Summary
Dit protocol beschrijft hoe de overgang van de speen-naar-spening in vitro met behulp van de muis late foetale intestinale organoïden gecultiveerde voor 30 dagen.
Abstract
Aan het einde van de speen periode ondergaan veel zoogdiersoorten grote veranderingen in het darm epitheel die gepaard gaan met het vermogen om vast voedsel te verteren. Dit proces wordt genoemd Suckling-to-spening overgang en resulteert in de vervanging van neonataal epitheel met volwassen epitheel die hand in hand gaat met metabole en morfologische aanpassingen. Deze complexe veranderingen in de ontwikkeling zijn het resultaat van een genetisch programma dat intrinsiek is voor de intestinale Epitheelcellen, maar kan tot op zekere hoogte worden gemoduleerd door extrinsieke factoren. Langdurige cultuur van muis primaire intestinale epitheliale cellen uit de late foetale periode, aan Suckling-to-spening overgang in vitro. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor muis foetale intestinale organoïde cultuur die het meest geschikt is om dit proces in vitro te modelleren. We beschrijven verschillende nuttige testen die zijn ontworpen om de verandering van intestinale functies die gepaard gaan met de overgang van de speen-naar-spening in de tijd te bewaken. Daarnaast bevatten we een voorbeeld van een extrinsieke factor die in vivo de overgang van speen-naar-spening kan beïnvloeden, als een weergave van het moduleren van de timing van de overgang van speen-naar-spening in vitro. Deze in vitro aanpak kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen van de overgang van de speen-naar-spening en de modulatoren van dit proces te bestuderen. Belangrijk is dat met betrekking tot de dierlijke ethiek in het onderzoek, het vervangen van de in vivo modellen door dit in vitro model bijdraagt aan de verfijning van dier experimenten en mogelijk tot een vermindering van het gebruik van dieren om gut maturatie processen te bestuderen.
Introduction
Bij veel zoogdiersoorten, waaronder muizen en mannen, heeft de neonatale darm verschillende kenmerken die onderscheiden zijn van het volledig volwassen darm epitheel. Deze functies vergemakkelijken neonatale enterocyten om melk te verteren en te absorberen, die veel vet en lage koolhydraten bevat, met lactose als de belangrijkste koolhydraten. De borstel rand van de neonatale intestinale epitheelcellen uitdrukken de disaccharidase lactase-phlorizin hydrolase (LCT)1 om de melkdisaccharide lactose te verteren. Na de speen periode passen enterocyten zich aan om vast voedsel te verteren dat rijk is aan complexe koolhydraten en laag in vet. Dit manifesteert zich door een schakelaar in de borstel rand disaccharidase expressie van lactase naar sucrase-isomaltase (SIS) en trehalase (Treh), die meer complexe koolhydraten in vaste voeding kan verteren2. Een andere metabole switch is gerelateerd aan de lage concentratie van arginine in melk. Om te voorzien in de noodzaak van arginine, neonatale enterocyten Express de snelheid beperkende enzym in arginine biosynthese, argininosuccinate synthase-1 (Ass1), naar synthetize arginine3. In tegenstelling, volwassen enterocyten Express arginase 2 (Arg2), een enzym geschikt voor het catabolizing arginine dat is overvloedig in vaste voedingsmiddelen. Bovendien drukt het neonatale intestinale epitheel de neonatale FC-receptor voor immunoglobulinen (FcRn) uit, die de absorptie van de maternale IgG van de melk inde bloedsomloop/bloedstroombegaat. De uitdrukking van FcRn daalt aanzienlijk tijdens de overgang van suckling-to-spening5. Bij muizen komt de rijping van paneth cellen postnataal voor, toevallig met de vorming en rijping van crypten, en wordt gekenmerkt door expressie van antimicrobiële peptiden lysosoom (lyz) en defensinen6.
Al deze veranderingen maken deel uit van de overgang van de suckling-to-spening, een proces dat geleidelijk na de geboorte plaatsvindt tot een maand oud in muizen, wanneer het intestinale epitheel zijn volwassen volwassen staat bereikt. De overgang van speen-naar-spening is intrinsiek gereguleerd en ontwikkelt zich in de darm buis. Transcriptiefactor B lymfocyten-geïnduceerde maturatie proteïne-1 (Blimp-1) speelt een belangrijke rol in dit intrinsieke rijpingsproces7. Blimp-1 wordt sterk uitgedrukt in neonataal epitheel, terwijl de uitdrukking afneemt en verloren gaat tijdens de overgang van de speen-naar-spening en daarom kan dienen als een betrouwbare marker van het neonatale intestinale epitheel. Ondanks dat het een intrinsiek proces is, kan de overgang van de suckling-to-spening worden gemoduleerd door externe factoren. Het synthetische analogon van cortisol, dexamethason, is bijvoorbeeld bekend om de darm rijping in vivo8,9te versnellen.
Huidige in vitro-modellen gebruikt voor de studie van intestinale epitheliale rijping met inbegrip van de suckling-to-spening overgang, gebruik maken van volwassen epitheliale cellijnen en/of volwassen organoïden die kenmerken van volwassen intestinale epitheel dragen. We hebben onlangs aangetoond dat primaire intestinale epitheliale cellen geïsoleerd uit de late foetale darm volwassen en even de overgang van de suckling-to-spening bij het kweken in vitro als organoïden10. We hebben verder aangetoond dat dit darmrijpings proces in vitro in hetzelfde tempo optreedt als in vivo. Tot slot gebruikten we dexamethason om het rijpingsproces te versnellen op dezelfde manier als beschreven in vivo studies.
Hier schetsen we een nauwkeurig protocol voor de isolatie en cultuur van de muis laat foetale intestinale organoïden. We beschrijven de beste manier om monsters te verzamelen voor langdurige organoïde cultuur en methoden om de overgang van speen-naar-spening in vitro te bewaken. Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro studies van intestinale epitheliale rijping en modulatoren van dit proces en resulteert in een hogere doorvoer, verhoogde kwaliteit en translationele waarde van de gegevens en een vermindering van het gebruik van dieren.
Protocol
Deze studie is uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren die zijn opgericht door het Ethic Committee for dier experimenten van de Universiteit van Amsterdam in volledige overeenstemming met de nationale wetgeving inzake dierlijk onderzoek volgens de Europese richtlijn 2010/63/EU voor het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden (ALC312).
1. isolatie van foetale kleine intestinale organoïden
- Offeren de E18-E20 foetussen door onthoofding met chirurgische schaar, volgens de goedgekeurde ethische voorschriften.
- Onmiddellijk na euthanasie, voorzichtig te snijden Open de onderbuik van de foetus met intestinale schaar en verwijder de hele darm.
Opmerking: isolatie moet worden uitgevoerd met darmen tussen E18 en E20 van de dracht om de juiste overgang en rijping van de speen tot het spenen in vitro te bereiken. - Met twee kleine Tang, strek de darm. Gebruik de maag en de appendix als geleidingen, snijd het proximale en distale deel van de dunne darm uit elkaar.
Opmerking: als dissectie zorgvuldig is gedaan, is het mogelijk om de Colon ook te isoleren. Snijd het uit elkaar met behulp van aanhangsel als leidraad (Figuur 1). - Maak de darm longitudinaal open: Bevestig de darm met behulp van een scheermesje in de lengte geplaatst en trek de darm door te schuiven Tang (een arm van de Tang aan elke kant van het scheermesje) langs het scheermesje. Snijd vervolgens de geopende darm in stukjes van 1 cm.
- Bereid 2 50 mL buisjes met 10 mL ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Breng de proximale en distale deel van de dunne darm (en de dikke darm indien van toepassing) afzonderlijk aan de buizen. Houd de buisjes op het ijs terwijl de darmen van extra muizen worden ontleed. Verzamel alle intestinale delen van één nest samen in dezelfde buis.
Opmerking: een nest heeft meestal 6-10 fetuses. De darmen van alle foetussen moeten worden gecombineerd. Dit bedrag moet voldoende zijn om 4-8 putten te leveren met organoïden, in een 48-putplaat, per darm deel. - Ga verder met organoïde-isolatie zoals eerder beschreven11. Kortom, het wassen van darm stukken met ijskoude PBS, incuberen met 2 mm ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) gedurende 30 minuten bij 4 °c, distantiëren de crypten van het weefsel door het hard wassen van de stukken met ijskoud PBS + 10% foetaal kalf serum (FCS), filter met behulp van een 70 μm celzeef en centrifuge om de crypten te verzamelen bij 150 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
- Plaat 4 tot 8 putten met crypten in extracellulaire matrix gel, afhankelijk van de korrelgrootte, in een warme 48-goed plaat. Gebruik 20 μL crypten gesuspendeerd in extracellulaire matrix gel per put. Laat de extracellulaire matrixgel gedurende 10 minuten stollen in een incubator van 37 °C.
Opmerking: gezien het feit dat slechts 40% tot 50% van de geïsoleerde crypten organoïden vormen, streven naar een dichtheid van 250 tot 300 organoïden per put. Voeg eerst minder extracellulaire matrix gel toe dan nodig. Kijk onder de Microscoop na het platting van de eerste put om te analyseren of de dichtheid van de geïsoleerde crypten ideaal is. Voeg indien nodig meer extracellulaire matrix gel toe. - Bereid ondertussen ENR-medium: 14 mL gevorderd Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium/Ham F-12 (DMEM/F12) 1:1 + + + (aangevuld met 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) 1x, L-glutamine 0,01 M en 0,2 e/mL Penicillaire/streptomycine), 4 mL met Noggin geconditioneerde media, 2 mL Rspondin-400 μL van B27 supplement 1x, 200 μL N2-supplement 1x, 50 μL van 1,25 mM n-Acetylcysteïne, 20 μL van 0,05 μg/mL epidermale groei factor (EFG).
Opmerking: bij het kweken van Colon organoïden, supplement met 50% WNT geconditioneerde media. - Voeg 250 μL ENR-medium per put toe.
2. kweken van foetale organoïden
- Verander het medium van de culturen 3 keer per week. Rijping van de organoïden wordt bereikt na 1 maand cultuur.
- Tel op dag 3 na elke passage het aantal sferoïden en organoïden met behulp van een optische Microscoop. Kwantificeer ten minste 3 putjes per aandoening en alle organoïden die in elk putje aanwezig zijn.
Opmerking: het aantal sferoïden vermindert met de tijd, terwijl het aantal organoïden toeneemt (Figuur 2). - Doorgang de organoïden eenmaal per week door mechanische dissociatie zoals hieronder beschreven.
- Verwijder medium en voeg 1 mL ijskoude Advanced DMEM/F12 1:1 + + + toe. Verzamel alle extracellulaire matrix gels met organoïden in een buis van 15 mL. Gebruik een 200 μL Tip bovenop een filterpunt van 1000 μL en Pipetteer 20 keer omhoog en omlaag om de organoïden te verstoren.
- Centrifugeer bij 150 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en regeer de pellet in 20 μL extracellulaire matrix gel per put. Meestal kunnen foetale organoïden worden uitgebreid in een verhouding van 1:2.
- Laat extracellulaire matrix gel stollen voor 5-10 min. Voeg 250 μL ENR medium per put toe.
3. maturatie analyse op RNA en eiwit niveau
- Analyseer elke 3 dagen na elke passage de cultuur gedurende een periode van 1 maand (d.w.z. de tijd waarin de volledige rijping is bereikt) (Figuur 3).
Opmerking: foetale organoïde cultuur is dynamisch (film 1) en om variatie van de normale regeneratie van organoïden na mechanische verstoring te voorkomen, is het noodzakelijk om altijd monsters te verzamelen op dezelfde dag na de passage. -
RNA-isolatie
- Verzamel 3 putten van organoïden met 200 μL RNA lysisbuffer voor elke goed aangevuld met 2 μL β-mercaptoethanol. Na het toevoegen van RNA lysis buffer + β-mercaptoethanol aan de put, zorg ervoor dat alle extracellulaire matrix gel met organoïden wordt overgebracht naar een RNase-vrije 1,5 mL buis.
- Vortex krachtig en houd bij-80 °C gedurende niet langer dan 1 maand. Isoleren van RNA met behulp van commercieel beschikbare silica spin kolom Kits.
- Om de kwaliteit van RNA te verhogen, Voeg na het wassen van de stappen 500 μL van 80% EtOH toe en meng zachtjes door de kolom te inverteren. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 11.000 x g om de kolom volledig te drogen.
Opmerking: Zorg ervoor dat de binnenkant van de deksel van de buis te wassen met de 80% EtOH door te flikken de buis ondersteboven drie tot vijf keer om zich te ontdoen van alle sporen van guanidine thiocyanaat. - Om RNA-opbrengst te verhogen, wacht 1-2 min na het aanbrengen van RNase-vrij water voor centrifuge. Re-elueren RNA door het toepassen van de eerste doorstromings elaat aan de kolom een tweede keer.
Opmerking: geïsoleerde RNA-kwaliteit is voldoende voor gebruik in Genome-wide expressie analyse. Controleer of het RNA-integriteits nummer hoger is dan 8.
-
Eiwit isolatie
- Verzamel 5 putten van organoïden met behulp van 250 μL ijskoude cel herstel oplossing in 1 15 mL Tube. Inbroed gedurende ten minste 30 minuten op ijs om de extracellulaire matrix gel op te lossen (dit zal de eiwit bijdrage van de extracellulaire matrix gel verminderen).
- Wassen met ijskoude PBS. Voeg 250 μL cellysisbuffer toe en bewaar bij-80 °C.
Let op: na sonicatie kunnen monsters worden gebruikt om enzymactiviteit of voor westerse blots te detecteren.
-
Immunokleuring
- Verzamel 2 putten van organoïden met behulp van 250 μL ijskoude celherstel oplossing in een buis van 15 mL. Inbroed gedurende ten minste 30 minuten op ijs om de extracellulaire matrix gel op te lossen (dit zal de achtergrond van vlekken verminderen). Wassen met ijskoude PBS.
- Bevestig de organoïden met 500 μL van 4% paraformaldegyde (PFA) gedurende 1 uur bij 4 °C. Wassen met ijskoude PBS. Ga naar de volledige organoïde immunofluorescentie of naar paraffine insluiten volgens de gepubliceerde protocollen12.
Opmerking: gebruik een plastic Pasteur-pipet om de organoïden af te handelen. Dit voorkomt verstoring van de structuur.
4. effect van Extrinsieke factor (Dexamethason als voorbeeld) op organoïde rijpingsproces
- Voeg op dag één van de cultuur 0,01 M dexamethason toe aan de organoïden. Inincuberen van de organoïden met dexamethason gedurende de hele maand van de cultuur door het toevoegen van nieuwe dexamethason elke keer medium wordt gewijzigd.
- Genexpressie analyse
- Isoleer RNA zoals hierboven beschreven. Synthetiseren, op hetzelfde moment, cDNA van alle monsters te vergelijken (behandeld en onbehandeld). Ga verder met de gewenste qRTPCR-methode.
- Gebruik GeNorm om het twee meest stabiele referentie-gen te identificeren telkens wanneer een nieuwe behandeling wordt toegepast op de foetale organoïden. Gebruik het geometrische gemiddelde van de twee gekozen referentie genen voor berekeningen van de relatieve expressie.
Opmerking: suggesties voor referentie genen om te testen op foetale organoïden van muizen: Cyclohiline, Gapdh, βactin, 36b4, HPRT, Rpl4, Rpl32, Ppib en tbp. - Om te onderzoeken hoe een bepaalde extrinsieke factor de postnatale muis foetale rijping beïnvloedt, moeten alle volgende genen worden geëvalueerd.
- Controleer of foetale markers lactase (LCT), argininosuccinaat synthase 1 (Ass1), B lymfocyten-geïnduceerde rijping proteïne 1 (Blimp-1) en neonatale FC receptor (fcrn) in expressie tijdens de eerste twee weken van de cultuur en zijn afwezig voor de resterende cultuur tijd (figuur 4c). Analyseer of dit patroon wordt gewijzigd.
- Controleer of volwassen markers sucrase-isomaltase (SIS), arginase 2 (Arg2), trehalase (treh) en lysozym (lyz) toenemen in expressie na twee weken van cultuur (figuur 4D). Analyseer of dit patroon wordt gewijzigd door de externe factor.
Opmerking: Dexamethason is een externe factor die de rijping van de foetale organoïden kan versnellen en kan worden gebruikt als een positieve controle in alle experimenten die gericht zijn op het testen van andere extrinsieke factoren.
- Enzymactiviteit analyse
- Isoleer eiwitten zoals hierboven beschreven. Detecteer intestinale disaccharidases activiteit volgens de protocollen die zijn gepubliceerd door Dahlqvist en Messer13,14.
- Bereid 0,625 M maleïnezuur-buffer pH 6,0 (bewaren gedurende 3 maanden bij 4 °C). Bereid met deze buffer 0,05 M lactose (Voeg p-hydroxymercuribenzoaat natrium toe als stabilisator om lysosomale p-galactosidase-activiteit te remmen); 0,05 M maltose; 0,05 m sucrose en 0,05 M trehalose.
Let op: al deze oplossingen kunnen 5 dagen worden bewaard bij 4 °C. Blijf op ijs tijdens het bereiden van assay. - Bereid de testnormen voor door verdunning van 5,56 M glucoseoplossing met ultrapuur water om oplossingen te verkrijgen met de volgende concentraties: 0,125 M; 0,1 M; 0,075 M; 0,05 m en 0,025 M.
Opmerking: oplossing stabiel gedurende ten minste 3 maanden bij 4 °C. - Inincuberen in een 96-put plaat voor 60 min bij 37 °C:
-30 μL organoïd lysaat met 30μL lactose
-30 μL organoïd lysaat met 30μL sucrose
-30 μL van tien keer verdund organïd lysaat met 30 μL maltose
-30 μL van vijf maal verdund organïd lysaat met een trehalase van 30 μL
-30 μL onverdund organoïde lysaat met 30 μL maleïnezuur, als monster achtergrond
-30 μL van elke glucose standaard
-30 μL ultrapuur water, als blanco
-30 μL positieve controle (verdunning optimaliseren; gelyseerd foetale intestinale weefsel kan worden gebruikt als controle voor lactase activiteit terwijl gelyseerd volwassen intestinale weefsel kan worden gebruikt als controle voor sucrase, Maltase en trehalase)
Opmerking: verdunning van de monsters moet worden gemaakt met cellysisbuffer. Houd de monsters en de plaat op het ijs tijdens het bereiden van de test. - Om de hoeveelheid glucose te bepalen die wordt geproduceerd door de enzymen die aanwezig zijn in het organoïde lysaat na incubatie met hun respectieve substraten, Voeg snel 200 μL PGO-Color oplossing toe en meet de extinctie bij 450 nm elke 5 min gedurende 30 min bij 37 °C.
Opmerking: Maak de PGO-Color-oplossing fris. Gebruik 10 e/mL glucose-oxidase, 2 U/mL peroxidase en 7,88 mmol/L o-dianisidine in 0,5 mol/L tris-HCl buffer bij pH 7,0. De oplossing moet op kamertemperatuur zijn wanneer deze aan de plaat wordt toegevoegd. - Bereken de activiteit volgens de glucose norm en corrigeer voor de totale hoeveelheid eiwit (bepaald door bicinchoninic acid assay (BCA)). Enzymactiviteit moet worden uitgedrukt als μM glucose/μg eiwit · min-1 (Figuur 5b).
Opmerking: het meten van arginase activiteit met behulp van een commercieel beschikbare arginase activiteit assay kit.
Representative Results
Langdurige kweek van foetale intestinale epitheelcellen
Het protocol voor de overgang van suckling-to-spening in vitro is afhankelijk van de juiste behandeling van foetale organoïden tijdens langdurige kweek. Proximale en distale darm geïsoleerd van E18-E20 muis foetussen worden gescheiden zoals weergegeven in (Figuur 1). Na isolatie worden epitheelcellen in extracellulaire matrix gel koepels (Figuur 2). Het duurt meestal vier passages en ongeveer 28-30 dagen van de cultuur voor foetale organoïden te rijpen naar de volwassen staat. Gedurende deze tijd kunnen cellen in verschillende stadia van rijping worden verzameld (Figuur 3).
Representatieve downstreamanalyse van de overgang van speen-naar-spening in vitro
Om te bevestigen dat geïsoleerde foetale organoïden duidelijk proximale of distale zijn, vergelijk het uitdrukkings niveau van proximale markers een gesneden domein familie lid 2 (Onecut2) en Gata binding proteïne 4 (Gata4) en distale markers vetzuur bindende proteïne 6 (Fabp6) en Guanylate cyclase Activator 2a (Guca2a) tussen zowel proximale als distale organoïde culturen (Figuur 4A, B). De overgang van speen-naar-spening in vitro kan worden bewaakt door twee sets van genen: foetaal (figuur 4c) en volwassen markers (figuur 4D). Foetale markers moeten geleidelijk afnemen in de loop van de cultuur, terwijl de uitdrukking van volwassen markers geleidelijk moet toenemen (Figuur 4C, D).
Met behulp van Extrinsieke factor als een modifier van zuigen-te spening overgang in vitro
In dit protocol werd dexamethason een synthetische Glucocorticoïde gebruikt als een voorbeeld van Extrinsieke factor die in vitro de overgang van de speen-naar-spening kan wijzigen. Representatieve gegevens in Figuur 5 suggereren dat de effecten van extrinsieke factoren het beste kunnen worden bepaald door meerdere testen, omdat ze niet noodzakelijkerwijs genomisch zouden moeten zijn. In het geval van sucrase-isomaltase worden bijvoorbeeld zowel RNA als eiwit expressie geïnduceerd met dexamethason (figuur 5a), terwijl de trehalase uitdrukking alleen op eiwit niveau wordt gewijzigd. (Figuur 5b).
Figuur 1: isolatie van muis foetale dunne darm. A) foto van ontleed en uitgerekt foetaal darmvlies, inclusief maag, proximale en distale dunne darm, aanhangsel en Colon. Zwarte lijn geeft aan waar de darm moet worden gesneden om de proximale en de distale dunne darm verdelen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve microscopische beelden van proximale en distale foetale organoïde cultuur op dag 3, dag 17 en dag 28 van cultuur. Alle beelden werden verkregen op dag 3 na passage en tonen de afname van het aantal sferioïden overuren. Schaalbalk: 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Film 1: representatieve video met foetale organoïde cultuur dynamiek, van dag 4 tot 6 van de cultuur. Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Figuur 3: schematische weergave van organoïde verzameling voor analyse van de rijping van de darmen na verloop van tijd. Proximale en distale foetale organoïde culturen moeten gedurende één maand worden gekweekt en elke week worden doorgeprikt. Monsters voor rijping analyse moeten worden verzameld 3 dagen na isolatie en elke 3 dagen na elke passage. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve qRTPCRs van gut maturatie markers in proximale en distale foetale organoïden. A) proximale markers Onecut2 en Gata4 worden voornamelijk uitgedrukt in de proximale organoïde cultuur, terwijl (B) distale markers Fabp6 en Guca2a meestal worden uitgedrukt in de distale organoïde cultuur. C) foetale markers LCT, Ass1, Blimp-1 en Fcrn dalen en (D) volwassen markers SIS, Arg2, treh en lyz stijgen in de tijd in zowel proximale als distale organoïde culturen. Foutbalken staan voor SEM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: uitwendige factor dexamethason kan de rijping van foetale organoïden moduleren. A) genexpressie van foetale marker Blimp-1 wordt verlaagd op dag 12 van de cultuur in behandelde organoïden in dexamethason vergeleken met de controle organoïden, terwijl zowel de genexpressie (B) als de enzymactiviteit (C) van volwassen marker sucrase-Isomaltase (SIS) wordt verhoogd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Dit protocol beschrijft het kweken van late foetale intestinale organoïden gedurende langere tijd om de overgang van suckling-to-spening in vitro na te bootsen. Het rijpingsproces is gelijk aan het tempo in vivo en wordt na een maand in cultuur voltooid. De downstreamanalyse van deze cultuur met behulp van kwantitatieve RNA-en eiwit technieken is gedetailleerd.
In dit protocol worden primaire intestinale cellen van E18-E20-muis embryo's gebruikt. De ontwikkelingsfase van primaire muis cellen die worden gebruikt om organoïden voor dit protocol te genereren, is bijzonder belangrijk. Het gebruik van een eerdere ontwikkelingsfase zal resulteren in het genereren van intestinale spheroïden die hun specifieke foetale genexpressie gedurende een langere periode behouden met een beperkte overgang naar volwassen organoïden15,16. Alleen laat-foetale fase sspheroïden zijn geschikt voor doorreis naar volwassen organoïden in vitro10. Om te maximaliseren van het venster van de kans met betrekking tot de impact van extrinsieke factoren op de rijping van de darmen, darmen van late foetale fase worden aanbevolen en niet darmen van geboren pups die zijn blootgesteld aan microben en moedermelk. Er wordt gemeld dat bepaalde bacteriële metabolieten en melkcomponenten kunnen fungeren als modifiers van het rijpingsproces17.
Om voldoende cellen te verkrijgen om de cultuur gedurende één maand te behouden om de hele rijping vanaf de geboorte tot de volwassenheid te bestuderen, moet bij het verzamelen van de monsters voor downstreamanalyses, darmen uit 6-8 embryo's worden gebruikt als uitgangsmateriaal. Het verdient de voorkeur om embryo's uit dezelfde ontwikkelingsfase te gebruiken voor het genereren van de cultuur. We raden niet aan verschillende nesten te bundelen omdat kleine verschillen in ontwikkelingsfase de uitdrukking van de rijpings genen kunnen beïnvloeden.
Het protocol beschreven hier accounts voor organoïde generatie uit de proximale en distale dunne darm om ontwikkelings kenmerken van verschillende segmenten van de darm te behouden. Als alternatief kan de hele darm worden gebruikt om de algehele rijping te onderzoeken met betrekking tot de toename/afname-uitdrukking van de specifieke markers. In het laatste geval kunnen er minder embryo's worden gebruikt om darmcellen te isoleren voor de start cultuur.
Dit protocol is ontwikkeld met driedimensionale organoïde culturen. Omdat organoïden een dynamische groei van de cultuur ondergaan, is het belangrijk om monsters te verzamelen voor stroomafwaartse analyses op hetzelfde tijdstip na het doorvoeren. In dit protocol hebben we dag 3 geselecteerd na passage, omdat het de middellange tijd tussen twee splitsingen weergeeft, waarbij organoïden robuuste knoppen bevatten en weinig tot geen celdood. Een alternatief tijdpunt na het doorvoeren kan worden gebruikt, maar het moet consistent zijn tijdens het hele experiment. We raden het kweken van organoïden niet langer dan 7 dagen na een passage aan, omdat de toename van de sterfte cellen in het organoïde lumen de resultaten kan beïnvloeden.
In onze experimenten, we hebben gebruikt Dexamethason als een voorbeeld van een extrinsieke factor die wordt getoond en best bestudeerd in de literatuur te versnellen van de intestinale rijping in vivo9,18. Dexamethason oefent zijn effecten uit via zowel genomische als niet-genomische routes. Op het niveau van de genomische regulering kan bijvoorbeeld een vroegrijpe verhoging van SIS mRNA-niveaus worden waargenomen. Op een niet-genomisch niveau observeren we veranderingen in de activiteit van spijsverteringsenzymen zoals trehalase. Beide zijn in overeenstemming met beschreven specifieke aspecten van dexamethason op sucrase genactivering en niet-genomisch activerende effect op de grens enzymen van de intestinale borstel die in vivo19zijn waargenomen. Het feit dat extrinsieke factoren, zoals synthetische glucocorticoïden, bepaalde aspecten van de overgang van speen-naar-spening in de organoïde-cultuur kunnen moduleren, vergelijkbaar met die beschreven in vivo, stelt de foetale intestinale organoïden van de muis verder in als een model voor het onderzoek van verschillende soorten modulatoren van de darm rijping.
Hoewel de morfologische rijping van humaan intestinale epitheel wordt voltooid in utero bij zwangerschaps fase van 22 weken, de intestinale barrièrefunctie rijpt tot de kindertijd in een nauwe relatie met het type van voeding, ontwikkeling van microbiota en immuunrespons. Vanwege de beperkte beschikbaarheid van menselijke weefsels in deze ontwikkelingsstadia ligt de translationele waarde van in vitro Murine model in de mogelijkheid van hoge doorvoer schermen van factoren die de intestinale rijping kunnen moduleren, een proces dat wordt bewaard tussen speen zoogdieren.
Belangrijk is dat met betrekking tot de dierlijke ethiek in het onderzoek, dit model kan bijdragen aan de verfijning van dierproeven, omdat het geen interventies die worden uitgevoerd op dieren omvat. Het aantal dieren kan verder worden verminderd door onderzoek vragen te herontwerpen naar één of twee tijdpunten van cultuur, waardoor het testen van meerdere componenten binnen één cultuur mogelijk wordt.
Disclosures
="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.
-->Auteurs verklaren niets te onthullen.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
| BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
| Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
| Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
| EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
| Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
| Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
| Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
| Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
| Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
| Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
| Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
| Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
| Millipore water | N.A. | ||
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
| n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Noggin-conditioned media | Homemade | ||
| o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
| PBS | Homemade | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
| PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
| p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
| Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
| Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Henning, S. J. Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism. American Journal of Physiology. 241 (3), 199-214 (1981).
- Krasinski, S. D., et al. Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats. American Journal of Physiology. 267 (4), 584-594 (1994).
- Hurwitz, R., Kretchmer, N. Development of arginine-synthesizing enzymes in mouse intestine. American Journal of Physiology. 251 (1), 103-110 (1986).
- Rath, T., et al. The immunologic functions of the neonatal Fc receptor for IgG. Journal of Clinical Immunology. 33, Suppl 1 9-17 (2013).
- Martin, M. G., Wu, S. V., Walsh, J. H. Ontogenetic development and distribution of antibody transport and Fc receptor mRNA expression in rat intestine. Digestive Diseases and Sciences. 42 (5), 1062-1069 (1997).
- Bry, L., et al. Paneth cell differentiation in the developing intestine of normal and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10335-10339 (1994).
- Muncan, V., et al. Blimp1 regulates the transition of neonatal to adult intestinal epithelium. Nauret Communications. 2, 452 (2011).
- Beaulieu, J. F., Calvert, R. Influences of dexamethasone on the maturation of fetal mouse intestinal mucosa in organ culture. Comparative Biochemistry and Physiology A Comparative Physiology. 82 (1), 91-95 (1985).
- Nanthakumar, N. N., Henning, S. J. Ontogeny of sucrase-isomaltase gene expression in rat intestine: responsiveness to glucocorticoids. American Journal of Physiology. 264 (2), 306-311 (1993).
- Navis, M., et al. Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning. EMBO Reports. 20 (2), (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
- Dahlqvist, A.
- Messer, M., Dahlqvist, A. A one-step ultramicro method for the assay of intestinal disaccharidases. Anal Biochemistry. 14 (3), 376-392 (1966).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium. Cell Reports. 5 (2), 421-432 (2013).
- Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 296-301 (2017).
- Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J.
- Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture. Developmental Biology. 74 (1), 9-21 (1980).
