Modificação genética de cianobactérias por conjugação usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo como i) montar um vetor auto-replicante usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate, ii) introduzir o vetor em um hospedeiro cianobacteriano por conjugação, e iii) caracterizar cepas transgênicas de cianobactérias usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Resumo

Cianobactérias são um grupo diversificado de organismos fotosintéticos procarióticos que podem ser geneticamente modificados para a produção renovável de commodities industriais úteis. Os avanços recentes na biologia sintética conduziram ao desenvolvimento de diversos toolkits da clonagem tais como CyanoGate, um sistema modular estandardizado da clonagem para construir vectors plasmid para a transformação subseqüente ou transferência conjugal em cianobacteria. Aqui descrevemos um método detalhado para a montagem de um vetor auto-replicante (por exemplo, carregando uma fita de expressão marcador fluorescente) e transferência conjugal do vetor para as cepas cianobacterianas Synechocystis sp. PCC 6803 ou Synechococcus Elongatus UTEX 2973. Além disso, descrevemos como caracterizar o desempenho de uma parte genética (por exemplo, um promotor) usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Introdução

Cianobactérias são bactérias autotróficas que podem ser usadas para a biossíntese de uma grande variedade de produtos metabólicos naturais e heterologous de alto valor^{1,2,3,4,5, 6.} Vários obstáculos ainda precisam ser superados para expandir sua viabilidade comercial, mais notavelmente, os rendimentos relativamente pobres em comparação com as bioplataformas heterotróficas (por exemplo, Escherichia coli e levedura)⁷. A recente expansão das ....

Protocolo

1. Montagem vetorial usando os kits de ferramentas Plant MoClo e CyanoGate

NOTA: Antes de prosseguir com a montagem vetorial, recomenda-se fortemente que os usuários se familiarizem com as estruturas de nível vetorial dos sistemas Plant e CyanoGate MoClo^12,15.

1. Construção de peças de nível 0
   NOTA: As peças de nível 0 podem ser sintetizadas como vetores completos ou como sequências lineares para montagem com aceitadores de nível 0 (por exemplo, gBlocks, IDT). Alternativamente, as sequências podem ser amplificadas a partir de um modelo de origem (por exemplo, um vetor ou D....

Resultados

Para demonstrar o fluxo de trabalho de montagem golden gate, uma fita de expressão foi montada no vetor de aceitação de nível 1 (Forward) (pICH47732) contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor .......

Discussão

Golden Gate montagem tem várias vantagens em comparação com outros métodos de montagem vetorial, particularmente em termos de escalabilidade^20,21. No entanto, a criação do sistema Golden Gate em um laboratório requer tempo para desenvolver uma familiaridade com as várias partes e bibliotecas vetorial aceitadoras e processos de montagem em geral. O planejamento cuidadoso é muitas vezes necessário para assembléias mais complexas ou ao realizar um grande número de a.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo (X-gal)	Thermo Fisher Scientific	R0404	Utilizado em 2.1.3.
Sal dissódico de adenosina 5-trifosfato (ATP)	Sigma-Aldrich	A2383	Usado na Tabela 2.
Ágar (testado em microbiologia)	Sigma-Aldrich	A1296-500g	Usado em 8.3.
Agarose	Bioline	BIO-41026	Usado em 6.
Citômetro de fluxo Attune NxT	Thermo Fisher	Scientific-usado	em 4.3.1.
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	usada na Tabela 2.
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011	usado na Tabela 2.
BsaI (Eco31I)	Thermo Fisher Scientific	ER0291	usado na Tabela 2.
Carpenicilina dissódica	VWR International	A1491.0005	Utilizada em 2.1.3.
Placas de fundo plano de 24 poços tratadas com Corning Costar TC	Sigma-Aldrich	CLS3527	Usado em 4.1.3.
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	BP231-100	usado em 3.6.2.
Mini Kit de Plantas DNeasy	Kit de extração de DNA Qiagen	69104	. Usado em 5.
Leitor de microplacas FLUOstar Omega	BMG Labtech-Usado		em 4.2.2.
Kit de Minipreparação de Plasmídeos GeneJET	Thermo Fisher Scientific	K0503	Kit de purificação de plasmídeos. Usado na etapa 2.3.2.
Contas de vidro (0,5 mm de diâmetro)	Produtos BioSpec	11079105	Usado em 5.2.
Glicerol	Thermo Fisher Scientific	10021083	usado em 2.3.1, 3.6.2.
Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	10356553	utilizado em 2.1.3.
Sulfato de canamicina (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11815-024	Usado em 2.1.3.
Filtros de membrana (0,45 μ m)	MF-Millipore	HAWP02500	Usado em Microplacas 3.3.7
, 96 poços, fundo plano (Poço de Chaminé) µ CLEAR	Greiner Bio-One	655096	utilizado em 4.2.1.
Kit de Extração de Gel de DNA Monarca	New England Biolabs	T1020S	Usado em 1.1.2.2.
Kit de limpeza de DNA Monarch PCR	New England Biolabs	T1030	Kit de purificação de DNA. Utilizado em 1.1.2.3.
Incubadora Multitron Pro com LEDs	Incubadora Infors HT-Shaker		com luzes LED brancas. Utilizado no ponto 4.1.4.
MyTaq DNA Polimerase	Bioline	BIO-21108	Usado em 7.1.
NanoDrop One	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Usado em 2.3.3.
One Shot TOP10 quimicamente competente E. coli	Thermo Fisher Scientific C404010		Usado em 2.1.1.
Solução salina tampão fosfato (PBS) (concentrado 10X)	VWR International	K813	Utilizado em 4.3.2.
Q5DNA polimerase de alta fidelidade	New England Biolabs	M0491S	usado em 1.1.2.1.
Escada de DNA de 1 kb de carga rápida	New England Biolabs	N0468S	Usado na Figura 4.
Tubos com tampa de rosca (1,5 ml)	Starstedt	72.692.210	Utilizado em 3.6.3
Cloridrato de espectinomicina pentahidratado	VWR International	J61820.06	Utilizado em 2.1.3.
Placas de 96 poços de fundo redondo de Microtitulação Transparente Sterilin	Thermo Fisher Scientific	612U96	Usado em 4.3.1.
T4 DNA ligase	Thermo Fisher Scientific	EL0011	Usado na Tabela 2.
TissueLyser II	Qiagen	85300	Moinho de contas. Usado em 5.2.