Uma lesão de balão segmental controlada por pressão da artéria de rato com aplicação terapêutica periadventicional

A doença cardiovascular (DCV) continua sendo a principal causa de morte em todo o mundo¹. A aterosclerose é a causa básica da maior morbidade e mortalidade relacionadas à DCV. Aterosclerose é o acúmulo de placa dentro das artérias que resulta em um lúmen estreito, dificultando a perfusão sanguínea adequada aos órgãos e tecidos distais². As intervenções clínicas para o tratamento da aterosclerose grave incluem angioplastia de balão com ou sem colocação de stent. Esta intervenção envolve o avanço de um cateter de balão para o local da placa, e a inflação do balão para comprimir a placa até a parede arterial, ampliando a área luminal. Este procedimento danifica a artéria, no entanto, iniciando a resposta da lesão arterial³. A ativação prolongada desta resposta à lesão leva à restenose arterial, ou re-estreitamento, secundária à hiperplasia neointimal e à remodelação do vaso. Durante a angioplastia, a camada intimal é desnudada de células endoteliais que levam ao recrutamento imediato de plaquetas e inflamação local. A sinalização local induz alterações fenotípicas nas células musculares lisas vasculares (VSMC) e nos fibroblastos adventitas. Isso leva à migração e proliferação de VSMC e fibroblastos para dentro do lúmen, levando à hiperplasia neointimal^4,5. As células progenitoras circulantes e as células imunes também contribuem para o volume global de restenose⁶. Quando aplicável, os stents que eluem drogas (DES) são o padrão atual para inibir a restenose⁷. O DES inibe a re-endotelialização arterial, no entanto, criando assim um ambiente pró-trombótico que pode resultar em trombose tardia do stent⁸. Portanto, os modelos animais são fundamentais tanto para a compreensão da fisiopatologia da restenose, quanto para o desenvolvimento de melhores estratégias terapêuticas para prolongar a eficácia dos procedimentos de revascularização.

Vários modelos animais grandes e pequenos⁹ são utilizados para estudar essa patologia. Estes incluem lesão de balão^3,10 ou lesão de fio¹¹ do lado luminal de uma artéria, bem como ligadura parcial¹² ou colocação de manguito¹³ ao redor da artéria. A lesão do balão e do arame desnude a camada endotelial da artéria, imitando o que ocorre clinicamente após a angioplastia. Em particular, os modelos de lesão de balão utilizam ferramentas semelhantes às do cenário clínico (ou seja, cateter de balão). A lesão do balão é melhor realizada em modelos de ratos, uma vez que as artérias de rato são um tamanho apropriado para cateteres de balão comercialmente disponíveis. Aqui descrevemos uma lesão arterial segmental controlada por pressão, uma versão bem estabelecida e modificada da lesão do balão da artéria carótida do rato. Esta abordagem controlada por pressão imita de perto o procedimento de angioplastia clínica, e permite a formação de hiperplasia neointimal reprodutível duas semanas após a lesão^14,15. Além disso, esta lesão arterial controlada por pressão resulta em restauração completa da camada endotelial por 2 semanas após a cirurgia¹⁶. Isso contrasta diretamente com o modelo original de lesão do balão, descrito por Clowes, onde a camada endotelial nunca retorna à cobertura completa³.

Após a cirurgia, a terapêutica pode ser aplicada ou direcionada para a artéria ferida através de várias abordagens. O método descrito aqui usa a aplicação periadventitial de uma pequena molécula embutida em uma solução de gel plurônico. Especificamente, aplicamos uma solução de aldeído cinnâmico de 100 μM em gel plurônico-F127 na artéria imediatamente após lesão para inibir a formação de hiperplasia neointimal¹⁵. Pluronic-F127 é um gel termo-reversível não tóxico capaz de entregar drogas localmente de forma controlada¹⁷. Enquanto isso, a lesão arterial é local, portanto a administração local permite testar um princípio ativo, minimizando os efeitos fora do alvo. No entanto, a entrega efetiva de um uso terapêutico deste método dependerá da química da pequena molécula ou do uso biológico.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.

1. Procedimentos pré-operatórios

1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Se realizar múltiplas cirurgias no mesmo dia, esterilize os instrumentos entre as cirurgias utilizando um esterilizador de contas secas.
2. Prepare o terapêutico em 25% de gel plurônico-127 (diluído em água destilada estéril).
3. Configure um cateter de balão Fogarty 2F no insuflê e coloque a extremidade do balão do cateter em uma seringa de 1 mL cheia de solução salina.
4. Induzir anestesia colocando o rato em uma câmara com 5% de isoflurano.
   1. Retire o rato da câmara e grave o peso do rato. Use cortadores de cabelo para raspar peles na região do pescoço ventral.
   2. Coloque o rato de volta na câmara com 5% de isoflurano para garantir a indução da anestesia.
5. Coloque o supino do rato em uma plataforma cirúrgica, inserindo a face no cone do nariz para que a face do rato esteja em direção ao cirurgião.
   1. Reduza a anestesia inalatória para 1,5% de isoflurane. Verifique a profundidade da anestesia por um reflexo de dedo do pé nos quatro pés.
   2. Fita as quatro pernas até a plataforma cirúrgica.
6. Ligue a lâmpada de calor.
7. Injete atropina (0,01 mg/kg) subcutânea para reduzir as secreções das vias aéreas.
8. Injete Carprofen (5 mg/kg) subcutânea para o tratamento da dor profilática. Se os anti-inflamatórios não forem aceitáveis para o experimento, consulte as etapas 3.2.2 e 3.2.3.
9. Aplique pomada lubrificante nos olhos em ambos os olhos usando um cotonete estéril para evitar que as córneas sequem durante a cirurgia.
10. Cotonete o pescoço três vezes em um movimento circular alternando entre 70% de álcool etílico seguido por Betadine do centro da região raspada para fora para esterilizar o local de incisão.
11. Infiltrar-se na linha de incisão s.c. com 0,25% bupivacaína.
12. Coloque luvas cirúrgicas estéreis antes de manusear instrumentos cirúrgicos estéreis e suprimentos.
13. Coloque todos os instrumentos cirúrgicos autoclavados em uma folha cirúrgica estéril.
14. Corte três fios independentes de 1 polegada de sutura estéril 7-0 Prolene.
15. Coloque cotonetes e gaze na folha cirúrgica.
16. Drape o rato com uma folha cirúrgica estéril que só expõe a região do pescoço esterilizada.
17. Corte uma abertura pequena adicional na folha que exponha parte do cone do nariz. Este será o local para gravar o cateter de balão durante a lesão.

2. Procedimentos operacionais

1. Durante todo o procedimento cirúrgico, avalie a profundidade da anestesia monitorando a taxa respiratória (a taxa deve ser consistente e considerada normal) bem como por beliscar o dedo do pé a cada 15 minutos. Se a taxa respiratória aumentar ou houver uma resposta ao aperto do dedo do pé, então pausa a manipulação cirúrgica e aumente o isoflurane até 2,5%.
2. Expor a artéria carótida comum (CCA).
   1. Faça uma incisão superficial, reta e longitudinal entre os ossos da mandíbula do rato. A incisão terá aproximadamente 1,5-2 cm de comprimento.
   2. Faça uma incisão através do tecido conjuntivo sob a pele até que a camada muscular seja exposta. Deslocar as glândulas salivares sob a pele para acessar o tecido muscular.
   3. Separe sem rodeios o tecido conjuntivo do músculo inserindo uma tesoura fechada entre a camada muscular e o tecido conjuntivo e abrindo suavemente a tesoura enquanto puxa a pele para cima.
3. Disseque os dois músculos visíveis (estehisidóide e esternostoide) longitudinalmente ao longo do lado esquerdo da traqueia até que um terceiro músculo (omohyide) que corre perpendicular aos dois músculos superficiais seja observado.
4. Use fórceps para criar uma janela que separe este músculo perpendicular (omohyide) do músculo longitudinal (estehiidaide) correndo sobre a traqueia. Realize suavemente esta separação para evitar traumas contundentes na traqueia.
5. Atinja fórceps sob o músculo perpendicular e corte para separar os dois músculos longitudinais e expor a CCA.
6. Disseca a CCA.
   1. Disseque a CCA perto da bifurcação até que a artéria carótida interna (ICA) e a artéria carótida externa (ECA) sejam expostas.
   2. Dissecar a artéria tireoide superior (STA), que se ramifica do TCE.
   3. Utilizando as suturas prolene pré-cortadas, ligar o STA e o ECA perto de sua respectiva bifurcação. Deixe a maior parte da sutura para um lado do nó e pegue cada sutura com um hemosta curvo.
   4. Finalize a dissecação ao redor do ICA, alcance fórceps por baixo e ao redor do ICA, e use um grampo vascular não esmagador para obter controle distal. Aperte a artéria occipital junto com o ICA.
   5. Dissecar o CCA proximal à bifurcação, garantindo separar o nervo vago da CCA.
   6. Alcance fórceps por baixo e ao redor da CCA e use um grampo vascular não esmagante para obter controle proximal. Coloque o grampo de pelo menos 5 mm da bifurcação.
7. Faça lesão no balão.
   1. Manobrar os hemostatos curvos que seguram cada ramo da artéria ligada para expor a bifurcação entre o TCE e o ramo superior.
   2. Dissecar suavemente o tecido na bifurcação e, em seguida, fazer uma incisão de arteriotomia entre o ECA e o ramo superior usando tesouras de microdisseção.
   3. Use um cotonete para empurrar todo o sangue para fora da CCA e limpar o local da arteriotomia.
   4. Insira o cateter de balão não inflado através da arteriotomia e avance para dentro da CCA até que a extremidade proximal do balão passe da bifurcação.
   5. Cateter de fita no cone do nariz para que o balão não saia da artéria durante a inflação.
   6. Infle lentamente o balão a 5 atmosferas de pressão e deixe na CCA por 5 minutos para induzir lesões arteriais. Certifique-se de que a pressão permaneça constante durante todo o 5 min.
   7. Depois de 5 min, esvazie o balão e retire suavemente da CCA através da arteriotomia.
   8. Lave a CCA apertando suavemente o grampo na CCA. Não remova o grampo.
   9. Ligate o ECA proximal à arteriotomia e, em seguida, remova os grampos da CCA e ica para restaurar o fluxo sanguíneo através da CCA para o ICA. Certifique-se de que não há sangramento visível ao redor da arteriotomia e que a CCA está pulsando.
8. Aplique 100 μL de veículo de gel terapêutico ou plurônico sozinho periadventitamente ao longo da CCA ferida. Faça isso aplicando 50 μL no lado esquerdo da CCA e, em seguida, 50 μL no lado direito da CCA para garantir o revestimento uniforme da artéria ferida.
9. Feche o local da ferida.
   1. Corte suturas prolene em excesso.
   2. Feche a ferida usando camadas vicríl interrompidas 4-0 ou 6-0 ao longo do tecido conjuntivo.
   3. Finalize o fechamento da ferida usando sutura de nylon 4-0 ao longo da pele.

3. Procedimentos pós-operatórios

1. Coloque o rato sozinho em uma gaiola limpa com metade da gaiola sob uma lâmpada de aquecimento e monitore até que o rato recupere a consciência suficiente para manter a recumbência severa. Mantenha o rato em uma gaiola separada até que o animal esteja totalmente alerta e móvel antes de ser transferido de volta para sua gaiola original.
2. Monitore o rato diariamente pelos próximos três dias e depois três vezes por semana até a eutanásia. Eutanize usando overdose de isoflurane seguido de toracotomia bilateral como descrito abaixo.
   1. Utilize o Centro Nacional de Requinte e Redução de Animais em Pesquisa (NC3Rs) para identificar os níveis de dor pós-operatório. Se algum animal parece estar sentindo dor ou desenvolvendo qualquer compromisso neurológico, sacrifique imediatamente.
   2. Para animais que não recebem carprofeno, administre acetaminofeno 6 mg/mL em sua água potável 24h antes da cirurgia através de 48h após a cirurgia. O acetaminofeno fornece analgesia com efeitos anti-inflamatórios mínimos.
   3. Alternativamente, outras estratégias de analgesia com efeitos anti-inflamatórios mínimos podem ser utilizadas, como buprenorfina ou liberação estendida de buprenorfina. Consulte a equipe veterinária de sua instituição.

4. Colheita e imagem de tecido

1. Duas semanas após a cirurgia, eutanize o rato por overdose de anestesia (5% isoflurane). Alternativamente, os ratos eutanizam em um momento anterior para analisar os vários aspectos da resposta à lesão arterial.
   1. Uma vez que a respiração pára, faça a toracotomia bilateral como um método secundário de eutanásia.
2. Faça uma incisão lateral através do abdômen, e depois corte para cima, através do diafragma e costelas, expondo a cavidade torácica.
3. Peruuse e conserte as artérias.
   1. Insira uma cânula de 18 G presa a um sistema de fixação gravitacional de perfusão através do ventrículo esquerdo. Mantenha pressão equivalente entre ratos marcando a altura do sistema de perfusão em relação à bancada (elevação de 120 cm, equivalente a 91 ± 3 mmHg).
   2. Aperte a cânula junto com o ventrículo usando um hemostato curvo.
   3. Faça um corte no átrio direito, abrindo o circuito vascular, e comece a perfusão com PBS seguido de 2-4% de paraformaldeído (cerca de 250 mL cada).
   4. Prepare paraformaldeído diluído na PBS no dia do sacrifício, ou no máximo na noite anterior ao sacrifício. Se se preparar no dia do sacrifício, certifique-se de que o paraformaldeído esfriou à temperatura ambiente antes de iniciar a perfusão. Armazenar paraformaldeído a 4 °C.
4. Após a fixação, extraia as artérias carótidas esquerda e direita e armazene a 4 °C por 2h em 2-4% de paraformaldeído.
5. Transfira as artérias para 30% de sacarose e armazene durante a noite a 4 °C.
6. Após 16-24 h, incorpore as artérias no composto de temperatura de corte ideal (OCT) e congele os blocos de artérias embutidas por OCT.
   1. Condicionam artérias em OUTUBRO à temperatura ambiente por 10 minutos. Coloque a artéria paralela ao plano da criomolda cheia de OCT, marcando o lado da criomold para a qual a bifurcação arterial está voltada. Congelamento de snap em nitrogênio líquido.
   2. Armazene blocos congelados a longo prazo a -80 °C.
7. Seção blocos congelados usando um criostat.
   1. Colete seis seções transversais arterials de 5 μm de espessura por slide, com slide 1 começando na bifurcação.
   2. Seção blocos congelados até que a hiperplasia não seja mais visível (cerca de 100 slides).
8. Hematoxylin & eosin (H&E) slides de manchas¹⁸
   1. Encontre a área do ferimento manchando um em cada dez slides ao longo de toda a artéria a partir da bifurcação (por exemplo, slides 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100).
   2. Manchas adicionais desliza ao redor do local da lesão para encontrar o slide com oclusão de pico (por exemplo, slides 20, 30 e 40 tinham hiperplasia visível, assim manchas desliza 15, 25, 35 e 45).
   3. Manche e quantifique o slide com oclusão máxima e deslizamentos equidistantes antes e depois do deslizamento de oclusão de pico (por exemplo, oclusão máxima encontrada no slide 35, depois manche e quantifique slides 25, 45, etc.) para um total de 3-10 slides por rato.
9. Para imagens de microscopia de fluorescência de folha de luz, armazene as artérias durante a noite a 4 °C após a fixação na etapa 4.4.
   1. Artéria da sonda com diluição de 1:500 de anticorpo primário anti-CD31 de coelho em diluente (pH 7.4) por 3 dias. Em seguida, a artéria de contra-mancha com diluição de 1:500 do anticorpo secundário Alexa Fluor 647 por 2 dias¹⁹.
   2. Limpe a artéria usando iDISCO+²⁰.
   3. Imagem da artéria usando um microscópio de fluorescência de folha de luz²¹. Renderizar imagens usando software (por exemplo, Imaris)¹⁹.
10. Quantifique a hiperplasia neointimal. Realize a quantificação de forma cega, se possível.
    1. Use o software ImageJ para traçar o perímetro da lâmina elástica intima, interna elástica (IEL) e lamina elástica externa (EEL) de uma artéria em cada um dos 3-10 slides determinados acima (passo 4.8.3).
    2. Quantifique a área de cada região traçada em ImageJ e exporte esses valores. O traço intima produz a área de lúmen, o traço IEL produz a área IEL, e o traço EEL produz a área da ENGUIA.
    3. Média dos valores obtidos dos slides 3-10 para obter a lesão média (% de oclusão, proporção intima:media (I:M), hiperplasia neointimal) por artéria carótida de rato.
       Hiperplasia Neointimal = Área IEL - Área de Lumen
       
       

A Figura 1 mostra todos os materiais e ferramentas cirúrgicas utilizados para a realização desta cirurgia. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de seções transversais arterials feridas de duas semanas permite uma visualização clara da hiperplasia neointimal. A Figura 2 mostra imagens representativas de seções arterials manchadas de H&E de uma artéria saudável, ferida e tratada. A Figura 2 também descreve como quantificar o nível de hiperplasia neointimal em uma artéria ferida usando imagej, um software de processamento de imagem amplamente utilizado. Utilizando essa abordagem, o perímetro da neointima, bem como a lâmina elástica interna e externa são traçados para quantificar as respectivas áreas. O método de lesão segmentar controlado por pressão que descrevemos resulta em uma proporção intima para a mídia de 0,80 com um desvio padrão de 0,29 (2 cirurgiões diferentes e n=11 ratos). O tratamento com aplicação periadventicial de CA em Pluronic resulta em uma inibição da hiperplasia neointimal, como já mostramos antes (redução de 61% na oclusão percentual)15.

A Figura 3 fornece uma ilustração para a criação de uma arteriotomia ideal na bifurcação do ECA e sta. Por fim, a Figura 4 mostra como a microscopia de fluorescência da folha de luz pode ser usada para visualizar toda a região da lesão ao longo do comprimento da artéria. A coloração CD31 para visualizar as células endoteliais que revestem a camada intimal pode ser realizada em artérias fixas. As artérias podem então ser incorporadas em 1% de agarose e limpas usando o método iDISCO+ para homogeneizar o índice de refração da amostra20. Em seguida, as artérias podem ser imagens em um microscópio de fluorescência de folha de luz e as imagens podem ser renderizadas usando software para quantificar a razão I:M. Usando essa abordagem, obtivemos uma razão de I:M de 0,86, que está de acordo com os resultados de H&E.

Mesa 1. Número comumente utilizado de seções transversais arterials para análise de hiperplasia.

Figura 1. Instrumentos cirúrgicos e ferramentas. Na ordem do sentido horário começando no canto superior esquerdo da imagem: (A) Cotonetes de algodão; (B) Solução betadina; (C) Gaze; (D) Solução de álcool etílico de 70%; (E) seringas de 1cc com agulha; (F) Atropina; (G) Retratores; clipes de papel dobrados usados aqui; Rimadyl; (I) Grampo de micro-serrefina aplicando fórceps; (J) Suporte de agulha; (K) 4-0 sutura de nylon; (L) 4-0 sutura vicríl; (M) Cortinas estéreis; (N) Tesoura mayo; (O) Fórceps padrão; (P) Fórceps curvados finos; (Q) Tesoura de microdisseção; (R) Grampos de micro serrefina; (S) Tesoura fina; (T) T-pinos; (U) Hemostats curvos; (V) Três suturas de prolene 7-0 cortadas para aproximadamente 1 polegada; (W) 100 μL de 25% de gel plurônico-127; (X) Pomada ocular lubrificante; (Y) 2 Cateter francês de embolectomia de balão em solução salina estéril; Insufflator. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Hematoxylin & Eosin (H&E) coloração e análise de seções transversais da artéria carótida de rato. (A) Seção transversal da artéria carótida direita saudável e sem ferimentos. IEL = Lamina Elástica Interna, ENGUIA = Lamina Elástica Externa. (B) Seção transversal de duas semanas ferida artéria carótida esquerda tratada com veículo Pluronic-F127. (C) Seção transversal de duas semanas ferida artéria carótida esquerda tratada com aldeído cinnâmico de 100 μM. Barra de escala = 100 μm. (D) Esquema de secção de artérias congeladas para quantificar lesões. O slide 1 começa na bifurcação e seis seções arteriais de 5 μm de largura são tomadas por slide. A secção normalmente continua a deslizar 70, pois a lesão geralmente ocorre antes deste slide. (E) Seção transversal da artéria carótida esquerda ferida tratada com veículo plurônico(B). A linha preta mais interna traça o neointima e delineia a área luminal. A linha amarela média delineia a área da lâmina elástica interna, ou tunica intima. A linha azul exterior delineia a área da lâmina elástica externa, ou tunica adventitia. Barra de escala = 100 μm. (F) Cálculos utilizados para medição percentual de oclusão do vaso e proporção intima:media (I:M) com base nas medições obtidas de (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Criação de arteriotomia. Ilustração dos passos para criar uma arteriotomia adequada, e evitar um trato falso. CCA = Artéria Carótida Comum, ECA = Artéria Carótida Externa, ICA = Artéria Carótida Interna, OA = Artéria Occipital, STA = Artéria Tireoide Superior. Isolar a bifurcação entre os ramos ECA e STA. Disseque essa bifurcação até que a área mude para uma cor mais brilhante, indicando o afinamento da parede arterial e, em seguida, crie uma arteriotomia usando tesouras de microdisseção. Levante a arteriotomia usando fórceps finos para auxiliar na inserção do balão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Microscopia de fluorescência de folha de luz para visualizar lesões arteriais. Seções longitudinais transversais ao longo do comprimento da artéria carótida comum de um rato Sprague Dawley de 14 semanas de idade com uma seção transversal representativa abaixo. As artérias estão manchadas com CD31 e contra-manchadas com AF647. (A) Seções transversais da artéria carótida direita saudável e sem ferimentos. Branco = CD31, Verde = Lamina Elástica, L = Lumen, Barra de Escala = 200-500 μm. (B) Seções transversais da artéria carótida esquerda ferida tratada com veículo Pluronic-F127. Pontas de flecha indicam regiões de hiperplasia neointimal. (C) Proporção intima para mídia (I:M) da artéria carótida não ferida e ferida, com valor exato observado para cada grupo (n=1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não há conflitos de interesse em relação à publicação deste manuscrito.