Presente aqui está um protocolo detalhado para o uso de embriões de zebrafish Tg(vtg1: mCherry) para a detecção de efeitos estrogênicos. O protocolo abrange a propagação do peixe e o tratamento de embriões, e enfatiza a detecção, documentação e avaliação de sinais fluorescentes induzidos por compostos disruptores endócrinos (EDC).
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Artigo de método
Usando embriões de zebrafish Tg (Vtg1:mcherry) para testar os efeitos estrogênicos dos compostos disruptivos endócrinos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Existem muitos compostos endócrinos (EDC) no ambiente, especialmente substâncias estrogênicas. A detecção dessas substâncias é difícil devido à sua diversidade química; por isso, são utilizados métodos cada vez mais detectadores de efeitos, como organismos biomonitor/bioindicadores sensíveis ao efeito estrogênico. Esses organismos biomonitorantes incluem vários modelos de peixes. Este protocolo abrange o uso da linha transgênica de zebrafish Tg(vtg1: mCherry) como organismo biomonitorador, incluindo a propagação de peixes e o tratamento de embriões, com ênfase na detecção, documentação e avaliação de sinais fluorescentes induzidos pelo EDC. O objetivo do trabalho é a demonstração do uso dos embriões transgênicos Tg(vtg1: mCherry) para detectar efeitos estrogênicos. Este trabalho documenta o uso de embriões transgênicos de zebrafish Tg(vtg1: mCherry) para a detecção de efeitos estrogênicos testando duas substâncias estrogênicas, α- e β-zearalenol. O protocolo descrito é apenas uma base para a concepção de ensaios; o método de teste pode ser variado de acordo com os pontos finais do teste e as amostras. Além disso, pode ser combinado com outros métodos de ensaio, facilitando assim o uso futuro da linha transgênica.
Introdução
Há um número significativo de compostos endócrinos (EDC) que estão entre as substâncias mais perigosas em nosso ambiente. Estes são principalmente compostos estrogênicos que contaminam a água dos recursos naturais. A diversidade química das substâncias pertencentes ao grupo dificulta os testes para sua presença, uma vez que diferentes métodos analíticos são necessários para sua detecção. Com base em sua estrutura química é muito difícil determinar se uma substância é realmente capaz de agir como um estrogênio. Além disso, essas substâncias nunca estão presentes de forma pura no ambiente, de modo que seus efeitos podem ser afetados por outros compostos, também
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Protocolo
O Protocolo Animal foi aprovado pela Lei húngara de Bem-Estar Animal e todos os estudos foram concluídos antes que os indivíduos tratados chegassem à fase de alimentação gratuita.
1. Colheita e tratamento de embriões
- Mantenha o peixe-zebra Tg(vtg1:mCherry) a 25,5 ± 0,5 °C, pH = 7 ± 0,2, condutividade entre 525 ± 50 μS/m, nível de oxigênio ≥80% de saturação e luz de 14h e ciclo escuro de 10h.
- Encha os tanques de acasalamento com água do sistema e configure os peixes para acasalar à tarde antes de colher ovos.
- Coloque os peixes machos e fêmeas no tanque e separe-os com a ajuda de um divisor.
- Re....
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Resultados
No experimento apresentado neste manuscrito, os efeitos de duas substâncias estrogênicas foram testados em cinco concentrações a partir da fertilização por 5 dias em embriões de zebrafish Tg (vtg1:mCherry). Investigamos se os sinais fluorescentes apareceram no fígado dos peixes no final do tempo de exposição por causa das substâncias e se havia diferenças na estrogenicidade das duas substâncias. Os resultados foram avaliados com base nas imagens fluorescentes e nos valores de densidade integrada. Em geral, ambas.......
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Discussão
O uso de biomonitoradores/bioindicadores para efeitos estrogênicos vem se espalhando em estudos toxicológicos. Os modelos in vivo desempenham um papel notável, pois ao contrário dos testes in vitro, eles não só fornecem informações sobre a resposta de uma célula ou de um receptor, mas também permitem a investigação de processos complexos no organismo. Várias linhas transgênicas para o estudo de efeitos estrogênicos foram produzidas a partir de zebrafish, uma das quais Tg(vtg1:mCherry) foi usada para estes estudo.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho contou com o apoio do Escritório Nacional de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação (NKFIH) do Fundo Nacional de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação (NKFIA); Acordo de Subvenção: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 projeto co-financiado pela União Europeia, e o Programa de Excelência Temática NKFIH-831-10/2019 da Universidade Szent István, concedido pelo Ministério da Inovação e Tecnologia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de tecidos de 24 poços | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| Software GraphPad Prism 6.01 | GraphPad Software Inc. | ||
| Software ImageJ | National Institutes of Health, EUA | Software de acesso público, disponível para download em: http://imagej.nih.gov/ | |
| Software calibrado Leica Application Suite X | Leica Microsystems GmbH. | Usamos o softver descrito nos experimentos, mas qualquer software fotográfico está em conformidade com os testes | |
| Leica M205 FA estereomicroscópio, Leica DFC 7000T câmera | Leica Microsystems GmbH. | Utilizamos os equipamentos descritos nos experimentos, mas qualquer estereomicroscópio fluorescente é adequado para os testes | |
| de sulfato de magnésio (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mFiltro de cereja | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-celulose | Sigma Aldrich Ltd. | ||
| Ponteira de pipeta Microloader | Eppendorf GmbH. | ||
| pipeta Pasteur | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Cloreto de potássio (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricano-metanossulfonato (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
Referências
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity o....
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Reimpressões e permissões
