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Emissão de Fluorescência Induzida por Laser (L.I.F.E.) como nova ferramenta não invasiva para medições insitu de biomarcadores em habitats criosféricos

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DOI:

10.3791/60447

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26 de outubro de 2019

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1Institute of Ecology, University of Innsbruck, 2Austrian Polar Research Institute, University of Vienna, 3BrainLinks-BrainTools, Bernstein Center Freiburg, 4Atom Science, Kasevich Lab, Stanford University, 5Institute of Experimental Physics, University of Innsbruck, 6Department of Physics, Extraterrestrial Vehicle Instruments Laboratory, Harvey Mudd College

Neste artigo

Resumo

Os fluxos de carbono na criosfera ainda não são avaliados, mas são cruciais em relação às mudanças climáticas. Aqui mostramos um novo protótipo de dispositivo que captura o potencial fototrófico em ambientes supraglais com base na emissão de fluorescência induzida por laser (L.I.F.E.) tecnologia que oferece dados de alta resolução espectral e espacial condições in situ.

Resumo

O aquecimento global afeta comunidades microbianas em uma variedade de ecossistemas, especialmente habitats criosféricos. No entanto, pouco se sabe sobre fluxos de carbono mediados microbianos em ambientes extremos. Assim, a metodologia de aquisição de amostras descrita nos poucos estudos disponíveis implica dois grandes problemas: a) dados de alta resolução exigem um grande número de amostras, o que é difícil de obter em áreas remotas; B) manipulação inevitável da amostra tal como o corte, a serragem, e o derretimento de núcleos do gelo que conduza a um engano de condições in situ. Neste estudo, um protótipo de dispositivo que não requer nem a preparação da amostra nem a destruição da amostra é apresentado. O dispositivo pode ser usado para medições in situ com uma resolução espectral e espacial alta em ecossistemas terrestres e de gelo e é baseado na missão L aser-Induced Fluorescência E(L.I.F.E.) técnica. Comunidades supraglaciais fotoautomáticas podem ser identificadas pela detecção de assinaturas l.I.F.E. em fotopigmentos. A calibração do instrumento L.I.F.E. para a porfirina deriva a clorofilaa (chla)(405 nm acitação a laser) e b-phycoerythrin (B-PE) (532 nm excitação a laser) é demonstrada. Para a validação desta metodologia, os dados da L.I.F.E. foram ratificados por um método convencional para chluma quantificação que envolvia extração de pigmentos e espectroscopia de absorção subsequente. A aplicabilidade do protótipo no campo foi comprovada em ambientes polares extremos. Mais testes em habitats terrestres ocorreram durante simulações analógicas de Marte na sobremesa marroquina e em uma geleira rochosa austríaca. O instrumento L.I.F.E. permite varreduras de alta resolução de grandes áreas com logística de operação aceitável e contribui para uma melhor compreensão do potencial ecológico das comunidades supraglaciais no contexto da mudança global.

Introdução

A criosfera abriga gelo do mar, geleiras, lagos de alta montanha, áreas de neve, gelo do lago, correntes de água derretidas e permafrost. Estas áreas cobrem aproximadamente 11% das massas terrestres1,2 e estão sobrecadas pela atmosfera como um ambiente criosférico reconhecido. Estudos recentes mostram que áreas maciças da criosfera estão recuando rapidamente3,4. A Antártida5,6,os Alpes7,o Ártico8,e outras regiões mostram saldos negativos de massa de gelo. O recuo das calotas polares e geleiras leva ao esgotamento do nosso maior reservatório de água doce na Terra. Em algumas áreas, o recuo da geleira é imparável5.

Durante muito tempo, os ecossistemas de gelo foram considerados ambientes estéreis. No entanto, apesar das duras condições, a presença de vida ativa na criosfera terrestre é evidente9,10,11,12,13,14,15 . Devido à tendência para perdas maciças de gelo pelo derretimento, a criosfera está passando por uma mudança na atividade biológica, afetando habitats adjacentes. Para compreender essas mudanças parcialmente irreversíveis, precisamos de métodos para investigar a atividade biológica no gelo condições in situ com alta resolução espacial e temporal.

Em ambientes supraglaciais, a vida pode ser encontrada em buracos crioconita, cobertas de neve, água derretida, córregos e superfícies de gelo nuas. No entanto, os habitats supraglaciais mais óbvios são buracos crioconita. Eles aparecem globalmente em ambientes glaciados e foram descritos pela primeira vez pelo explorador sueco Adolf Erik Nordenskjold durante uma expedição à Groenlândia na década de 187016,17. O nome se origina das palavras gregas "kryos" (frio) e "konia" (poeira). Detritos orgânicos e inorgânicos escuros derivados de eólia saem na superfície do gelo e reduzem o albedo localmente. A radiação solar promove o derretimento dos detritos em camadas de gelo mais profundas, formando bacias cilíndricas com sedimentos (crioconita) no fundo9. Buracos crioconita cobrem 0,1-10% das zonas de ablação glacial11.

Comunidades crioconitas consistem em vírus, fungos, bactérias, cianobactérias, microalgas e protozoa. Dependendo da região, organismos metazoários como rotifers, nematóides, copépodes, tardígrados e larvas de insetos também podem ser encontrados. Edwards e outros18 descrevem buracos crioconita como "hotspots gelados". Eles também rastrearam genes funcionais em buracos crioconita que são responsáveis por N, Fe, S e P ciclismo. Os ecossistemas do mini lago respirem e fotossintetizam a taxas encontradas em habitats muito mais quentes e ricos em nutrientes11. Esses achados enfatizam o importante papel do sequestro microbiano em ambientes supraglaciais. Ao lado das comunidades vivas em buracos crioconitas, superfícies de gelo nuas são habitadas por algas geladas. Sua fisiologia é bem estudada19, mas sua distribuição espacial não foi avaliada20. Sua presença em ambientes supraglacial diminui o albedo e, portanto, promove o derretimento que leva a uma lavagem de nutrientes e entrada de nutrientes em habitats a jusante9. O aumento das temperaturas e, portanto, uma maior disponibilidade de água líquida, afeta a produtividade líquida do ecossistema nesses ecossistemas gelados.

Em ambientes supraglaciais, organismos fotossintéticos ativos transformam carbono e nitrogênio inorgânicos em fontes orgânicas e disponíveis para a teia de alimentos microbiana21,22. Até agora existem poucos estudos que estimam fluxos de carbono supraglacial11,20,23. A discrepância nas taxas propostas de fluxo de carbono resulta de uma baixa resolução de dados espaciais e temporais. Além disso, a distribuição espacial de comunidades supraglaciais fora dos buracos crioconita é mal avaliada. Cook e outros20 previram em seus modelos que as comunidades supraglacial algal corrigir até 11x mais carbono do que os buracos crioconita contemporânea devido à sua grande cobertura de superfície. A detecção de comunidades de algas supraglaciais que garantem a integridade da amostra ainda é impedida devido à falta de ferramentas para detecção e quantificação in situ.

Em resposta às dificuldades na logística, os ecossistemas de gelo são menos freqüentemente estudados do que habitats em áreas temperadas. A resolução de dados depende do número de amostras avaliadas e depende da acessibilidade dos locais do estudo. Métodos de amostragem padrão, como serrar, marcar e subsequente fusão, envolvem a manipulação da comunidade microbiana. Por exemplo, a avaliação da clorofilaa (chla)em amostras de gelo sólido é impossível com métodos padrão sem interferência substancial. Assim, as mudanças de temperatura induzidas pelo derretimento dentro das comunidades microbianas investigadas são inevitáveis. Em resposta à termolidade do fotosistema II e outras estruturas celulares em psiquirófilos22,análises laboratoriais de amostras de gelo derretido sempre levarão a uma falsificação de condições in situ.

Medições in situ não destrutivas são a única maneira razoável de obter dados confiáveis. Esse objetivo pode ser alcançado usando métodos baseados em fluorescência. Devido à sua função de colheita de luz, chla e B-phycoerythrin (B-PE) estão presentes em organismos que contribuem para o ciclo do carbono em ambientes supraglaciais, como foi provado por Anesio e outros11. Assim, essas moléculas fluorescentes são biomarcadores adequados para a quantificação de fluxos de carbono mediados microbianos nos ecossistemas de gelo.

Neste estudo, apresentamos o desenvolvimento, calibração e aplicabilidade de uma nova ferramenta não invasiva para a quantificação in situ de moléculas de chla e B-PE em ecossistemas terrestres e de gelo. O dispositivo protótipo é baseado em emissão fluorescente induzida por laser, também conhecida como L.I.F.E. O instrumento óptico (Figura 1) captura assinaturas de biomarcadores fluorescentes após a excitação de fluorescência induzida por laser. O procedimento não é destrutivo e pode ser realizado no local do estudo ou em laboratório.

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Figura 1: O protótipo da L.I.F.E. Esquerda: Foto do instrumento sem uma tampa protetora. Direita: Ilustração esquemática do instrumento. Massa total = 5,4 kg (laser e óptica = 4,025 kg, laptop = 1,37 kg). Quadro de alumínio = 32,5 cm x 20,3 cm x 6,5 cm. Tubo óptico: 18,4 cm x 4 cm (diâmetro). CCD: sensor bluefox mv220g; F: filtros de passe longo dirigidos por servos (450 nm e 550 nm); L: lentes ópticas; M1: espelhos; M2: espelho dicroico; MC: microcontrolador; P: prisma; PBS: divisor de feixe polarizando; S: abertura de fenda feita de lâminas de barbear ajustáveis. Barra de escala = 70 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O kit portátil de comprimento de onda dupla pesa 4,5 kg e é usado em um tripé em combinação com um computador externo. A configuração do campo é rápida e fácil. O instrumento está ligado ao tripé, e o tubo de lente é anexado ao dispositivo, juntamente com um cabo USB e o cabo da câmera. O computador externo está conectado ao instrumento usando um cabo USB. As pernas tripé são ajustadas de tal forma que o tubo de lente é direcionado para e cobre o espécime. Em seguida, um laser verde de 5 mW atinge a amostra depois de passar por um divisor de feixe polarizador que redireciona a luz polarizada em direção ao eixo óptico do espectrômetro. O espécime exibe uma luz fluorescente, ilustrada em vermelho na Figura 1. Metade da luz collimada passa o divisor de feixe polarizador e é focada através de um filtro de passe longo dirigido por servos que remove os sinais de laser. Em seguida, o sinal atinge uma fenda de abertura que consiste em duas lâminas de barbear ajustáveis. Um prisma estolàpida separa a linha fina de ortogonal claro à abertura da fenda antes que o sinal esteja capturado pelo sensor. O procedimento é repetido com um laser azul. Os dados brutos são transferidos automaticamente para um computador portátil que também é usado para a operação de software.

O instrumento é controlado por um computador externo usando um ambiente LabVIEW que sincroniza a tomada de imagem com a câmera CCD, ligar / desligar lasers, e girando a roda de filtro de passe longo. A interface gráfica do usuário (GUI) é dividida em três seções principais. O ajuste de exposição é feito manualmente. Embora a correção entre o tempo de exposição e a intensidade do sinal seja linear(Figura 2B),o tempo máximo de exposição é limitado a 10 s porque tempos de integração mais longos levam a uma diminuição significativa na relação sinal/ruído. O campo de comentários é utilizado para a descrição daamostra (Figura 2A). Na seção direita, as imagens brutas são exibidas assim que as medições são concluídas. Esse recurso é crucial para a avaliação imediata de dados na área(Figura 2C-E). As áreas vermelhas indicam pixels superexpostos, que podem ser evitados reduzindo o tempo de exposição.

O processo de redução de dados brutos subsequente é dissociado do procedimento de aquisição de imagem e pode ser feito a qualquer momento após a aquisição de imagem.

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Figura 2: Interface gráfica de usuários da L.I.F.E. para a aquisição de dados e avaliação de dados brutos. (A)O software permite a entrada manual de texto para descrições de amostras. (B) O tempo de exposição pode ser ajustado antes da medição. (C-E) As imagens brutas são exibidas no lado direito da interface. (E)As cores vermelhas indicam uma saturação do sensor. (F)A ativação do botão RUN MEASUREMENT desencadeia o processo de aquisição de dados. Na matriz (G), todos os comandos executados automaticamente durante a aquisição de dados são exibidos. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Figura 3: Exemplo de uma imagem crua. Esquerda: Dados brutos de chlum padrão na solução de acetona, gravado com o instrumento L.I.F.E. Devido às propriedades ópticas do dispositivo, o sinal é exibido como uma linha distorcida. Direita: Interpretação da imagem bruta por pixel (px). O eixo espectral (resolução de 5 nm/px) é traçado contra o eixo espacial (resolução de 30 μm/px). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

As imagens brutas em escala cinza de 12 bits mostram um componente espacial devido à fenda de abertura unidimensional e a um componente espectral devido ao prisma em frente ao CCD (Figura 3). Em resposta às restrições ópticas, as imagens brutas são distorcidas. Portanto, eles precisam ser cortados e dewarped aplicando um código que reconhece o grau de distorção. Isso é feito com um assistente de software(Figura 4). Em seguida, a calibração do comprimento de onda é feita com o laser de 532 nm. A luz verde é produzida pela duplicação da freqüência de um laser infravermelho de 1.064 nm. Ambos os comprimentos de onda podem ser detectados pelo CCD e, portanto, a posição espectral de cada pixel pode ser calculada automaticamente em imagens dewarped(Figura 4).

A imagem é então cortada para baixo a uma determinada faixa de comprimento de onda (550-1.000 nm para medições de laser verde e 400-1.000 para medições de laser azul). Os valores cinzentos de cada pixel em uma linha de pixels selecionada são contados e resumidos. Um valor cinza pode variar de 0-255. Depois disso, cada linha de pixels é responsável por um número. Outras instruções de software na tela levam à geração de um enredo mostrando as contagens de valor cinza de cada linha de pixels traçadas contra as coordenadas espaciais. Isso permite uma discriminação espacial quantitativa de chla e B-PE simultaneamente na amostra. Além disso, as propriedades espectrais de uma amostra podem ser traçadas a partir de linhas de pixel selecionadas automaticamente.

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Figura 4: Dewarping imagens cruas. Esquerda: Imagem crua capturada com um laser verde. Nenhum filtro foi usado. Os sinais são exibidos em 532 nm e 1.064 nm. Tempo de exposição = 0,015 s. Centro: O sinal de 532 nm cortado é usado como uma linha de referência para dewarp um conjunto de imagens. Direita: A imagem dewarped da fonte crua da imagem. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Protocolo

1. Calibração e validação

NOTA: Para a calibração do pigmento, prepare linhas da diluição das soluções conservadas em estoque do chla e do B-PE. A solução deum estoque é diluída com acetona e B-PE é diluída com água estéril destilada. Mais tarde, 15 mL de cada etapa da diluição serão necessários. Proteja os pigmentos da luz, envolvendo-os com papel alumínio. Armazenar o chla em um freezer e o B-PE em uma geladeira até continuar a usar. Um protocolo detalhado para a linha da diluição segue nas seções 1.1 para o chla e 1.2 para B-PE. Tanto o chla quanto a calibração laboratorial b-pe para detecção e quantificação de pigmentos com o instrumento L.I.F.E. são descritos abaixo. Uma calibração precedente24 foi feita com os mesmos pigmentos que neste estudo.

  1. Clorofilauma linha de diluição
    1. Dissolva 1 mg de chla (purificado de algas A. nidulans) com acetona em um tubo de amostra de 50 mL e diluir esta chluma solução de estoque com acetona para as seguintes concentrações finais: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1; e 0,5 ng/mL.
    2. Transfira 15 mL de cada diluição em tubos de amostra de 50 mL e cubra-os em folha de alumínio devido à sensibilidade à luz. Guarde os tubos em um freezer de -20 °C até que as medições de calibração sejam tomadas.
      NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui.
    3. Medir o chluma absorção características de cada diluição em um espectrômetro de feixe duplo como triplicados e calcular o chlum conteúdo como descrito por Lorenzen25, que será descrito em detalhes na seção 2.2.2.
  2. Linha de diluição pe
    1. Diluir uma solução de estoque de 4 mg/mL B-PE com água filtrada estéril (pH = 7) para as seguintes concentrações finais: 1.000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; e 5 ng/mL B-PE. Transfira 15 mL de cada diluição em um tubo de amostra de 50 mL e cubra-o com papel alumínio. Guarde a 4 °C até novo uso.
      NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui.
  3. Configuração para calibração
    1. Construa um rack como mostrado na Figura 5 para estabelecer três plataformas de medição, cada 1,5 cm maior do que a próxima.
      NOTA: A altura do rack e da coluna desempenha um papel importante para as medições porque a superfície dos líquidos deve permanecer no ponto focal do instrumento L.I.F.E. como indicado na Figura 5.
    2. Adicione 5 mL da diluição concentrada a mais elevada em um frasco plástico da poliscintilação e põr a sobre o ponto o mais elevado da cremalheira. Medir a intensidade da fluorescência.
    3. Coloque o frasco na posição média do rack e adicione mais 5 mL (volume total de 10 mL). Medir a intensidade da fluorescência. Repita o procedimento na posição mais baixa do rack com mais 5 mL (volume total de 15 mL; total de 45 mm na altura da coluna).
      NOTA: Adapte o tempo de exposição para cada passo de diluição para evitar a saturação do detector (valores cinza acima de 255 em imagens de 12 bits) e para uma proporção suficiente de sinal/ruído dos sinais fracos de fluorescência.
    4. Repita os passos 1.3.2 e 1.3.3 com todas as diluições (passos 1.1.1 e 1.2.1) de chla e B-PE.
    5. Carregue os arquivos de dados gerados no assistente de redução de dados para contar automaticamente e resumir os valores cinzas de cada linha de pixelao longo do eixo Y (distribuição espacial).
      NOTA: Os tempos de exposição variados são compensados automaticamente normalizando a intensidade da fluorescência a um tempo de integração de 1 s.
    6. Calcule a densidade da área do pigmento com uma análise da regressão de Poisson usando as concentrações conhecidas da série da diluição e as intensidades normalizadas da fluorescência que foram calculadas. Em seguida, normalize as contagens de fluorescência das três alturas diferentes da coluna para 1,5 cm (5 mL) multiplicando as contagens de cada altura da coluna com um fator (fatores 1, 0,5 e 0,33, para as soluções de concentração de 5 mL, 10 mL e 15 mL, respectivamente).

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Figura 5: Configuração para a calibração l.I.F.E. com chla e B-PE em condições de laboratório.
(A)Tubo de lente do instrumento. (B)Laser verde para a excitação B-PE. (C)Laser azul para chluma excitação. (D)Frasco de cintilação. (E)Ponto focal do instrumento L.I.F.E. (F)B-PE/water ou chla/acetona solution with 5 mL, 10 mL, and 15 mL. (G)Espaçadores que mantêm a superfície de cada solução no plano focal para três volumes diferentes. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

2. Amostragem e processamento de amostras

  1. Coleção de neve e gelo
    1. Colete neve e gelo supraglacial de uma geleira em sacos estéreis de polietileno e armazená-los congelados até novo processamento.
      NOTA: Para este estudo, as amostras foram coletadas em Midtre Lovenbreen (MLB), uma geleira politérmica perto da aldeia de pesquisa Ny-Ålesund no alto arquipélago ártico de Svalbard (78°53' N, 12°03' E).
    2. Amostra esteiras bacterianas do campo da geleira em sacos estéreis do polietileno e transporte todas as amostras a um laboratório para um processamento mais adicional.
    3. Derreta material congelado lentamente no escuro a 4 °C. Filtrar amostras líquidas em filtros GF/F (47 mm de diâmetro) e observe o volume filtrado. Mantenha os filtros congelados até o processamento.
  2. Clorofilauma medida
    1. Usando o instrumento L.I.F.E., medir o filtro em quatro áreas aleatórias, cada um em triplicados usando o laser verde e azul. Calcule a concentração total do pigmento multiplicando a densidade da área com a área filtrada e o volume filtrado. Normalize a concentração de pigmentos (μg/L) a um volume de 1 L.
    2. Avalie o chlum conteúdo dos filtros GF/F com um padrão de laboratório de acordo com o protocolo de Lorenzen25. Para fazer isso, coloque cada um dos filtros em um frasco com 13 mL de acetona e armazená-los no escuro em 4 °C durante a noite. Em seguida, pegue um frasco e coloque-o no gelo antes da sonication por 2 min a 50% de potência no modo contínuo. Esprema e retire o filtro do frasco.
    3. Anexar tubos de digitação para uma seringa e retire o chluma mistura de extração de acetona do frasco. Substitua a tubulação de digitação por um suporte de filtro GF-5. Transfira a solução para um cuvette de quartzo.
    4. Depois de calibrar o espectrômetro de absorção para acetona, coloque a amostra no cuvette no espectrômetro e medir as características de absorção entre 400-750 nm. Em seguida, retire o cuvette do espectrômetro e adicione 200 μL de 2 M HCl à amostra. Em seguida, repita a medida de absorção para medir o conteúdo de phaeofita na amostra.
  3. Medição da atividade microbiana através de marcadores com rótulo de radiorótulo e impacto da intensidade do laser e tempo de exposição nas taxas de produtividade
    CUIDADO: Cuidado com a radioatividade marcadora (β-radiação). Use um casaco de laboratório, luvas e óculos de proteção, e trabalhar um capô de fumaça em um laboratório de isótopos licenciados.
    1. Para a produção bacteriana transferir cinco alíquotas de esteiras bacterianas em sacos estéreis de polietileno. Inativar os controles com formaldeído para uma concentração final de 4%.
      NOTA: Três alíquotas são usadas para acaptação de leucine 3 h-rotulados e dois alíquotas são usadas como controles.
    2. Expor as esteiras com um laser azul (405 nm, 5 mW) e com um laser verde (532 nm, 5 mW) para 10 s e 30 s cada. Repita o procedimento com 50 lasers mW. Em seguida, inativar as amostras que não foram tratadas com formaldeído.
      NOTA: Um esteira é usado para apenas uma exposição a laser. Use esteiras microbianas não expostas como controles.
    3. Após o tratamento a laser, estimaa a produção bacteriana e primária incorporando 3H-leucina e NAH14CO3, respectivamente. Para medidas de produção bacteriana, use cinco alíquotas por amostra (20 mL) e adicione formaline (4% de concentração final) a dois dos paralelos, que servem como controles para a incorporação abiótica do marcador. Adicione 3H-leucina (40 nM) a todas as amostras dos vários tratamentos e incuba-as para 4 h condições in situ (0.1 °C). Termine a reação adicionando formaline às amostras vivas restantes.
    4. Para a produção bacteriana de esteiras bacterianas, transfira amostras rotuladas em crioviais. Extraia células com 5% de ácido tricloroacético e centrífuga a 10.000 x g por 5 min de acordo com os protocolos de Kirchman26 e Bell27. Adicione o líquido de cintilação e coloque o criovial em um frasco de poliscintilação. Analise as amostras com um contador de cintilação líquida e calcule as taxas de captação.
      NOTA: Três alíquotas são usadas para acaptação de leucine 3 H-rotulados, dois alíquotas são usadas como controles.
    5. Para a produção primária, prepare cinco réplicas de vários tratamentos (100 mL), envolva dois deles em folha de alumínio para imitar as amostras escuras e adicione NAH14CO3 (1 μCi) a todos. Incubar por 4 h na luz ambiente e in situ temperatura (0,1 °C). Termine a reação escurecendo as três réplicas restantes e filtre a amostra nos filtros GF/F (25 mm de diâmetro).
    6. Adicione 100 μL de 2 N HCl aos filtros para remover todo o excesso de carbono e deixe-o arejar para fora a capa da fumaça. Seque as amostras em uma placa de aquecimento a 80 °C e coloque amostras em frascos de polisscintilação.
    7. Para medir as desintegrações radioativas por minuto (dpm) de todos os tratamentos de produção primária e bacteriana, coloque os crioviais em frascos de poliscintilação e adicione 5 mL de coquetel de cintilação. Medir dpm com um contador de cintilação líquida e calcular as taxas de captação.

Resultados

Calibração laboratorial para B-PE
Os sinais de resposta da linha de diluição B-PE foram medidos com o instrumento L.I.F.E. em uma sala escura a 20 °C (Figura 6). A taxa de contagem dependia tanto da concentração quanto da altura da coluna da amostra medida. Baixa concentração e baixa altura da coluna B-PE espécime fluoresced mais forte em comparação com amostras da mesma concentração e maior altura da coluna.

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Figura 6: Calibração do laboratório B-PE. O conteúdo B-PE e a calibração de densidade da coluna são mostrados. As taxas de contagem normalizadas foram calculadas parauma altura da coluna de 1,5 cm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Uma regressão de Poisson foi usada para o ajuste final da linha de calibração. Houve uma correlação linear entre as densidades de área e as contagens de valor cinza pixel. A função da curva foi y = 81.04x (Figura 7),o que significa que uma taxa de contagem de valor cinza de 8.104 em uma amostra exposta de 1s igualou uma densidade de área de 100 ng/cm2 B-PE. O chluma calibração é configurado de forma analógica. A função foi y = 8,94x.

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Figura 7: Curva de calibração final para B-PE. As contagens de valor cinza foram normalizadas a um tempo da exposição de 1 s e traçadas de encontro à densidade da área. Reimpresso com permissão28. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Aplicação em amostras de crioconita de Svalbard e validação laboratorial de dados
Os valores médios das medições l.I.F.E. e as únicas medições das mesmas amostras derivadas da extração convencional usando acetona e análise subsequente com um espectrômetro são ilustradas na Figura 8.

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Figura 8: Validação de dados com amostras naturais. As amostras (MLB) são classificadas por umconteúdo, com base nos resultados de um espectrômetro laboratorial (valores únicos) e em comparação com os dados de fluorescência medidos em quatro áreas aleatórias por filtro. As barras de erro representam o desvio padrão das medições da L.I.F.E. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Chlum conteúdo que varia de 48 μg/L-67 μg/L foram subestimados, e um baixo chlum conteúdo que variava de 0,7 μg/L-7 μg/L foi superestimado pelo protótipo L.I.F.E. Os desvios padrão das medições da L.I.F.E. foram baixos.

Comparação de dados espectrais de medições in situ com padrões de laboratório
Osespectros de Chl eram comparáveis entre amostras do crioconite e aqueles das algas purificadas dos nidulans de A.. Os picos de fluorescência em todas as amostras foram localizados em 700 nm-710 nm. No entanto, espectros derivados de amostras de crioconita mostraram sinais de ruído mais elevados entre 400 nm-650 nm e de 800 nm-1.000 nm em comparação com espectros do chlum padrão de pigmento (Figura 9).

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Figura 9: Interpretação espectral de dados. Medições de quatro grânulos crioconitos (azul) e um chluma solução padrão de pigmento (vermelho) após excitação com lasers de 405 nm. Os espectros foram registrados 1 ano após a coleta de amostras. As amostras foram mantidas congeladas e não foram expostas à luz antes da medição. Em resposta a problemas de calibração de comprimento de onda, o pico de fluorescência está localizado em 700 nm-710 nm em vez de 680 nm. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Análise automatizada de grãos crioconitos
Em um exemplo de uma análise automatizada de um buraco crioconita (Figura 10), as maiores densidades de área de pigmento foram observadas na linha pixel 50. O espectro da amostra após a excitação com um laser de 532 nm mostrou um pico com um corte em um valor cinzento de 255 em resposta à supersaturação do sensor. Este pico derivado do laser verde e não do sinal fluorescente.

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Figura 10: Análise automatizada de dados de um único grânulo crioconita com um diâmetro de 1 mm. A amostra foi coletada em Vestre Brøggerbreen (VBB) e medida dentro de 4 h após a amostragem em uma sala de laboratório escura na instalação da Estação Ártica (GB) em Ny-Ålesund. A coluna esquerda mostra medições b-pe e a coluna direita representa um chlum dado. As imagens brutas são exibidas em cima. As respostas de fluorescência induzidapor a laser são exibidas em cinza. As áreas vermelhas indicam a resposta dos pigmentos padrão. A seção do meio ilustra a distribuição espacial dos pigmentos alvo. As propriedades espectrais do sinal de fluorescência são exibidas nas imagens mais baixas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Impacto da excitação a laser na produtividade em esteiras bacterianas
Nem a produtividade primária nem bacteriana foram afetadas ao aumentar a potência do laser e/ou o tempo de exposição(Figura 11). Não foram detectadas diferenças significativas em tratamentos a laser com aumento de potência.

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Figura 11: Medições de produtividade de amostras de Svalbard. Esteiras bacterianas foram expostas com lasers verdes e azuis de diferentes intensidades de laser e tempos de exposição. Os dados são coloridos de acordo com a fonte do comprimento de onda do laser (verde e azul). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Discussão

Calibração
Houve uma correlação linear entre concentração de pigmento e intensidade de fluorescência após a normalização da contagem de fótons a um tempo de exposição de 1s. Amostras com baixa altura da coluna e baixas concentrações de pigmentos levaram a uma superestimação dos pigmentos alvo, em comparação com alturas de coluna mais altas com a mesma concentração de pigmentos. Além disso, os sinais fracos de fluorescência exigiram longos tempos de exposição para contagens de fótons suficientes no sensor. No entanto, longos tempos de integração também aumentaram a quantidade de luz perdida no sensor, resultando em uma diminuição da relação sinal-ruído. Em sua versão atual, o software não pode distinguir entre ruído e sinal durante o processo de redução de dados. Assim, as medidas de baixa intensidade da fluorescência levaram a uma superestimação de pigmento porque o ruído foi contado como um sinal derivado dos pigmentos alvo. Além disso, as intensidades de fluorescência de soluções pigmentadas mais concentradas mostraram uma maior variabilidade do que as soluções de baixa concentração. Esse efeito pode ser explicado por processos de absorção dentro das soluções de pigmento que foram usadas para a curva de calibração.

Validação de dados para clorofilauma quantificação
Depois de filtrar amostras de gelo e neve, as amostras tridimensionais quase apareceram como um espécime bidimensional no filtro. Isso justificou uma comparação direta entre l.I.F.E (densidade de área) e dados espectrofotométricos (medição volumétrica).

O conjunto de dados(Figura 8)indicou que a alta concentração de pigmentos leva a uma subestimação, enquanto a baixa concentração de pigmentos leva a uma superestimação do valor real. Esse efeito pode ser explicado pela espessura do bolo de filtro e, portanto, pelo caráter volumétrico da amostra. A profundidade da penetração do laser dependeu da densidade óptica e da espessura do espécime. Os índices elevados do pigmento foram subestimados porque o laser não poderia induzir a fluorescência do pigmento em umas camadas mais profundas. Entretanto, em bolos finos do filtro, os sinais baixos da fluorescência foram capturados devido às baixas densidades da área dos pigmentos. Aparentemente, o filtro em si mostrou sinais induzidos por laser depois de passar o filtro de passe longo de 450 nm (Figura 12). Este sinal foi contado enganosamente como sinal de fluorescência derivado de chla. Assim, bolos de filtro finos e muito grossos são difíceis de medir com o instrumento L.I.F.E.

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Figura 12: Sinais de fluorescência de bolos de filtro grossos (A) e finos (B) em um filtro GF/F. (A)A auto-sombreamento impede a fluorescência induzida por laser de camadas mais profundas, o que resulta em uma subestimação da concentração de pigmentos reais. (B) Emissão de fluorescência do bolo de filtro com sobreposição por reflexos de filtro. (C)Dados brutos mostram reflexo de filtro (cinza). A propriedade espectral de um chl derivado de laboratórioum padrão de fluorescência é ilustrada em vermelho. Barra de escala = 45 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Limitações do protótipo l.I.F.E.
Durante a redução de dados, o software codificado MATLAB interpretou as imagens brutas resumindo linhas de pixel dentro de uma determinada faixa de comprimento de onda. A versão atual do software não fazia distinção entre sinais derivados orgânicos e inorgânicos. A presença de múltiplos sinais pode levar a uma superestimação do conteúdo real do pigmento. Longos tempos de exposição devido a baixas intensidades de fluorescência levaram a uma diminuição da relação sinal-ruído, promovendo o efeito descrito acima (ver Figura 8 e Figura 12).

Uma rocha geode mostrada na figura 13 exibiu a luz fluorescente vermelha quando expor com luz verde e azul. Atualmente, não está claro se a fluorescência resultou de minerais ou de moléculas à base de porfirina. Assim, uma sobreposição de sinais biológicos e não biológicos pode limitar a aplicação deste método e exigir o estabelecimento de um banco de dados de fluorescência especificamente feito para o protótipo L.I.F.E.

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Figura 13: Fluorescência mineral de uma rocha geode, encontrada em Ny-Ålesund. A rocha estava animada com um laser de 532 nm 50 mW(A)e um laser de 405 nm 50 mW (B). Ambas as imagens foram capturadas com um filtro de polarização anexado na lente, o que levou a uma falsificação das cores reais de fluorescência. (C) Imagem de cor verdadeira sem o uso de um filtro de polarização condições de luz do dia. Barra de escala = 40 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Beutler e outros29 concluíram que os espectros característicos de emissões de cianobactérias nos ecossistemas marinhos dependem das condições ambientais. Além disso, o estado metabólico tem um impacto sobre as propriedades de fluorescência em organismos fototróficos30. O instrumento L.I.F.E pode distinguir entre o padrão de fluorescência algal e cianobacteriana usando bibliotecas de bioimpressão digital que contêm informações espectrais do espécime correlacionadas com condições ambientais.

Em chl escuro adaptadouma moléculas, todos os centros de reação são totalmente oxidados e disponíveis para fotoquímica e nenhum rendimento de fluorescência é saciado31. Usando o procedimento l.I.F.E., um espécime é animado pela primeira vez por um laser de 532 nm (verde) e depois com um laser de 405 nm (azul). Durante a segunda excitação pelo laser azul, chla pode mostrar uma resposta de fluorescência diminuída devido à excitação prévia pelo laser verde. Chla absorve energia em 532 nm comprimento de onda, apesar de sua distância de sua absorção comprimento de onda máximo32. Antes do chl realuma medida em 405 nm, o laser verde pode causar reações fotoquímicas, ativando mecanismos de extinção nos pigmentos alvo. Além disso, a pré-iluminação de organismos fototróficos marinhos não levou a uma mudança nas curvas de normas espectrais entre 450 nm-600 nm, enquanto o desvio padrão em intensidades de fluorescência aumentou 25%29. Dependendo da espécie, as intensidades de fluorescência aumentaram mesmo em resposta à excitação prévia. Este tópico requer uma investigação mais adicional.

Aplicabilidade
Testamos o instrumento L.I.F.E. em vários habitats com ênfase em buracos crioconita. O laser foi aplicado com sucesso em habitats do solo e do biofilme por causa da ausência de luz ambiental durante a medida. Os grânulos de crioconita podiam ser medidos quando as camadas do sedimento obstruíram a luz abaixo do furo (figura 14A,C). Buracos de crioconita de sedimentos finos eram permeáveis para a luz perdida por baixo (Figura 14B). A luz dispersa interfere com a medida. Assim, a concentração de pigmentos em superfícies de gelo nuas ainda não é mensurável condições de luz do dia. Esforços de processamento de sinal estão em andamento para permitir o funcionamento do sistema em condições de luz ambiente elevadas.

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Figura 14: Buraco crioconita com água líquida em cima. (A)Crioconita na geleira com tubo de lente L.I.F.E. Barra de escala = 70 mm. (B)A camada de sedimentos (vermelho) é muito fina. A luz perdida sangra através da camada crioconita. (C)A camada de sedimentos é espessa o suficiente para bloquear a luz perdida de baixo. Este tipo de buraco crioconita é mensurável com o instrumento L.I.F.E. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Em conclusão, nosso instrumento L.I.F.E. detectou organismos fotofróficos em habitats terrestres, como solos, esteiras bacterianas, biofilmes e buracos crioconitas em superfícies glaciais. As moléculas-alvo eram chla e B-PE. A resolução espacial foi de 30 μm/px. O limite de detecção para chla foi de 250 pg/mL e 2 ng/mL para B-PE. Após uma calibração laboratorial, conseguimos quantificar o conteúdo de pigmentos em amostras coletadas em nosso local de estudo no Ártico. Aplicamos software autoprogramado para um processo automatizado de redução de dados. Os efeitos da presença de minerais e mudanças nas condições de luz durante as medições requerem uma investigação mais aprofundada.

Com o aquecimento climático, o aumento das temperaturas leva a uma maior disponibilidade de água líquida, o que resulta em maior atividade biológica em superfícies geladas de natureza autotrófica e heterotrófica. Esforços vigorosos devem ser feitos para detectar organismos heterotróficos in situ para dar uma imagem completa da vida ativa na criosfera. Isso pode ser testado com outros pigmentos alvo e comprimentos de onda apropriados de excitação a laser. Assim, a L.I.F.E. fornece um sistema de monitoramento adequado fornecendo alta resolução temporal e espacial para condições supraglaciais no contexto com mudança global, bem como possíveis aplicações astrobiológicas.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem com gratidão ao Coronel (IL) J.N. Pritzker, à Fundação Tawani, EUA, ao Ministério Federal Austríaco de Ciência, Pesquisa e Economia (Sparkling Science SPA04_149 e SPA05_201), Alpine Forschungsstelle Obergurgl (AFO), Fórum Espacial Austríaco ( ÖWF), Roman Erler do Hintertuxer Natur Eis Palast, o austríaco Federal Forestry e Gerente de Base Nick Cox da Estação Ártica em Ny Alesund (Svalbard). Também estamos em dívida com Sabrina Obwegeser, Carina Rofner e Fabian Drewes por sua ajuda durante as filmagens. Finalmente, queremos agradecer a James Bradley por dar a voz para o vídeo concomitante.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
acetonMerck67-64-1
B-FicoeritrinaInvirtrogenP6305
Clorofila um padrãoSigma-AldrichC6144-1MG
formalinaMerckHT50112836%
GF / C filtrosWhatmanWHA182202525mm de diâmetro
HClMerckH175836,5-38%
L.I.F.E. ProtótipoUniversidade de Innsbruckconstruído sob demanda
LabViewNational InstrumentsSoftware, Laboratório Instrumentação Virtual Engenharia Bancada
de Trabalho Leucina, L-[4,5-3H], 1 mCiPerkin ElmerNET1166001MCradioativo
Coquetel de cintilação líquida Beckman Ready UseBeckmannão está mais disponível, pode ser compensado por Ultra Gold, contador
Beckmanfora de estoqueLSC 6000 IC
NaH14CO3 (4 µ Ci/ml)DHI Dinamarca4 μ Ci/ml, filtrosradioativos
de policarbonato OsmonicsDHI DinamarcaPCTE25mm de diâmetro, 0,2µ
Frascos de policintilaçãoPerkin ElmerWHA182504720 ml
Tubos de centrífugaGreiner Sigma AldrichT2318-500EA
espectrofotômetroHitachiNAModelo U2001, qualquer fotômetro para espectroscopia de absorção medindo 664 nm e 750 nm seria apropriado
ácido acético tricrídrico (TCA)MerckT6399100%
sonda ultrassônicanano laboratórioQS1T-2
de cintilação líquida Packard de 1 ml tubos de amostra de , de 50 ml

Referências

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