrações ROS (filtro FITC) e as células positivas para lysosomos (filtro APC), utilizando novamente escalas logarítmicas ou biexponentes.
   NOTA: Se houver múltiplas populações celulares distintas que são aposomimbióticas, cada uma pode ser ainda mais distinguida em seu próprio enredo de dispersão(Figura 3C,D).
8. Compare o grupo amostral manchado com o controle, subconjunto não manchado usando a primeira gravação da amostra de controle ou reinserção e reexeamento do grupo controle. Portão os eventos que são exclusivos do grupo amostral manchado.

7. Classificação e coleta FACS

NOTA: As etapas podem variar de acordo com a make e o modelo do cítômetro e o programa de aquisição acoplado ao cítmetro.

1. Com uma seleção de células escolhidas para coletar, coloque tubos de microcentrifuuge (contendo 250-500 μL de mídia de cultura celular ou tampão de lise com base no número de células coletadas e método de armazenamento) na câmara de coleta de cítômetros.
   NOTA: O citómetro de fluxo representado é capaz de classificar quatro populações diferentes ao mesmo tempo, e a máquina pode ser configurada para conter uma variedade de dispositivos de coleta, incluindo vários tubos de centrífuga e 96 placas de poço.
2. Uma vez que o citómetro começa a ler a amostra e uma quantidade apropriada de tempo passou para limpar os detritos, começar a classificar as populações desejadas e coletar em qualquer lugar de 20.000 células para vários milhões.
   1. Para mais de 500.000 células, ajuste o volume de mídia de cultura celular ou tampão de lise, e o volume do dispositivo de coleta.
   2. Para estudos in vitro, armazene células no gelo até que colocadas em uma incubadora ou ambiente esterilizado.
   3. Para estudos moleculares, inicie imediatamente o processo de isolamento de DNA/RNA/proteína ou congele flash e armazene a -80 °C até a extração.
3. Cada vez que uma nova mancha, espécie ou classificador é usado, realize uma verificação de pureza na população de interesse, classificando pelo menos 20.000 células de interesse em 500 μL de mídia de coloração, em seguida, re-analisando as células classificadas e confirmando que as células estão sendo lidas dentro do portão usado para classificar inicialmente(Figura 4).

Resultados

No geral, esse protocolo é útil porque facilita a identificação e coleta de populações de células de corais vivos que podem ser utilizadas para análises funcionais. O fluxo de trabalho começou com a separação mecânica dos tecidos de coral do esqueleto de carbonato de cálcio subjacente(Figura 1). Este é um dos passos iniciais mais importantes porque a técnica inadequada resulta em alta mortalidade celular e pode criar grandes quantidades de detritos. A separaç...

Discussão

Este protocolo foi adaptado de Rosental et al.¹⁸ e desenvolvido para identificação e isolamento de células P. damicornis. A metodologia se concentra no processo de filtragem de amostras para remover detritos, células não viáveis e células hospedadas por Symbiodiniaceae através do exame de fatores intrínsecos celulares, incluindo tamanho celular relativo, granularidade celular relativa, autofluorescência celular e presença de membranas celulares intactas. Essas técnicas podem ser aplicadas...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de aerógrafo e Compressor	TCP Global	ABD KIT-H-SET	Paasche H Series Kit de aerógrafo de alimentação de sifão de ação única com compressor Master TC-20 e Mangueira de ar
BD FACSAria II	BD	644832
Cortadores de	ossos Fornecimento de recifes a granel	205357	Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter
Cell Strainer	Corning	352340	40 um; Falcão BD; embalados individualmente; estéril; nylon
CellRox Green	Life Technologies	C10444	2.5 mM em DMSO; Excitação/Emissão: 485/520 nm
Saco de coleta	Grainger	38UV35	Reloc Zippit 6"L x 4"W Saco de Polietileno Reciclável Padrão com Fecho de Zíper, Transparente; 2 mil de Espessura
DAPI	Invitrogen	D1306	10mg em H2O; Excitação/Emissão: 358/461 nm
Soro Fetal de Bezerro	Sigma-Aldrich	F2442-100ML	Inativado por calor a 57 &graus; C por 30 minutos
Hemacitômetro	Sigma-Aldrich	Z359629	Hemacitômetro Bright-Line
HEPES Buffer	Sigma-Aldrich	H0887
LysoTracker Deep Red	Life Technologies	L12492	1mM em DMSO; Absorção/Emissão: 647/668 nm
Tubos de microcentrífuga	VWR	87003-294	1,7 mL
solução salina tamponada com clofato (PBS)	Gibco	70011-044	pH 7,4; 10X
Tubos de fundo redondo	VWR	352063	5 mL de polipropileno
Seringa	BD 309628		1 mL BD Seringa Luer-Lok estéril, uso chamuscada de policarbonato