Controlando as velocidades de fluxo de fluidos ativos 3D baseados em microtúbulos usando temperatura

Summary

O objetivo deste protocolo é usar a temperatura para controlar as velocidades de fluxo de fluidos ativos tridimensionais. A vantagem deste método não só permite regular as velocidades de fluxo in situ, mas também permite o controle dinâmico, como ajustar periodicamente as velocidades de fluxo para cima e para baixo.

Abstract

Apresentamos um método para usar a temperatura para ajustar as velocidades de fluxo de fluidos ativos tridimensionais (3D) orientados por quineinas, à base de microtúbulos. Este método permite ajustar as velocidades in situ sem a necessidade de fabricar novas amostras para atingir diferentes velocidades desejadas. Além disso, este método permite o controle dinâmico da velocidade. Andar de bicicleta a temperatura leva os fluidos a fluir rápido e lento, periodicamente. Essa controlabilidade é baseada na característica de Arrhenius da reação kinesin-microtubule, demonstrando uma faixa de velocidade de fluxo média controlada de 4-8 μm/s. O método apresentado abrirá a porta para o projeto de dispositivos microfluídicos onde as taxas de fluxo no canal são localmente tunable sem a necessidade de uma válvula.

Introduction

A matéria ativa é diferenciada da matéria passiva convencional devido à sua capacidade de converter energia química em trabalho mecânico. Um material que possui tal capacidade pode consistir em entidades vivas ou não vivas, como bactérias, insetos, coloides, grãos e filamentos citoesqueléticos^{1,2,3,4,5,7,8,9,10}. Essas entidades materiais interagem com seus vizinhos. Em maior escala, eles se auto-organizam em vórtices turbulentos (turbulência ativa) ou fluxos materiais^{11,12,13,14,15,16,18,19,20.} Uma compreensão da auto-organização da matéria ativa levou a várias aplicações em ônibus moleculares, dispositivos ópticos e computação paralela^21,22,23. Para trazer aplicativos para o próximo nível requer controle além da auto-organização. Por exemplo, Palacci et al. desenvolveram um coloide hematita encapsulado que se autopropelia apenas quando exposto à luz azul controlada manualmente, o que levou ao surgimento de cristais vivos²⁴. Morin et al. estabeleceram o controle dos coloides quincke rolando usando um campo elétrico externo tunable, resultando em coloidal reunindo-se em uma pista de corrida como canal²⁵. Esses trabalhos anteriores demonstram o papel do controle local nas aplicações e promovem a base de conhecimento da matéria ativa.

Neste artigo, nos concentramos na controlabilidade dos fluidos ativos 3D baseados em quinesina, microtubule (MT). Os fluidos consistem em três componentes principais: MTs, motores moleculares de cinese e depletantes. Os depletantes induzem uma força de esgotamento para agrupar as MTs, que mais tarde são superadas por aglomerados de motores. Estes motores andam ao longo do MTstoward a extremidade mais. Quando um par de MTsis ponte anti-paralelo, os motores correspondentes andar em direções opostas. No entanto, os motores estão ligados em um cluster e são incapazes de se afastar, então eles deslizam cooperativamente pares de MTs (deslizamento de interfilamento, Figura 1A). Estas dinâmicas deslizantes se acumulam, fazendo com que os feixes de MTsto se estendem até atingir seu ponto de instabilidade e quebra (pacotes extensile, Figura 1B)²⁶. Os feixes quebrados são annealed pela força do esgotamento, que estende subseqüentemente outra vez, e a dinâmica repete. Durante o processo de dinâmica de repetição, os movimentos do feixe agitam o líquido próximo, induzindo fluxos que podem ser visualizados pelo doping com traçadores em escala de mícron (Figura 1C). Sanchez et al. e Henkin et al. caracterizaram as velocidades médias dos traçadores, descobrindo que as velocidades eram tunable variando as concentrações de triphosfato de adenosina (ATP), depletantes, clusters motores e MTs^19,27. No entanto, essa tunabilidade existia apenas antes da síntese de fluidos ativos. Após a síntese, a tunability foi perdida, e os líquidos auto-organizados em sua própria maneira. Para controlar a atividade do fluido ativo após a síntese, Ross.et al. relatou um método usando a imersão ativada pela luz das proteínas motoras, permitindo que a atividade fluida fosse ajustada e desligasse usando a luz²⁸. Enquanto o controle de luz é conveniente em termos de ativar localmente os fluidos, o método requer redesenhar as estruturas de proteínas motoras, juntamente com a modificação dos caminhos ópticos em um microscópio. Aqui, fornecemos um método fácil de usar para controlar localmente os fluxos de fluidos sem modificação do microscópio, mantendo a estrutura motora intacta.

Nosso método de ajuste local do fluxo de fluido ativo é baseado na lei Arrhenius porque a reação kinesin-MT tem sido relatado para aumentar com a temperatura^29,30,31,32. Nossos estudos anteriores mostraram que a dependência de temperatura da velocidade média de um fluxo de fluido ativo seguiu a equação de Arrhenius: v = A exp (-E_a/RT), onde A é um fator pré-exponencial, R é a constante de gás, E_a é a energia de ativação, e T é a temperatura do sistema³³. Portanto, a atividade fluida é sensível ao ambiente de temperatura, e a temperatura do sistema precisa ser consistente para estabilizar o desempenho do motor e, consequentemente, a velocidade de fluxo de^fluido34. Neste artigo, demonstramos o uso da dependência de temperatura do motor para ajustar continuamente as velocidades de fluxo de fluidos ativos, ajustando a temperatura do sistema. Também demonstramos a preparação de uma amostra de fluido ativo, seguida pela montagem da amostra em um estágio de microscópio cuja temperatura é controlada através de software de computador. Aumentar a temperatura de 16 °C para 36 °C acelera as velocidades médias de fluxo de 4 para 8 μm/s. Além disso, a tunabilidade é reversível: aumentar e diminuir repetidamente a temperatura acelera sequencialmente e desacelera o fluxo. O método demonstrado é aplicável a uma ampla gama de sistemas onde as principais reações obedecem à lei Arrhenius, como o ensaio de deslizamento mt^29,30,31,32.

Protocol

1. Preparação de MTs

ATENÇÃO: Nesta etapa, purificamos as tubulinas do tecido cerebral bovino. Cérebro bovino pode causar variante doença de Creutzfeldt-Jakob (vCJD)³⁵. Portanto, os resíduos cerebrais e soluções relacionadas, garrafas e dicas de pipetas devem ser coletados em um saco de biolixo e descartados como resíduos bioperigosos de acordo com as regras da instituição.

1. Purify tubulins do cérebro bovino (modificado de Castoldi et al.^36).
   1. Transporte aproximadamente 1,5 kg de cérebros bovinos frescos de um matadouro local para uma sala fria da universidade. Durante o transporte, guarde os cérebros em tampão de fosfato (20 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.2) no gelo.
      NOTA: Para maximizar o rendimento final da tubulina, a quantidade inicial de tubulina funcional no tecido cerebral fresco é fundamental. Cérebros mais frescos contêm tubulina mais funcional. Para obter os cérebros mais frescos do matadouro, recomendamos pedir ao açougueiro para fornecer cérebros das vacas mais recentemente abatidas. Os cérebros não devem ter mais de 3 h quando iniciar o procedimento, porque reduzir o tempo entre abate e início do procedimento produzirá melhores rendimentos.
   2. Homogeneize e esclareça os cérebros.
      1. Limpe o cérebro usando bisturis para cortar os vasos sanguíneos e tecido conjuntivo em pedaços menores e removê-los do cérebro com a mão.
         NOTA: Os cérebros limpos devem ser cor-de-rosa.
      2. Mergulhe o tecido cerebral limpo em 1 L de buffer de despolimerização (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) ácido ethanesulfonic, 1 mM CaCl₂, pH 6.6) por quilograma de cérebro.
      3. Homogeneize os cérebros com um liquidificador de cozinha.
      4. Centrífuga a solução cerebral homogeneizada a 10.000 x g e 4 °C por 150 min.
   3. Polimernize MTs (primeira polimerização).
      1. Coletar e misturar o supernatant com volumes iguais das seguintes soluções em 37 °C: glicerol, tampão de tubos de alta molaridade (HMPB: 1 M PIPES, 10 mM MgCl₂, 20 mM etileno glicol-bis (β-aminoehyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic ácido [EGTA], pH 6.9)
      2. Adicione 1,5 mM ATP e 0,5 mM guanosine triphosfato (GTP) à mistura.
      3. Incubar a mistura a 37 °C por 1 h.
   4. Depolinizam MTs (primeira depolimerização do MT).
      1. Pelota MT por centrífuga em 151.000 x g e 37 °C por 30 min.
      2. Descarte supernatant e resuspende cada pelota de MT em 10 mL de 4 °C DB.
      3. Incubar no gelo por 30 min.
      4. Agitaa a mistura a cada 5 min com uma ponta de pipeta para evitar a sedimentação do MT.
         NOTA: A mistura deve ficar clara em 30 min, indicando a conclusão da depolimerização mt.
   5. Polimernize MTs (segunda polimerização mt).
      1. Esclareça a solução centrífuga a 70.000 x g e 4 °C por 30 min.
      2. Coletar e misturar o supernatant com volumes iguais de 37 °C glicerol e HMPB.
      3. Adicione 1,5 mM ATP e 0,5 mM GTP à mistura.
      4. Incubar a mistura a 37 °C por 30 min.
   6. Repita o passo 1.1.4, substituindo o HMPB pelo buffer de remontagem Brinkley (BRB) 80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl_2,1 mM EGTA, pH 6.8), seguido de esclarecer a mistura desmatada por centrífuga em 79.000 x g e 4 °C por 30 min.
   7. Recolher o supernatant. Medir a absorção de 280 nm com um espectrômetro. Determinar a concentração de tubulina usando a lei Cerveja-Lambert (coeficiente de extinção da tubulina: 1,15 (mg/mL)^-1cm^-1)^37,38.
   8. Guarde a proteína a -80 °C.
2. Reciclar tubulins (modificados de Castoldi et al.^36).
   NOTA: Para aumentar a pureza da tubina, a tubulina purificada é polimerizada e depolimerizada novamente.
   1. Polimerzique os MTs misturando a tubbulina purificada (passo 1.1.7) com 500 μM dithiothreitol (DTT) e 20 μM GTP, seguido por 30 min de incubação a 37 °C.
   2. Pelotas os MTs.
      1. Carga 1 mL de almofada de glicerol (80 tubos mM, 1 mM MgCl_2,1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 6.8) na parte inferior de um tubo de centrífuga.
      2. Coloque as MTs polimerizadas em cima da almofada.
      3. Centrífuga a 172.000 x g por 90 min a 37 °C.
   3. Depolinizam as MTs.
      1. Retire o supernatant e almofada.
      2. Resuspender cada pelota MT em 150 μL de 4 °C MT buffer (M2B: 80 mM PIPES, 2 mM MgCl_2,1 mM EGTA, pH 6.8).
      3. Incubar a mistura no gelo por 30 min.
      4. Agita a mistura com uma ponta de pipeta a cada 5 min. A mistura deve ficar clara.
   4. Esclareça a mistura centrífuga em 172.000 x g e 4 °C por 30 min.
   5. Recolher o supernatant. Medir a concentração de proteínas. Armazenar a -80 °C.
3. Rotular a tubulina com corante fluorescente³⁹.
   1. Polimerizar as MTs. Misture a tubbulina purificada (passo 1.1.7) com 500 μM DTT e 16.7 μM GTP, e incubaa a mistura em 37 °C para 30 min.
   2. Pelotas os MTs.
      1. Coloque 1 mL de 37 °C almofada de alto pH (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl_2,1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 8.6) em um tubo de centrífuga.
      2. Coloque as MTs polimerizadas na almofada.
      3. Centrífuga a 327.000 x g por 50 min a 37 °C.
   3. Etiqueta tubulina.
      1. Resuspender cada pelota MT com 700 μL de 37 °C de rotulagem tampão (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl_2,1 mM EGTA, 40% v/v glicerol, pH 8.6).
      2. Misture a suspensão com um excesso de 10-20 molar de corante fluorescente muito vermelho funcionalizado com um éster succinimidyl.
      3. Incubar a mistura a 37 °C por 30 min no escuro para permitir que as MTs reajam com o éster do corante fluorescente.
      4. Pare a reação de rotulagem saturando o éster do tintura suspenso com 50 mM K-glutamato, incubando por 5 min a 37 °C.
   4. Pelotas os MTs rotulados: Repita a etapa 1.3.2, substituindo a almofada de alto pH por almofada de baixo pH (80 tubos mM, 2 mM MgCl_2,1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 6.8).
   5. Depolinizam As MTs.
      1. Descarte o supernatant e a almofada.
      2. Resuspenda a pelota em 700 μL de 4 °C M2B.
      3. Incubar a suspensão no gelo.
      4. Agita cada 5 min com uma ponta da pipeta até que a solução esteja desobstruída.
   6. Esclareça a solução limpa centrífuga a 184.000 x g e 4 °C por 35 min.
   7. Aumente a pureza da solução de tubulina rotulada, repetindo etapas 1.2.1-1.2.4.
   8. Medir a concentração de proteínas e corante fluorescente. Use essas medidas para determinar a concentração de tubina e as frações de tubulina rotulada, definidas como a proporção de concentrações de corante fluorescente para a tubulina.
   9. Guarde a solução de tubulina rotulada a -80 °C.
4. Polimerização das MTs (adotadas a partir de Sanchez et al.¹⁹):
   1. Misture a tubulina reciclada (passo 1,2,5) com tubulina rotulada (passo 1,3,9) em uma proporção que rende uma fração de tubulina de 3% rotulada.
   2. Misture a mistura de tubulina de 8 mg/mL com 1 mM DTT e 0,6 mM guanosina-5'[α, β)-metileno]triphosfato (GMPCPP), seguido por 30 min de incubação a 37 °C.
   3. Após a incubação, aneal as MTs à temperatura ambiente no escuro por 6 h.
   4. Aliquot e armazenar a -80 °C.

2. Aglomerados de cinesesina sintetizar

NOTA: As bactérias existem onipresentemente e podem crescer na mídia e contaminar o processo de preparação. Para evitar a contaminação, ações que envolvam contato com as culturas celulares (por exemplo, tubulação) devem ser realizadas perto de uma chama. Ferramentas como frascos, pipetas, dicas de pipetas, mídia e placas devem ser autolavadas antes do uso.

1. Motores expressos de kinesin em Escherichia coli⁴⁰.
   1. Transforme as células.
      1. Pipette 1 μL do plasmid K401-BCCP-H6 em 10 μL de células competentes.
      2. Incubar no gelo por 5 min.
      3. Choque térmico a 42,5 °C para 45 s.
      4. Incubar as células no gelo por 2 min para permitir a recuperação.
      5. Misture as células com 300 μL de 2XYT livre de antibióticos (5 g/L NaCl, extrato de levedura 10 g/L, 16 g/L tripptone).
      6. Incubar as células a 37 °C por 1 h.
         NOTA: A menos que especificado, monitorar o crescimento da célula não é necessário durante a incubação.
   2. Inocular mídia placa.
      1. Espalhe a cultura celular em uma placa 2XYT (10 g/L NaCl, extrato de levedura 5g/L, 10 g/L tripptone, 15 g/L ágar, 100 μg/mL ampicilina, 25 μg/mL chloramphenicol).
      2. Incubar a placa de cabeça para baixo em 37 °C durante a noite.
   3. Inocular mídia líquida.
      1. A partir da placa durante a noite, colher uma colônia isolada com uma ponta de pipeta.
      2. Ejetar a ponta em um frasco contendo 50 mL de 2XYT.
      3. Incubar e agitar a mídia cultural em 37 °C e 200 rpm para 12-16 h.
   4. Expandir as células.
      1. Misture 2,5 mL da cultura celular em 500 mL de 2XYT.
      2. Incubar e agitar a cultura de 500 mL em 37 °C e 250 rpm para 3-6 h.
   5. Induzir a expressão proteica.
      1. Durante a incubação, monitore o crescimento celular medindo a absorção em 600 nm, usando 2XYT como referência. Medir a absorção a cada 60 min, até atingir OD₆₀₀ = 0,3. Em seguida, medir a absorção a cada 30 min até atingir 0,5-0,6.
      2. Permitir que as células cresçam até que a absorção atinja o od₆₀₀ = 0,5-0,6
      3. Adicione 24 μg/mL biotina e 1 mm isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à cultura celular.
         NOTA: IPTG é usado para induzir a expressão de proteína dos motores de cinese, que são marcados com proteína de portador de carboxyl biotina (BCCP) e seis histidinas (H6). A etiqueta H6 é usada no processo de purificação (passo 2.2), enquanto o BCCP se liga às moléculas de biotina adicionadas para biotinylate os motores de cinese expressa.
      4. Incubar e agitar a cultura celular em 20 °C e 250 rpm para 12-20 h.
   6. Colher as células por centrífuga em 5.000 x g e 4 °C por 10 min. Descarte o supernatant. Guarde as pelotas celulares a -80 °C.
2. Purify a proteína motora da cinese (modificada de Spriestersbach eoutros^41):
   1. Suspender a pelota celular (passo 2.1.6) com um volume igual de d'água (50 tubos de mM, 4 mM MgCl_2,50 μM ATP, 10 mM 2-mercaptoethanol (βME), 20 mM imidazole, pH 7.2), seguido pela adição de um comprimido de inibidor de protease, 2 mg de flúor fenilmetil sulfonilo (PMSF) e 2 mg de lysozyme.
   2. Lyse as células por congelamento flash em nitrogênio líquido (LN) 3x e descongelando a mistura celular.
      NOTA: Depois de lysing, a mistura deve tornar-se viscosa.
   3. Esclareça a mistura de células linilhadas centrífugas a 230.000 x g e 4 °C por 30 min.
   4. Colete o supernatant e flua-o através de uma coluna da gravidade, seguida lavando a coluna com 10 mL do amortecedor da lyse.
      NOTA: Proteínas com uma etiqueta H6, como a cineesina K401-BCCP-H6, devem permanecer na coluna.
   5. Eluate a proteína marcada com 5 mL de tampão de elução (50 mM PIPES, 4 mM MgCl_2,50 μM ATP, 500 mM imidazole, pH 7.2). Colete o fluxo sequencialmente em 1 frações mL. Para determinar as frações contendo proteínas, misture 3 μL de cada fração com 100 μL de tinuoso triphenylmetano. As frações contendo proteínas devem ficar azuis. Combine estas frações e diluir por 5x com o amortecedor da lysis.
   6. Concentre a solução proteica.
      1. Carregue a solução em um tubo de filtro centrífuga.
      2. Centrífuga a 3.000 x g por 10 min a 4 °C.
      3. Agite o tubo suavemente e centrífuga novamente até que o volume da solução é <3 mL.
   7. Medir a concentração de proteínacom um espectrômetro (coeficiente de extinção: 0,549 (mg/mL)^-1cm^-1)^42,43. Diluir a proteína para 1 mg/mL, acrescentando 35% w / v sacarose.
   8. Armazenar a -80 °C.
3. Medir as concentrações de cinesina com um gel de eletroforese (modificado de Taylor et al.^44).
   NOTA: Para medir a concentração de cinesina com um gel de eletroforese, a tubulina é uma escada de concentração ideal por causa de sua alta pureza e sua concentração mensurável através de um espectrômetro (Figura 2A)³⁶.
   1. Prepare amostras de tubulina com concentrações de 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 e 1,25 mg/mL. Misture 15 μL de cada amostra de tubulina e amostra de cinenina (passo 2.2.8) separadamente com 5 μL de buffer de amostra (200 mM Tris-HCl, 8% de sulfato de dodcyl de sódio (SDS), 400 mM DTT, 0,2% bromehenol azul, 40% glicerol, pH 6,8) e incubado a 90 °C para 3min.
   2. Prepare a eletroforese.
      1. Tranque um gel de eletroforese na caixa de gel.
      2. Preencha a caixa com tampão de execução (50 mM MOPS, base de 50 mM Tris, 0,1% SDS, 1 mM etilediaminatetraacetic ácido (EDTA), pH 7,7).
         NOTA: Certifique-se de que o nível tampão está acima da abertura superior do gel.
   3. Carregue 10 μL de proteína padrão escada, amostras de tubulina, e amostra de cinese em poços separados e aplicar 200 V em todo o gel para 45 min.
   4. Coloração de gel.
      1. Incubar e balançar o gel com fervida (aproximadamente 95 °C) solução de mancha A (0,5 g/L tinuche triphenylmethane, 10% v/v ácido acético, 25% isopropanol) por 5 minutos, em seguida, lave o gel com água desionizada (DI).
      2. Repita com soluções de manchas B (0,05 g/L tinativo triphenylmethane, 10% v/v ácido acético, 10% isopropanol), C (0,02 g/L tine triphenylmethane, 10% v/v ácido acético) e D (10% v/v ácido acetic), sequencialmente. Incubar e balançar o gel em di água durante a noite.
   5. Escaneie o gel. Converta a imagem do gel em uma imagem em tons de cinza, seguida por uma inversão em preto e branco e um aprimoramento do contraste para revelar bandas de proteína brilhantes no fundo preto.
   6. Medir o brilho de cada faixa, resumindo os valores de pixel. Aplique o ajuste linear C = aB + b, onde B é o brilho de uma banda de tubulina, C é a concentração correspondente, e a e b são parâmetros adequados. Determinar a concentração de cinese C_k usando o brilho da banda kinesin B_k para calcular a equação linear: C_k = aB _k + b.
4. Acomode os motores de cinese.
   1. Misture 1,5 μM kinesin (passo 2.2.8) com 120 μM DTT e 120 nM streptavidin. Incubar no gelo por 30 min.
   2. Armazenar a -80 °C.

3. Prepare slides de vidro revestidos de poliacrilamida e coverslips (modificados de Lau et al.⁴⁵)

1. Carregue novos slides de vidro e cobres de vidro em recipientes correspondentes. Submergir os slides e coverslips em 1% v / v detergente em água DI e, em seguida, ferver a água no microondas.
2. Sonicate os slides e coverslips por 5 minutos e, em seguida, enxaguar com água DI para remover detergente.
3. Submergir e sonicate os slides e coverslips em etanol por 5 minutos Enxágüe com água DI.
4. Submergir e sonicate os slides e coverslips em 100 mM potássio hidróxido (KOH) para 5 min. Enxágüe com água DI.
5. Incubar os slides e coverslips em uma solução silane (1% de ácido acético e 0,5% 3-(trimexisilyl) metionlato de propyl em etanol) por 15 minutos e depois enxaguar com água DI.
6. Incubar os slides e coverslips em solução de acrilamida (2% w/w acrilamida, 0,7 mg/mL de amônio persulfato e 0,0035% v/v tetrametiletilediamina em água DI) por ≥3 h.
7. Armazenar os slides e coverslips na solução de acrilamida.

4. Prepare fluidos ativos baseados em kinesin, baseados em MT

1. Prepare fluidos ativos (modificados de Sanchez et al.^19).
   NOTA: As seguintes etapas demonstram o processo de preparação de 100 μL de um fluido ativo usando estoques de exemplo. O volume final é escalável, e as concentrações dos estoques de exemplo podem ser ajustadas enquanto a concentração final de cada componente for mantida.
   1. Misture 16,7 μL de 8 mg/mL MTs (passo 1.4.4) com 6,7 μL de 1,8 μM kinesin clusters motores (passo 2.4.2), e 1.1 μL de 500 mM DTT em M2B de sal alto (M2B + 3.9 mM MgCl_2).
   2. Pacote MTs adicionando 11,4 μL de 7% w/w polietileno glicol (PEG).
   3. Ativar os motores de cinese adicionando 2,8 μL de 50 mM ATP.
   4. Mantenha as concentrações atp adicionando 2,8 μL de estoque pyruvate kinase/lactato dehydrogenase (PK/LDH) e 13,3 μL de 200 mM fosfenol pyruvate (PEP).
   5. Reduza o efeito de clareamento, adicionando 10 μL de 20 mM Trolox, 1,1 μL de 3,5 mg/mL catalase, 1,1 μL de 20 mg/mL glicose oxidase, e 1,1 μL de 300 mg/mL de glicose.
   6. Acompanhe o movimento do fluido adicionando 1,6 μL de partículas traçadoras de 0,025% v/v.
   7. Adicione m2b de alto sal para alcançar um volume total de 100 μL.
      NOTA: As ordens de mistura nos passos 4.1.1-4.1.6 são intercambiáveis. No entanto, uma vez ATP, MTs, e os motores são misturados, os motores começam a consumir ATP ao pisar ao longo das MTs. A amostra é ativada com uma vida finita devido aos combustíveis limitados (ATP e PEP), de modo que o experimento deve ser iniciado prontamente. O fluido ativo final deve conter 1,3 mg/mL MT, 120 nM kinesin clusters motores, 5,5 mM DTT, 0,8% w/w PEG, 1,4 mM ATP, 2,8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/mL catalase, 0,22 mg/mL de glicose oxidase, 3,3 mg/mL de glicose e 0,0004% v/v colloid em M2B de sal alto.
2. Prepare uma amostra em um canal de fluxo (modificado de Chandrakar et al.^46):
   1. Lave um slide de vidro revestido de poliacrilamida e coverslip (passo 3,7) com água DI. Seque os óculos com ar pressurizado. Coloque em uma superfície limpa e plana.
   2. Corte duas tiras de filmes de cera com uma largura de 3 mm e o mesmo comprimento que o coverslip de vidro (20 mm). Insira as tiras entre o slide e coverslip como espaçadores de canal.
   3. Adere o vidro ao filme de cera, colocando o complexo de cera de vidro em uma placa quente de 80 °C para derreter a cera. Durante o derretimento, pressione o coverslip delicadamente com uma ponta da pipeta para aderir uniformemente a película da cera às superfícies de vidro. Após a adesão, arrefecer o complexo de vidro à temperatura ambiente.
   4. Carregue os fluidos ativos (passo 4.1) para o canal de fluxo. Selar o canal com cola UV.

5. Temperatura da amostra de controle

1. Construir uma configuração de controle de temperatura (modificado a partir de projetos em Lowensohn et al. e Wu et al.^47,48,49).
   1. Prepare um bloco de resfriamento de alumínio.
      1. Moa uma placa de alumínio com dimensões de aproximadamente 30 mm × 30 mm × 5 mm.
      2. Perfurar um canal interno através da placa(Figura 3A)e instalar acessórios mangueira no canal termina.
      3. Engancha cada encaixe a um tubo de água.
      4. Ligue um tubo a uma bomba de tanque de peixes em um reservatório de água enquanto estende o outro tubo até o reservatório.
         NOTA: A bomba circulará a água do reservatório através dos canais internos de alumínio para manter a temperatura do bloco em aproximadamente a temperatura ambiente.
   2. Fio um refrigerador termelétrico (TEC) e um termosensor a um controlador de temperatura. Conecte o controlador a um computador usando uma porta USB(Figura 3B).
   3. Conecte o controlador de temperatura para uma fonte de alimentação de corrente direta (DC). Ligue o controlador, ligando o fornecimento de energia a uma tomada elétrica.
   4. Executar a configuração inicial do TEC seguindo o guia do fabricante do controlador. Teste a saída do TEC. Recomenda-se controlar o controlador de temperatura através de software fornecido pelo fabricante, permitindo a gravação de dados termosensores e manipulação mais fácil do controlador de temperatura.
   5. Identifique os lados de aquecimento e resfriamento do TEC.
   6. Anexe o lado de resfriamento do TEC no bloco de resfriamento (passo 5.1.1) usando pasta térmica.
   7. Anexe um disco de safira ao lado de aquecimento do TEC usando pasta térmica.
   8. A configuração está completa. A superfície de safira e o termosensor podem entrar em contato com uma amostra para resfriar e aquecer a amostra com base em sua temperatura e temperatura alvo.
      NOTA: Recomenda-se que o TEC e o bloco refrigerando tenham um furo central alinhado para a imagem latente as amostras usando a microscopia do brilhante-campo(figura 3C).
2. Use a configuração de controle de temperatura para controlar a temperatura da amostra^33.
   1. Monte a amostra para a configuração.
      1. Coloque a amostra de fluido ativo (passo 4.2.4) na superfície de safira com o lado da lâmina entrando em contato com a superfície.
      2. Fixe o slide de vidro com fita adesiva de papel.
      3. Anexar o termosensor para a superfície coverslip usando fita de cobre.
   2. Monte a configuração em um estágio de microscópio com o lado coverslip voltado para os objetivos. Por exemplo, em um microscópio invertido, o lado do coverslip deve enfrentar para baixo. Proteger a configuração com fita de papel e os grampos de agulha de estágio do microscópio, se aplicável.
      NOTA: O estágio de temperatura apresentado deve trabalhar com microscópios comuns que são invertidos ou eretos. Para garantir que o estágio de temperatura não seja movido durante o experimento, é melhor garantir o estágio de temperatura para o estágio do microscópio com fita adesiva.
   3. Controlar a temperatura da amostra.
      1. Ligue o controlador de temperatura e bomba de tanque de peixes.
      2. Siga o guia do fabricante para definir a temperatura alvo e permitir o controle de temperatura. O controlador ajustará a potência de aquecimento ou resfriamento com base na temperatura alvo e na temperatura da amostra, conforme avaliado pelo termosensor.
   4. Recorde de temperaturas de amostra.
      1. Siga o guia do fabricante para registrar dados de temperatura do termosensor durante o experimento.
         NOTA: A temperatura da amostra deve agora ser controlada pelo controlador e gravada pelo computador(Figura 3D).

6. Caracterizar a atividade do fluido ativo (modificado a partir de métodos por Henkin et al. e Wu et al.^20,27)

NOTA: As seções anteriores são usadas para preparar amostras de fluido ativo (seções 1-4) e controlar sua temperatura (seção 5). Demonstrar o uso da temperatura para controlar a atividade do fluido ativo, observar os comportamentos fluidos, analisar suas atividades e caracterizar sua resposta à temperatura.

1. Monitore os traçadores.
   1. Imagem da amostra com um intervalo constante Δt usando proteína fluorescente verde (GFP) fluorescência para capturar o movimento das partículas traçadoras.
      NOTA: Δt deve ser escolhido para permitir que o movimento tracer a ser rastreado. Os valores de Δt grandes, tais como 100 s, conduzem a perder os trajectories tracer, visto que os valores curtos de Δt, tais como 0.1 s, impedem que o algoritmo de seguimento detecte o movimento do tracer entre frames. Um δt de trabalho deve permitir que o deslocamento tracer entre quadros para estar dentro de ~ 9 pixels. Para traçadores de imagem que se deslocam a 10 μm/s usando um objetivo 4x, o Δt é recomendado para ser 1-5 s.
   2. Salve as imagens como arquivos TIFF, nomeie os arquivos com base no número do quadro e armazene-os em uma pasta separada. Esses processos são necessários para garantir que as imagens adquiridas sejam corretamente analisadas com o script MATLAB fornecido (passo 6.2.2).
2. Track traçadores adotando o software de rastreamento desenvolvido por Ouellette et al.^50,51):
   1. Baixe o software de rastreamento do Laboratório de Complexidade Ambiental da Universidade de Stanford (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Certifique-se de que cada arquivo MATLAB está na mesma pasta.
   2. Rastrear traçadores usando um script Personalizado MATLAB: particle_tracking.m. O script lê imagens traçador (passo 6.1) e faixas tracer movimento usando o software de Ouellette et al.^50,51. Ele produzindo dois arquivos: 1) background.tif, representando o fundo da imagem, e 2) Tracking.mat, contendo as trajetórias de partículas e velocidades em cada quadro(Figura 4A).
3. Analise as velocidades médias do traçador usando um script Personalizado MATLAB: analysis.m. The script reads the tracking file (Tracking.mat) and outputs the mean speed of tracers vs. time, along with a time-averaged mean speed with specified averaging windows (Figure 4B)³³.
4. Record the time-averaged mean speed.
5. Measure the time-averaged mean speed by repeating the experiment (steps 4, 5.2 and 6.1–6.4) at 10–40 °C. Use as velocidades médias registradas para traçar a velocidade média versus temperatura (Figura 4C)³³.

Results

Preparar os fluidos ativos orientados por quinesinas e MT requer ciinina e MTs. As MTs foram polimerizadas de tubulins rotuladas (etapas 1.3 e 1.4) que foram purificadas dos cérebros bovinos (passo 1.1, Figura 2A),seguidos de reciclagem para aumentar a pureza (passo 1.2, Figura 2B). As proteínas motoras de cinese foram expressas e purificadas de E. coli (passos 2.1 e 2.2, Figura 2B<...

Discussion

Controlar a matéria ativa in situ abre a porta para a auto-organização direcionada da matéria ativa^{4,5,24,28,54.} Neste artigo, apresentamos um protocolo para o uso da temperatura para controlar os fluidos ativos in situ baseados em quinesina e MT, com base na característica arrhenius do sistema^29,30,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(±)-Ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico	Sigma-Aldrich	238813	Trolox
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
metacrilato de 3-(trimetoxissilil)propil, 98%, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC216550050
3,2 mm I.D. Tygon Tubing R-3603	HACH	2074038	Tubos de água
31,75 mm de diâmetro não revestidos, janela de safira	Edmund Optics	43-637	Disco de safira
3M 1181 Fita de Cobre - 1/2 IN Largura X 18 YD Comprimento - 2.6 MIL Espessura Total - 27551	R.S. HUGHES	054007-27551	Fita de Cobre
Ácido Acético	Sigma-Aldrich	A6283
Solução de Acrilamida (40%/Eletroforese), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1402-1
Adenosina 5'-trifosfato dipotássico sal hidratado	Sigma-Aldrich	A8937	ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)	Thermo Fisher Scientific	A20006	Corante fluorescente vermelho distante. Alexa 647 pode ser pré-suspenso em dimetilsulfóxido (DMSO) antes de ser misturado com microtúbulos (1.3.3.2.)
Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-4	Sigma-Aldrich	UFC801024	Tubo de filtro centrífugo. Peso molecular de corte: 10 kDa
Persulfato de Amônio, 100g, MP Biomedicals	Fisher Scientific	ICN802829	APS
Ampicilina de Sódio Sal (Pó Cristalino), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1760	Ampicilina
Antivibração Mesa	Nikon	63-7590S
Avanti J-E Centrífuga	Beckman Coulter	369001
Agente Soldificante de Ágar Bacto, BD Diagnostics	VWR	90000-760	Ágar
Biotina	Alfa Aesar	A14207
Balde-plástico branco - 2 galões	Balde de água	Bon	84-715
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	746495	CaCl2
Catalase de fígado bovino	Sigma-Aldrich	C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj	Nikon	MRD00045	4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift	Nikon	96372	GFP cubo de filtro
CH-109-1.4-1.5	TE Technology	CH-109-1.4-1.5	Thermoelectric Cooler (TEC)
Cloranfenicol, 98%, ACROS Organics	Fisher Scientific	C0378
Bloco de resfriamento	N/A	N/A	Alumínio fresado personalizado
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400	Bio-Rad	1610400	Corante Trifenilmetano
D-(+)-Glicose	Sigma-Aldrich	G7528
Dimetil Sulfóxido (Certificado ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	D128	DMSO
DL-1,4-Ditiotreitol, 99%, para bioquímica, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC165680050	DTT
DOWSIL 340 Composto de dissipador de calor	Dow	1446622	pasta térmica
ÁLCOOL ETÍLICO, 200 PROOF ACS/USP/NF GRAU 5 GALÕES POLY CUBE	Pharmco by Greenfield Global	111000200CB05	Etanol
Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetracético	Sigma-Aldrich	E3889	EGTA
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma-Aldrich	798681	EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Triptona	Fisher Scientific	BP1421	Triptona
Fisher BioReagents Microbiologia Media Additives: Extrato de Levedura	Fisher Scientific	BP1422	Extrato de levedura
Fluoresbrite YG Microspheres, Grau de Calibração 3.00 µ m	Polysciences	18861	Partículas traçadoras
Glicose Oxidase de Aspergillus niger	Sigma-Aldrich	G2133
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
GpCpp	Jena Bioscience	NU-405L	Guanosina-5'[ (α,β)-metileno]trifosfato (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 pés, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable para Carro, Áudio, Home Theater	Amazon	B07428NBCW	Fio de cobre
Guanosina 5'-trifosfato sal de sódio hidratado	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	Detergente
HEPES Sal de Sódio (Pó Branco), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP410	NaHEPES
Máquina liquidificadora de alto desempenho	AIMORES	AS-UP1250	Liquidificador
His GraviTrap	GE Healthcare	11003399	Gravity Column
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758	Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo
Álcool Isopropílico 99%	Pharmco por Greenfield Global	231000099	Isopropanol
JA-10 rotor	Beckman Coulter	369687
ácido L-glutâmico sal de potássio monohidratado	Sigma-Aldrich	G1501	K-Glutamato
Lisozima de clara de ovo de galinha	Sigma-Aldrich	L6876
Cloreto de magnésio hexahidratado	Sigma-Aldrich	M2670	MgCl2•
Sal de sódio	Sigma-Aldrich	M5057	Sal de sódio de ácido 2- (N-morfolino) etanossulfônico
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	Ácido 3- (N-morfolino) propanossulfônico
MP-3022	TE Tecnologia	MP-3022	Termopar
N, N, N ', N'-Tetrametiletilenodiamina 99%, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC138450500	TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Espectrofotômetro	Thermo Fisher Scientific	E112352	Espectrômetro
Nikon Ti2-E Nikon Microscópio Invertido	Nikon	MEA54000
Norland Adesivo Óptico 81	Norland Products	NOA81	Cola UV
Novex Sharp Padrão de Proteína Pré-corada	Thermo Fisher Scientific	LC5800	Escada padrão de proteína
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well	Thermo Fisher Scientific	NP0335BOX	SDS gel
Ultracentrífuga Optima L-90K	Beckman Coulter	365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" de Largura; 125 Ft/Roll	cera	Cole-Parmer	EW-06720-40
Pe 300 ultra Sistema de Iluminação Banda Única, 3mm Controle de Guia de Luz Fonte de alimentação Pod	Nikon	PE-300-UT-L-SB-40	Cool LED Iluminador
Fluoreto de fenilmetanossulfonil	Sigma-Aldrich	78830	PMSF
Sal monopotássico de ácido fosfoenolpirúvico, 99%	BeanTown Chemical	129745	PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Kit de ensaio de proteína	Thermo Fisher Scientific	23200
Inibidor de protease Pierce Mini comprimidos	Thermo Fisher Scientific	A32953
CACHIMBOS	Sigma-Aldrich	P6757	1,4-Piperazinadietanossulfônico
Ácido Plurônico F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Poli (etilenoglicol)	Sigma-Aldrich	81300	PEG. Peso molecular médio 20.000 Da
Hidróxido de Potássio (Pellets/ACS Certificado), Fisher Chemical	Fisher Scientific	P250-500	KOH
PowerEase 300W Fonte de alimentação (115 VAC)	ThermoFisher Scientific	PS0300	Fonte de alimentação DC da caixa de gel
PS-12-8.4A	TE Technology	PS-12-8.4A	Fonte de alimentação DC do controlador
de temperaturaEnzimas piruvato quinase / lactic desidrogenase do músculo de coelho	Sigma-Aldrich	P-0294	PK / LDH
Quiet One Lifegard, 296 galões por hora	Bomba de	de	peixes
Rosetta 2(DE3)pLysS Células competentes - Novagen	Millipore Sigma	71403	Células competentes
Forno de micro-ondas de bancada Sharp ZSMC0912BS Sharp 900W, 0,9 pés cúbicos, aço inoxidável	Amazon	B01MT6JZMR	Microondas para ferver a água
Cloreto de sódio (ACS cristalino / certificado), Fisher Chemical	Fisher Scientific	S271-500	NaCl
Dodecil sulfato de sódio	Sigma-Aldrich	L3771	SDS
Fosfato de sódio monobásico	Sigma-Aldrich	S8282	NaH2PO4
Proteína de estreptavidina	Thermo Fisher Scientific	21122
Sucarose	Sigma-Aldrich	S7903
TC-720	TE Technology	TC-720	Controlador de temperatura
Tris Base, Grau de Biologia Molecular - CAS 77-86-1 - Calbiochem	Sigma-Aldrich	648310	Tris-HCL
Tipo 45 Ti rotor	Beckman Coulter	339160
Tipo 70 Ti rotor	Beckman Coulter
Rotor tipo 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
VWR Fita de rotulagem de laboratório de uso geral	VWR	89097-916	Fitas de papel
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2	VWR	48366-227	Lamínulas de vidro
VWR Micro slides lisos e foscos, Premium	VWR	75799-268	Slides de vidro
XCell SureLock Mini-Cell	ThermoFisher Scientific	EI0001	Caixa de gel
ZYLA 5.5 USB3.0 Câmera	Nikon	ZYLA5.5-USB3	Câmera CCD monocromática