Deteção de bactérias tecido-residentes em biópsias da bexiga pela hibridação in situ da fluorescência do rRNA 16S

Resumo

Este protocolo é para a deteção imparcial de bactérias tecido-associadas em biópsias pacientes pela hibridação in situ de 16S rRNA e pela microscopia confocal.

Resumo

A visualização da interação das bactérias com as superfícies e os tecidos Mucosal do anfitrião pode fornecer a introspecção valiosa em mecanismos da patogénese. Embora a visualização de patógenos bacterianos em modelos animais de infecção possa depender de cepas bacterianas projetadas para expressar proteínas fluorescentes como a GFP, a visualização de bactérias dentro da mucosa de biópsias ou tecidos obtidos de pacientes humanos requer um método imparcial. Aqui, nós descrevemos um método eficiente para a deteção de bactérias tecido-associadas em seções humanas da biópsia. Este método utiliza a hibridação in situ fluorescente (peixe) com uma ponta de prova universal etiquetada cDNAs do oligonucleotide para 16s rRNA para etiquetar as bactérias tecido-associadas dentro das seções da biópsia da bexiga adquiridas dos pacientes que sofrem do periódico Infeção do trato urinário. Através do uso de uma sonda de rRNA 16S universal, as bactérias podem ser detectadas sem conhecimento prévio de espécies, gêneros ou características bioquímicas, como o lipopolissacárido (LPS), que seria necessário para a detecção por experimentos de imunofluorescência. Nós descrevemos um protocolo completo para os peixes do rRNA 16S da fixação da biópsia à imagem latente pela microscopia confocal. Este protocolo pode ser adaptado para o uso em quase todo o tipo de tecido e representa uma ferramenta poderosa para o visualização imparcial de interações clìnica-relevantes do bacteriano-anfitrião no tecido paciente. Além disso, usando espécies ou sondas específicas de gêneros, este protocolo pode ser adaptado para a detecção de patógenos bacterianos específicos dentro do tecido do paciente.

Introdução

O trato urinário, consistindo na uretra, bexiga, ureteres e rins é constantemente exposto a bactérias que compõem o microbioma urinário, bem como invasores uropatógenos, como uropatogênicos e. coli (UPEC), a partir do trato ^{gastrointestinal 1,2}. Uma camada de muco hidratado consistindo de glicosaminoglicanos e uma placa impermeável de proteínas de uroplakin glicosiladas expressas na superfície das células superficiais formam uma barreira que protege rotineiramente o epitélio vesical da invasão por aderentes bactérias^3,4. Durante a infecção do trato urinário (ITU), essas barreiras são perturbadas ou destruídas, facilitando o apego e a invasão do epitélio vesical por bactérias uropatogênicas^5,6. O trabalho em modelos murinos revelou que muitas bactérias uropatogênicas, incluindo UPEC, Klebsiella pneumoniaee Enterococcus faecalis , podem formar comunidades intracelulares replicativas (IBCs) dentro do citoplasma de células superficiais e reservatórios intracelulares quiescentes (qirs) dentro das células epiteliais transitórias^7,8,9. Embora UPEC seja identificado dentro das pilhas epithelial da vertente dos pacientes humanos de UTI, a interação dos uropatogénicos com a mucosa da bexiga nos seres humanos não tinha sido visualizada previamente¹⁰.

Nós adaptamos uma técnica comum, hibridação in situ da fluorescência (peixes), para detectar as bactérias dentro da mucosa de biópsias da bexiga obtidas dos pacientes na pós-menopausa que submetem-se à cistoscopia com eletrofulguração do Trigonite (CEFT) para o avançado manejo de ITU recorrente refratária a antibióticos¹¹. Usando uma sonda universal para rRNA 16S, pudemos detectar objetivamente espécies bacterianas associadas à mucosa vesical de pacientes recorrentes de ITU e determinar sua posição dentro da parede da bexiga¹². A ponta de prova universal do nucleotide de 16S rRNA foi projetada previamente alvejar uma região conservada do 16S bacteriano rRNA¹³, que corresponde às posições 388-355 do rRNA de E. coli 16s. As sequências de sonda 16s rRNA e scramble foram previamente validadas e publicadas para uso no trato gastrointestinal do camundongo^14,15. As sequências e propriedades das sondas são descritas na tabela 1. É essencial usar duas seções seqüenciais neste protocolo, uma para a sonda 16S rRNA e outra para a sonda de scramble, para ser capaz de distinguir entre o sinal verdadeiro e de fundo como o epitélio da bexiga, colágeno e elastina exibem autofluorescência¹⁶ . Neste protocolo, as sondas 16S rRNA e scramble foram projetadas com rótulos fluorescentes Alexa fluor 488 em ambos os 3 ' e 5 ' Termini através de ligações éster N-Hidroxisuccinimida (NHS) para aumentar o sinal fluorescente.

Embora este protocolo fosse desenvolvido para o uso em seções humanas da biópsia da bexiga, pode prontamente ser adaptado para o uso em seções parafina-encaixadas de todo o tecido onde as bactérias são acreditadas para residir. Diferentemente de experimentos imunoistoquímicos que visam antígenos específicos (por exemplo, lipopolissacarde) na superfície bacteriana, este método não requer conhecimento prévio de antígenos expressos pelas bactérias associadas ao tecido^10,17 . O uso da sonda universal 16S rRNA permite a detecção imparcial de todas as espécies bacterianas dentro da amostra, mas não permite a determinação de sua identidade. Para determinar a identificação de bactérias detectadas, as espécies ou as sondas de rRNA específicas do gênero 16S ou 23S devem ser usadas. Este protocolo também não detectará patógenos fúngicos, como Candida albicans, associados ao tecido hospedeiro. Para a detecção de patógenos fúngicos, sondas de rRNA 28S ou 18S devem ser usadas¹⁸.

Protocolo

O protocolo do estudo foi aprovado por e seguiu as diretrizes dos comitês institucionais de biossegurança e proteção química da UT Dallas e do centro médico do sudoeste da UT. O uso de biópsias de sujeitos humanos neste protocolo foi aprovado e acompanhado das diretrizes dos conselhos de revisão institucional do UT Dallas e do centro médico do sudoeste da UT. Todos os indivíduos envolvidos com a coleta e o processamento da biópsia têm a atual proteção do sujeito humano (HSP) e o treinamento HIPPA.

1. preparação de tecidos para fixação e incorporação de parafina

Nota: As biópsias foram tomadas das mulheres permite encontrem que submetem-se à cistoscopia com electro-fulguration do Trigonite para a gerência avançada da infecção de aparelho urinário periódica (Ruti). rUTI é definido como 3 UTIs em um período de 12 meses. A coleta de biópsia foi realizada na sala de operação, enquanto o paciente estava anestesia após a obtenção do consentimento informado do paciente por meio do protocolo de UTSW IRB STU 082010-016. Todas as amostras foram codificadas e de-identificadas antes da experimentação.

1. Obter um copo frio (~ 1 mm³) biópsia da bexiga trígono com fórceps urológico via cistoscópio flexível e colocar imediatamente em um estéril 2 ml CryoVial contendo 1,5 ml de 4% v/v paraformaldeído (PFA) preparado em 1x estéril fosfato tampão salina (PBS).
   Nota: 4% PFA em 1X PBS pode ser feito com antecedência e armazenado em-20 ° c até que necessário.
2. Correção de biópsia para 6 h à temperatura ambiente ou para 16-24 h a 4 ° c.
   Nota: A duração da fixação deve ser calculada com base no tamanho da amostra tecidual e a sobrefixação deve ser evitada. Não é aconselhável o uso de glutaraldeído como um fixador, pois introduz autofluorescência.
3. Em uma capa esterilizada ou gabinete de biossegurança, remova o fixador por pipetagem e substitua por 1,5 mL de 1X PBS estéril. Mantenha as amostras a 4 ° c durante a noite ou realize imediatamente o processamento de tecidos e a incorporação de parafina¹⁹.
4. Use um micrótomo esterilizado para seção de blocos de tecido a 5 μm de espessura e aderir as seções de tecido de parafina para lâminas de microscópio de vidro carregada. Um mínimo de duas corrediças por a biópsia será exigido para o protocolo dos peixes do rRNA 16S.
   Nota: O tecido da biópsia deve ser combinado seccionalmente em relação ao plano de corte, a fim de garantir a visualização de camadas urotelial em todas as seções. Também deve ser notado que a espessura da seção deve ser otimizada para a detecção de comunidade bacteriana. As seções mais finas ou a amostragem de seções seriais múltiplas podem ser exigidas no caso das infecções onde as bactérias tecido-residentes são extremamente escassas (por exemplo, < 1 bactéria tecido-residente por 1.000 pilhas de mamíferos).

2. hibridação in situ da fluorescência com pontas de prova universais do rRNA 16S

Nota: São necessários dois slides por biópsia. Um slide é necessário para a sonda universal 16S rRNA e um slide para uma sonda de controle com uma seqüência embaralhada. Isto é importante para distinguir o sinal verdadeiro do sinal do fundo durante a microscopia desde que o epitélio da bexiga é auto-fluorescente em canaletas múltiplas. Além da sonda de embaralhamento, o bloqueio com 0,1% Sudão Black B antes da montagem pode reduzir a autofluorescência de fundo inerente ao tecido²⁰.

1. Preparação dos reagentes e da capa das emanações
   1. Limpe uma capa de fumos vazia (ou gabinete de biossegurança devidamente equipado) com 70% de etanol.
   2. Prepare o tampão da hibridação compreendido do cloreto de sódio de 0,9 M (NaCl), do Tris-HCl de 20 milímetros (pH 7,2), do sulfato do dodecil do sódio de 0,1% (SDS) em 10 ml da água estéril-filtrada.
      Nota: A água estéril-filtrada pode ser preparada passando a água destilada autoclavada através de um filtro de 0,22 μM. O tampão da hibridação pode ser armazenado na temperatura ambiente, mas o SDS pode precipate da solução. Se o SDS precipita, aqueça a solução em um banho de água de 50 ° c antes do uso.
   3. Prepare pelo menos 100 mL cada um de 95% e 90% de etanol em água estéril-filtrada em garrafas lavadas, autoclavadas.
   4. Dissolver sondas liofilizadas fluorescentamente rotuladas em 10 mM de Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mM de ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) tampão (TE) preparado em água livre de nuclease esterilizada por filtro para uma concentração final de 100 μM. Prepare uma diluição de 1 μM no tampão TE para uso neste protocolo. Armazene o estoque concentrado de 100 μM e as sondas reconstituídas em estoque de 1 μM a-20 ° c protegidas da luz.
      Nota: Não dissolva sondas rotuladas fluorescentamente em água. O tampão é exigido para impedir a hidrólise da ligação do éster do NHS que conjugando o fluoróforo à ponta de prova do nucleotide.
   5. Limpe cinco frascos de Coplin com 70% de etanol, deixe secar, rotule da seguinte forma: xilenos I, xilenos II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH₂o e preencha com 100 ml da solução apropriada. Isso ajudará a evitar confusão em etapas posteriores.
2. De-paraffinização e reidratação tecidual
   1. No capô, coloque duas lâminas por biópsia em um rack de slides vertical.
   2. Coloque um rack de slides vertical no frasco de xilenos I Coplin (contendo 100 ml de xilenos) por 10 min.
   3. Retire o rack de slides de xilenos I e blot o fundo em uma toalha de papel para remover o excesso de xilenos. Coloque no frasco de xilenos II Coplin por 10 min.
      Nota: Nunca trabalhe com xilenos fora de uma capa de fumaça certificada.
   4. Rehidratar secções de tecido desparaffinizado em sucessivas lavas de etanol (95% e 90%) durante 10 min cada um dos frascos Coplin rotulados respectivamente.
      Nota: Durante este estágio, aqueça o amortecedor da hibridação a 50-56 ° c em um banho de água
   5. Retire a cremalheira da corrediça da lavagem do etanol 90%, borre a parte inferior em toalhas de papel para remover o excesso de etanol, e coloc no frasco do Coplin de ddH₂o que contem 100 ml do DDH filtro-esterilizado₂o para 10 minutos.
   6. Enquanto aguarda o ddH₂o Wash, diluir as sondas para 10 nm em tampão de hibridação para criar a solução de coloração. Prepare 150 μL de solução de coloração por lâmina.
      Nota: Proteja a solução de coloração da luz envolvendo os tubos na folha de alumínio e armazenando em uma gaveta. Ao trabalhar com pontas de prova etiquetadas cDNAs no benchtop, considere desligar luzes aéreas quando capaz. As sondas diluídas em tampão de hibridação não devem ser reutilizadas.
3. Hibridação e contrcoloração
   1. Prepare uma câmara de umidificação para cada sonda colocando encharcado, amassado Kimwipe e água estéril para o reservatório de uma caixa de ponta P1000. Coloque o cartucho de suporte de ponta em cima-é onde os slides se sentarão.
      Nota: É importante usar uma câmara de umidificação para impedir que as seções da biópsia SECem para fora durante a hibridação. Deve notar-se que as câmaras de humidificador disponíveis comercialmente são concebidas para manter uma atmosfera estável e húmida. No entanto, a técnica detalhada aqui controla suficientemente a umidade a um custo substancialmente menor.
   2. Retire os slides do rack de slides e coloque em uma toalha de papel fresca (lado do tecido para cima). Use um Kimwipe para secar o slide. Tenha cuidado para apenas suavemente DAB perto (não ligado) a seção de biópsia para pavio afastado de água. Usando uma caneta hidrofóbica, desenhe uma borda ao redor da seção de biópsia e coloque o lado do tecido da corrediça para cima na câmara de umidificação.
      Nota: Trabalhe rapidamente de modo que os tecidos não secam antes da hibridação.
   3. Coloc a câmara de umidificação em uma incubadora ajustada a 50 ° c. Pipetar 50-150 μL da solução de coloração diretamente no topo do tecido, de modo que o retângulo feito pela borda hidrofóbica ao redor do tecido esteja preenchido. Tenha cuidado para não acrescentar demasiada solução a transbordar a fronteira hidrofóbica. Feche a caixa suavemente.
   4. Incubar durante a noite (~ 16 h) a 50 ° c no escuro. Se a incubadora tem uma janela, cubra-a com a folha de alumínio para criar um ambiente escuro.
      Nota: Uma temperatura da hibridação abaixo da temperatura de derretimento da ponta de prova dos peixes é exigida para o sinal de confiança. o ° c 50 é a temperatura óptima para a ponta de prova universal do rRNA 16S mas não pode ser ideal para outras pontas de prova.
   5. Na manhã seguinte, prepare pelo menos 500 mL de tampão de lavagem composto de 0,9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) em ddH₂O e filtro-esterilize em uma garrafa estéril com um filtro de frasco-Top de vácuo. Aqueça a 50-56 ° c em um banho de água.
   6. Retire os slides das câmaras de umidificação e cuidadosamente pavio qualquer solução de hibridação restante com um Kimwipe. Coloque os slides em um rack de coloração vertical.
   7. Coloque o rack de coloração em um frasco de Coplin opaco contendo 100 mL de tampão de lavagem pré-aquecido por 10 min. Se os frascos de Coplin não forem opacos (por exemplo, vidro), coloque-os no escuro durante as etapas de incubação — talvez uma caixa ou em uma gaveta.
   8. Repita a etapa de lavagem duas vezes com o tampão fresco da lavagem em uns frascos novos de Coplin.
   9. Durante os passos de lavagem, prepare a contratura diluindo uma solução de 100 μg/mL de Hoechst 33342 1:1000 em tampão de lavagem. Para o mesmo tubo, adicionar Alexa-555 germe de trigo aglutinina (WGA) para uma concentração final de 5μg/mL e Alexa-555 Phalloidin a uma concentração final de 33 nM. Guarde no escuro até estar pronto para uso.
      Nota: Hoechst, Alexa-555 WGA, e Alexa-555 Phalloidin Label DNA, mucin/uroplakins, e Actin, respectivamente e podem ser armazenados a longo prazo no escuro por instruções do fabricante. As etiquetas fluorescentes usadas para pontas de prova e as contrações podem ser personalizadas para os jogos do filtro disponíveis para que o microscópio seja usado.
   10. Retire os slides da última lavagem e gentilmente pavio afastado excesso de tampão de lavagem com um Kimwipe. Coloque o lado do tecido dos slides acima em uma toalha de papel e adicione 50-150 μL de contratura diretamente em cima do tecido para que a borda hidrofóbica seja preenchida, mas não transbordando. Cubra até quatro corrediças com um cryobox-parte superior e incubar por 10 minutos na temperatura ambiente.
   11. Coloque os lados de volta no rack de coloração e lave duas vezes mais em frascos de Coplin com tampão de lavagem fresco, por 10 min cada.
   12. Seque completamente as lâminas após a última lavagem e coloque o lado do tecido em cima de uma toalha de papel um criote-Top. Esprema uma gota de suportes de montagem diretamente em cima do tecido. Coloc delicadamente um lamela apropriadamente feito medida (dependerá do tamanho da biópsia) na parte superior. Pressione suavemente para fora todas as bolhas como eles vão interferir com a imagem e permitir que a tampa-escorregou slides para curar durante a noite no escuro.
   13. No dia seguinte, selar as bordas da lamínula para o slide com um casaco leve de verniz claro. Deixe secar por 10 min no escuro e, em seguida, guarde no escuro a 4 ° c para microscopia confocal.

3. visualização de 16S rRNA FISH por microscopia confocal

Nota: Para este protocolo, os melhores resultados são conseguidos com um microscópio confocal da laser-exploração com objetivos 63x e 100x. São necessários conjuntos de filtros adequados para visualização de fluorescência Hoechst, Alexa-488 e Alexa-555. Entretanto, a microscopia fluorescente padrão pode ser usada se um microscópio confocal não está disponível. Este protocolo é para um microscópio confocal da exploração do laser.

1. Ligue o microscópio confocal e o software de computador associado com o microscópio por instruções do fabricante.
2. Carregue o slide e visualize com o objetivo 10x no canal azul (DAPI/Hoechst). Concentre-se cuidadosamente até que os núcleos estejam visíveis.
3. Uma vez focado, mude o objetivo para alta ampliação (63x ou 100x). Adicione o óleo em cima do deslizamento da tampa. Reconcentre-se com o novo objetivo, certificando-se de que a lente objetiva entra em contato com o óleo enquanto se concentra.
   Nota: Use somente a multa que focalizam na ampliação elevada (63x ou 100x). O óleo só deve ser usado para um objetivo de óleo.
4. Avalie rapidamente cada slide através da peça ocular no canal verde (eGFP/Alexa-488) para determinar quais slides são peixes positivos e quais são os peixes negativos.
   Nota: É melhor se esta avaliação inicial/Pontuação é feita cega por um indivíduo separado para reduzir o viés experimental.
5. Para a imagem das biópsias manchadas, comece com um slide positivo FISH e alterne para o modo de visualização do computador. Selecione os canais 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555). Ajuste o furo de pino usando o canal o mais longo do comprimento de onda, neste caso 555. Encontre o plano focal correto para visualização de bactérias rotuladas no canal 488. Sem alterar o plano focal, defina o ganho, a potência do laser e o deslocamento para cada canal, de forma que o sinal não esteja saturado, e o plano de fundo não seja corrigido mais. Adquira a imagem em todos os três canais.
   Nota: Use as mesmas configurações para o canal 488 para a imagem de cada slide em uma experiência. O poder do laser pode exigir o ajuste nos canais 405 e 555 se o plano focal ideal para a visualização bacteriana muda entre campos.
6. Repita em campos adicionais até adquirir imagens de toda a superfície epitelial.
   Nota: Você pode ter que mudar o plano focal ligeiramente para visualizar as bactérias rotuladas em diferentes campos, mas nunca mudar o ganho, a potência do laser, ou deslocamento para o canal 488 entre os campos. Se trabalhar em um microscópio confocal, pode ser informativo capturar uma Z-pilha de modo que a localização tridimensional das bactérias dentro do tecido possa ser analisada.
7. Processar imagens e quantificar bactérias rotuladas dentro ou associado com o tecido usando ImageJ ou software similar. O processamento mínimo das imagens é recomendado (por exemplo, dividindo/mesclando canais e convertendo em arquivos de imagem), embora a correção de fundo possa ser realizada, se necessário. Todas as correções ou outras alterações devem permanecer consistentes entre as imagens.

Resultados

O protocolo foi aperfeiçoado para a deteção imparcial das bactérias associadas com a mucosa da bexiga em seções parafina-encaixadas da biópsia da bexiga. A Figura 1 retrata micrografias confocais representativas de um experimento utilizando este protocolo em seções de biópsias de bexiga obtidas de mulheres com infecção urinária recorrente. Duas seções seriais foram hibridizadas com o universal 16S rRNA (painéis superiores) ou scramble (painéis inferiores) sondas. As imagens da mesma região do tecido foram tomadas e as bactérias (verdes) são claramente visíveis no tecido hibridizado com as pontas de prova do rRNA 16S e não com a ponta de prova da scramble. A Figura 2 representa um resultado falso positivo. O sinal correspondente ao colágeno autofluorescente ou elastina é detectado nos canais 405 e 488 em ambas as seções 16S rRNA e scramble sonda-hibridizada de biópsia destacando a importância de sempre usar um controle de sonda de embaralhador.

Sonda	Seqüência	Tm	Fluoróforo	Ligação
Universal 16S rRNA	5 '-GCTGCCTCCC GTAGGAGT-3 '	54,9	Alexa-488 (5 ' e 3 ')	Ester NHS
Scramble	5 '-ACTCCTACGG GAGGCAGC-3 '	NA	Alexa-488 (5 ' e 3 ')	Ester NHS

Tabela 1: sequências e características da sonda Fish. TM indica a temperatura de derretimento e o NHS é uma abreviatura para N-Hydroxysuccinimide.

Figura 1: micrografias confocal representativos dos peixes do rRNA 16s universal e da ponta de prova da scramble em uma biópsia humana da bexiga. Actin e mucin são rotulados em vermelho, núcleos celulares são rotulados em azul, e bactérias em verde. As bactérias tecido-associadas são detectadas somente com a ponta de prova 16SrRNA e não a disputa. Imagens tiradas em ampliação de 63x. Barra de escala = 20 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: micrografias confocal representativos do autofluorescence verde falso-positivo em uma biópsia humana da bexiga. Actina e mucina são rotulados em vermelho, núcleos celulares são rotulados em azul, e bactérias e componentes autofluorescentes da matriz extracelular (por exemplo, colágeno e elastina) são verdes. A fluorescência verde é observada com o rRNA 16S e as pontas de prova da Scramble que indicam um resultado falso-positivo. As imagens são tiradas a uma ampliação de 63x. Barra de escala = 20 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a deteção de bactérias tecido-associadas em biópsias humanas da bexiga por 16S rRNA FlSH. Este protocolo pode facilmente ser adaptado para as biópsias tomadas de outros tecidos, tais como o aparelho gastrointestinal ou a pele, e pode ser estendido aos tecidos colhidos de uma variedade de organismos modelo mamíferos. O protocolo aqui descrito também pode ser adaptado para o uso de técnicas de fixação múltipla (por exemplo, formalina, etanol, metacarn) e preparação de tecidos (por exemplo, parafina ou resina incorporada e tecidos criopreservados). A sonda de rRNA 16S universal com rótulo duplo permite a detecção imparcial de todas as espécies bacterianas presentes dentro do tecido e pode fornecer insights valiosos sobre como os patógenos e a microbiota interagem espacialmente com as superfícies mucosas na doença e saudáveis Estados. Usando recursos como o probeBase, o PhylOPDb ou a ferramenta PROBE_DESIGN do pacote de software ARB para a seleção ou o projeto de espécies ou sondas de rRNA de 16S ou 23S específicas de gêneros, este protocolo pode ser adaptado para a detecção de espécies ou gêneros bacterianos específicos dentro do tecido^15,21,22. Uma importante direção futura para este método é a multiplexação usando sondas específicas de espécies ou gêneros rotuladas com fluoróforos distintos e discretos para avaliação da diversidade microbiana dentro da mucosa da bexiga.

A limitação preliminar deste método para o uso em espécimes humanos é a disponibilidade do tecido biópsia. Aprovação do Conselho de revisão institucional e consentimento informado do paciente são necessários para obter biópsias e colaboração direta com o clínico realizando o procedimento é necessário para a coleta de amostra ideal e acesso aos metadados do paciente. O próprio procedimento do CEFT destrói o epitélio vesical, então pudemos justificar a biópsia dessas áreas antes do procedimento. Uma capa de fumos ou um gabinete de biossegurança devidamente equipado é necessário para este protocolo devido ao uso de xilenos tóxicos na etapa de desparaffinização e a necessidade de manter um ambiente estéril durante todo o procedimento. Um microscópio fluorescente, preferencialmente confocal, com um objetivo de 63x ou 100x e conjuntos de filtros apropriados para visualização de Hoechst, Alexa-555 e Alexa-488 é necessário para este protocolo. Os resultados representativos representados na Figura 1 foram fotografados com microscópio confocal de varredura a laser. Microscópios de digitalização a laser semelhantes devem produzir imagens comparáveis. Este protocolo é limitado pela sua capacidade de detectar apenas bactérias associadas ao tecido e não, por exemplo, fungos. As sondas específicas do fungo 18S ou 28S rRNA devem ser usadas para identificar patógenos fúngicos no tecido¹⁸.

As etapas críticas a este protocolo incluem manter um ambiente estéril durante todo o procedimento e assegurar-se de que o tecido não seque para fora entre a hibridação e as etapas de mancha. Se o tecido secar durante o procedimento, o sinal pode ser umedecido ou o tecido pode cair da corrediça durante uma etapa da lavagem. É igualmente crítico usar sempre duas seções seriais para este protocolo — uma para a ponta de prova 16S rRNA e uma para a ponta de prova da scramble. Sem esse controle, pode ser muito difícil distinguir falsos positivos e os dados obtidos podem não ser úteis ou informativos. Se este protocolo está sendo adaptado para o uso com uma ponta de prova à excepção da ponta de prova universal do rRNA 16S, o cuidado deve ser tomado para selecionar uma temperatura apropriada da hibridação, aproximadamente 5 ° c mais baixo do que a temperatura de derretimento prevista da ponta de prova. Para manter a intensidade do sinal, o tecido não deve ser exposto à luz por longos períodos de tempo após a sonda ter sido adicionada e não deve ser superexposta durante a microscopia. Por último, durante a microscopia, as mesmas configurações para o canal correspondente à fluoróforo conjugada à sonda FISH devem ser mantidas consistentes entre as lâminas experimentais (sonda rRNA 16S) e controle (sonda de corrida). A visualização da relação espacial das bactérias dentro das superfícies mucosas dos tecidos derivados do paciente é fundamental para a compreensão e a construção de hipóteses clinicamente relevantes sobre as interações patogênicas subjacentes à doença infecciosa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Alexa-555 Faloidina	Invitrogen	A34055	Coloração Actina
Alexa-555 Aglutinina de Gérmen de Trigo (WGA)	Invitrogen	W32464	Coloração Mucina
Filtros superiores de garrafa	Fisher Scientific	09-741-07	Esterilização
Coplin Jar	Simport	M900-12W	Desparafinização/lavagem
Lamínulas	Fisher Scientific	12-548-5M	Microscopia
Etanol	Fisher Scientific	04-355-224	Reidratação
Ácido etilenodiaminotetracético, sal dissódico di-hidratado	Fisher Scientific	S311-500	TE
Lâminas foscas	Thermo Fisher Scientific	12-550-343
Hoechst 33342, cloridrato, trihidrato	Invitrogen	H21492	Coloração Marcador
hidrofóbico	Vector Laboratories	H-4000	Barreira hidrofóbica
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666-11
Óleo Immersol 518 F	Fisher Scientific	12-624-66A	Microscopia
Paraformaldeído (16%)	Thermo Scientific	TJ274997
ProLong Gold reagente antidesbotamento	Invitrogen	P36934	Meio de montagem
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	BP358-10	Tampão de hibridização / PBS
Dodecil sulfato de sódio	Fisher Scientific	BP166-500	Tampão de hibridização
Fosfato de sódio dibásico Hepahidratado	Fisher Scientific	S373-500	PBS
Fosfato de sódio monobásico monohidratado	Fisher Scientific	Seringa S369-500	PBS
	VWR	75486-756	Esterilização
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP152-5	TE/Tampão de hibridização
Xileno	Fisher Chemical	X3P-1GAL	Desparafinização
0,22 μ m filtro de seringa	Fisher Scientific	09-754-29	Esterilização