Plataforma de Microfluidos Digitais baseada em eletrowetting para ensaio imunosorbent automatizado ligado à enzima

Summary

Microfluido digital à base de eletrowetting é uma técnica que utiliza uma mudança impulsionada por tensão no ângulo de contato aparente de uma gotícula de volume de microlitros para facilitar sua manipulação. Combinar isso com contas magnéticas funcionais permite a integração de múltiplas operações de unidades laboratoriais para preparação e identificação de patógenos usando Oensaio Imunosorbent ligado à enzima (ELISA).

Abstract

Eletrowetting é o efeito pelo qual o ângulo de contato de uma gotícula exposta a uma carga de superfície é modificado. O eletrowetting-on-dielectric (EWOD) explora as propriedades dielétricas de filmes isoladores finos para aumentar a densidade de carga e, portanto, aumentar o efeito eletrowetting. A presença de acusações resulta em uma propagação eletricamente induzida da gotícula que permite manipulação proposital em uma superfície hidrofóbica. Aqui, demonstramos o protocolo baseado em EWOD para processamento e detecção de amostras de quatro categorias de antígenos, utilizando uma plataforma automatizada de atuação de superfície, através de duas variações de métodos de Ensaio Imunosorbent (ELISA) ligados à enzima. A ELISA é realizada em contas magnéticas com anticorpos primários imobilizados que podem ser selecionados para atingir um antígeno específico. Um anticorpo conjugado ao HRP liga-se ao antígeno e é misturado com H₂O₂/Luminol para quantificação dos patógenos capturados. Foram alcançados prazos de conclusão entre 6 e 10 minutos, enquanto volumes minúsculos de reagentes foram utilizados.

Introduction

O método proposto visa facilitar a preparação automatizada de amostras para a ELISA com detecção quantitativa de antígenos usando abordagem baseada em EWOD com microfluidos digitais (DMF) e separação magnetofóbica. Foi demonstrado por múltiplas aplicações biológicas que o DMF em combinação com magnetoforese é uma alternativa interessante às aplicações de manuseio líquido¹. Mais especificamente, a detecção de patógenos é um aspecto implícito em muitos setores, desde a saúde² até a agricultura e o meio ambiente^3,4 até a segurança nacional⁵. Uma tecnologia de detecção capaz de lidar com as ameaças de patógenos deve apresentar alto throughput (por exemplo, tempo curto de ensaio), eficiência (baixo Limite de Detecção – LoD – e alta sensibilidade) e especificidade (para o tipo de patógeno alvo) para que seja funcional⁶.

Anteriormente, o DMF baseado em EWOD foi implementado com sucesso para a Reação da Corrente de Polimerésia de Transcrição Reversa (RT-PCR), detecção de um patógeno resistente a antibióticos (Staphylococcus resistente à Meticilina aureaus ou MRSA), M.pneumonia e C.albicans usando um chip de placa de circuito impresso de baixo orçamento e magnetoforose⁷. A técnica foi aplicada também para a detecção de mutações de ácido desoxiribonucleico (DNA) através de pirosequenciamento e detecção quimioiluminescente⁸. As plataformas baseadas em EWOD também expandem sua funcionalidade para aplicativos de imunoensaio, permitindo assim a recuperação e detecção simultânea de amostras dentro de uma única plataforma integrada. Por exemplo, um único design de chip EWOD foi demonstrado com sucesso com uma plataforma DMF para testes de ponto de cuidado para ambos imunoensaios à base de contas de troponina cardíaca I de uma amostra de sangue inteira e como um experimento separado RT-PCR para detecção do MRSA². Esse chip utiliza enchimento de óleo, o que previne a evaporação das gotículas e facilita a manipulação automatizada confiável de volumes de nanoliter. Bioaplicações versátils foram investigadas com a implementação de abordagens semelhantes de DMF que abrangem imunoensaios quantitativos homogêneos e heterogêneos^9,10, incluindo projeto de estudos de experimentos (DoE) para otimização de parâmetros de ensaio¹¹.

Apesar de seus méritos óbvios para processar a intensificação devido aos volumes de trabalho minúsculos, uma plataforma dmf cheia de óleo pode ser desafiadora e requer um certo nível de experiência para operar. Sistemas cheios de óleo, por necessitarem de componentes lacrados, não são ideais para uma determinada aplicação em campo onde a transporte do sistema é importante. Além disso, um sistema à base de petróleo seria muito difícil se não impossível de usar para algumas aplicações específicas aproveitando a coleta de material seco em uma superfície como proposta por Zhao e Cho¹², Jönsson-Niedziółka et al.¹³, e Foat et al.¹⁴. Em contraste, sistemas livres de óleo são simples de integrar e têm a vantagem de fornecer uma tradução fácil de amostra chip-to-chip. Por essas razões, o método proposto foi desenvolvido para fornecer um imunoensaio baseado em EWOD no DMF que não exigiria petróleo, simplificando efetivamente a operação do dispositivo.

Nesta contribuição, relatamos sobre o uso de uma plataforma DMF medida, autônoma e totalmente automatizada para imunoensaios, e elaboramos sobre o protocolo para a rápida detecção de biomoléculas, ou seja: proteínas, bactérias vegetativas, esporos bacterianos e vírus. A combinação de chip EWOD com partículas magnéticas para preparação automatizada de amostras e imunoprecipitação já foi demonstrada com uma medição adicional de MS fora da linha¹⁵. Recentemente, o diagnóstico em campo contra o sarampo e a rubéola IgG foi demonstrado na remota população do Noroeste do Quênia pelo grupo Wheeler¹⁶. Tanto wheeler e nosso sistema, sendo transportável, autônomo, totalmente automatizado com medições chemiluminescentes incluídas no chip e em tempo real estão indiscutivelmente entre os sistemas de biodetecção dmf mais avançados disponíveis.

Os dois sistemas foram projetados com aplicações muito diferentes em mente. O sistema de Wheeler tem como alvo o biomarcador para permitir diagnósticos biomédicos em pacientes, enquanto nosso sistema de biodetecção é construído em torno da exigência de defesa para detecção direta de patógeno previamente amostrado de ar. A semelhança entre os dois é o princípio subjacente da atuação de gotículas, que demonstra a ampla gama de setores que influenciam a vida que a tecnologia baseada em EWOD pode impactar. Ou seja, a plataforma de detecção baseada em DMF e o sistema EWOD associado podem encontrar implicações fundamentais na saúde (diagnóstico biomédico); proteção militar e civil (detecção de ameaças); Agrotecnologia (monitoramento de culturas) e segurança do trabalho (monitoramento ambiental controlado)

O desempenho da nossa plataforma DMF é avaliado contra a detecção totalmente automatizada de albumina de soro humano (HSA, uma proteína globular), Escherichia coli (E. coli, uma bactéria vegetativa), Bacillus atrophaeus (BG, um esporo bacteriano) e MS2 (um vírus bacteriófago). Mais importante, o método proposto pela DMF é extremamente versátil no sentido de que os anticorpos de captura poderiam ser trocados para direcionar a detecção de outros antígenos diferentes dos quatro que são considerados neste artigo. Afastando totalmente o sensor de anticorpos, a plataforma DMF poderia construir para uma aplicação potencial baseada em biossensoriador aptamer, onde as contas magnéticas carregam aptamers específicos para captura e/ou detecção de nucleotídeos. O design e a realização dos diferentes componentes que constituem a plataforma DMF integrada e completamente auto-contida, incluindo o gerador de forma de onda de alta tensão e a eletrônica de unidade é divulgada em outros lugares⁶.

Protocol

1. Etapas preliminares necessárias para o ensaio

NOTA (IMPORTANTE): Todas as etapas preliminares devem ser realizadas em ambiente estéril para evitar contaminações. O azido de sódio não deve ser usado para armazenamento, pois inibiria a atividade da enzima peroxidase rabanete (HRP).

1. Prepare o tampão de corrida (100 mM HEPES, pH 7.5), usando o (4-(2-hidroxyethyl)piperazine-1-ácido ethanesulfonico, e adicione Tween 80 a uma concentração de 0,01% (v/v).
2. Imobilize os anticorpos primários (anticorpos de captura) na superfície das microesferas magnéticas ativadas pelo NHS seguindo o protocolo fornecido pelo fornecedor. Resumidamente, o protocolo magneticIP/Co-IP(Tabela de Materiais)abrange as seguintes etapas.
   1. Aliquot 0,2 mL de contas (2 mg) em um tubo de plástico e remova o supernatant.
   2. Lave as contas adicionando 1 mL de 1 mCl frio no gelo.
   3. Amarre o anticorpo selecionado (Anti-Human Serum Albumin [15C7], Rb anti-BG polyclonal, Rbanti-E.coli MRE 162 policlonal ou goat anti-MS2 polyclonal), 40 μg/mL em 67 mM Borate Buffer, covalentemente às contas por 1h com tremor a 37 °C. A Tabela 1 contém a lista de todos os anticorpos usados com o protocolo atual e os patógenos antígenos⁶.
   4. Lave os anticorpos desvinculados duas vezes com 0,8 mL de Tampão de Elução.
   5. Saciar a reação com 1 mL de Tampão Saciando por 1h.
   6. Lave as contas uma vez com buffer de borate modificado e uma vez com IP Lysis/Wash Buffer.
   7. Resuspender as contas em 0,5 mL de IP Lysis/Wash Buffer e armazene a 4 °C até que seja necessário para uso.
      NOTA: Para obter melhores resultados, um novo lote de microesferas são acoplados aos anticorpos um dia antes do eWOD-isolamento e eLISA on-chip. No entanto, as microesferas acopladas ao anticorpo primário podem ser armazenadas a 4 °C até um mês. Caso ocorra aglomeração, toque no frasco para quebrar o precipitado e resuspender as contas da solução.
   8. Bloqueie as microesferas com o anticorpo acoplado durante a noite, usando concentração final de 4 mg/mL para as microesferas, em um Blocker Casein (1% w/v) em 100 mM sorofiatampável de fosfato (PBS).
      NOTA: A etapa de bloqueio é sempre realizada um dia antes da execução do ensaio de biodetecção.
   9. Separe as contas do Blocker Casein usando um ímã e remova o supernatant.
   10. Resuspender em 1 mL de tampão de corrida e misture por 1 min.
   11. Separe as contas usando o ímã e remova o supernatant.
   12. Repita as etapas de lavagem acima (1.2.10 e 1.2.11) duas vezes.
       NOTA: Três etapas de lavagem são suficientes para reduzir a adesão das contas à superfície e facilitar a livre circulação da gotícula.
   13. Resuspender as contas no tampão em execução a uma concentração de 2,5 mg/mL. Esta solução de microesferas está pronta para ser usada com o chip EWOD.
3. Prepare uma solução da peroxidase de rabanete conjugado (HRP) e do anticorpo biotinylado secundário para uma concentração final para cada um de 1 μg/mL em Tampão de Execução (usado para detecção BG⁶).
   NOTA: Para atingir os antígenos (Tabela 1) várias concentrações de anticorpo biotinylated secundário, variando de 0,5 a 4,0 μg/mL foram testadas com sucesso.
4. Misture volumes iguais do Luminol com solução de peróxido de hidrogênio pouco antes de executar o ensaio
   NOTA: O Luminol é usado para quantificar o número de eventos de ligação com base na enzima HRP que está ligado covalentemente ao anticorpo secundário que tem como alvo o antígeno (por exemplo, patógeno). No entanto, diferentes moléculas e estratégias de relatórios podem ser usadas para detecção¹⁷ em vez da quimiocência e Luminol.

2. Fabricação e tratamento superficial dos componentes do chip EWOD

NOTA: O chip EWOD consiste em uma placa de atuação com eletrodos de cromo padronizados para alternar o ângulo de contato aparente de uma gotícula e uma placa de cobertura para definir a altura das gotículas.

1. Desenhe o design dos eletrodos e conectores em 2D usando software CAD padrão. Inclua também a almofada de coleta de resíduos com dimensões de 5 x 5 mm² para armazenar os solventes utilizados (Figura 1).
   NOTA: Para manipular as gotículas usamos 47 eletrodos, cada um com dimensões de 1,7 x 1,7 mm². Este tamanho de eletrodo acomoda volumes de gotículas que variam de 1,5 μL a 3 μL (para uma lacuna de 500 μm). A partir da experiência, ao trabalhar com uma lacuna de 500 μm, 1,5 μL é o tamanho mínimo de gotícula que pode ser acionado. Corresponde aproximadamente ao contorno de gotícula (projetado) circunscrito para a almofada quadrada. No entanto, não há nenhum limite teórico em tamanho diferente do causado pela resistência (atrito) do corpo do fluido. No entanto, recomenda-se que o volume não exceda 3 μL para atuação confiável usando uma lacuna de 500 μm. Os eletrodos são abordados por eletrônicos de 48 canais.
   NOTA: As dimensões de design e tamanhos das almofadas podem variar dependendo dos volumes pretendidos e das operações da unidade de laboratório (LUOs) que compõem o protocolo.
2. Envie o desenho de design para um serviço de fabricação de máscaras para imprimir a máscara de cromo em um substrato de vidro. A espessura da camada de cromo é de 100 nm.
   NOTA: A camada de cromo na fotomáscara usada como substrato para o chip EWOD é, por definição, opaca. O design de cada um de nossos eletrodos inclui um layout de grade para garantir a semi-transparência.
3. Corte a placa para o tamanho de 56 x 56 mm² com uma precisão CNC Dicing/Cutting Saw.
4. Coloque fita adesiva sobre os contatos elétricos, a fim de isolá-los durante as duas etapas de revestimento.
5. Cubra a placa de vidro cromo da placa com uma camada dielétrica depositando 6 μm Parylene-C em sua superfície. O processo^{gorham 18} é usado com 7,4 g de DPX-C em um Sistema de Deposição parylene (Tabela de Materiais).
6. Fluoropolímeros asfados do spin-coat(Tabela de Materiais)usando um spin-coater a 1500 rpm por 30 s em cima da placa e assá-lo a 140 °C por 30 min.
   NOTA: Isso torna a superfície hidrofóbica. Pode-se validar se o revestimento foi depositado com sucesso colocando uma gota de água na superfície. O ângulo de contato entre a gotícula e a placa deve estar na região de 110º.
7. Remova a fita adesiva dos contatos elétricos.
8. Fluoropolímeros asfados do spin-coat(Tabela de Materiais)usando um spin-coater a 1500 rpm por 30 s em cima do wafer de silício 4-in e assá-lo a 140 °C por 30 min.
   NOTA: É importante que tanto as superfícies da atuação quanto as placas de cobertura sejam hidrofóbicas, a fim de facilitar o movimento suave das gotículas discretas durante o ensaio.

3. Carregamento, montagem e operação do chip EWOD na plataforma DMF

NOTA: O chip EWOD opera usando configuração de placa paralela com uma lacuna definida de 0,5 mm entre a placa de atuação e a placa de cobertura condutora e aterrada. Este conjunto de sanduíches está descrito na seção atual.

1. Remova a tampa da plataforma DMF⁶ e coloque-a no banco.
   NOTA: Uma câmara escura de gaiola faraday é necessária para evitar a luz perdida e a interferência eletromagnética durante a detecção. Não há bloqueio na tampa, portanto, a plataforma nos permite observar o movimento das gotículas.
2. Coloque uma placa de atuação limpa no estágio rotativo, cromo voltado para cima. A placa precisa estar alinhada com o canto superior esquerdo da etapa recessada (Figura 2A).
3. Aperte a placa de atuação da parte superior usando o painel com os 47 pinos de contato. Isso protege a placa no lugar e facilita o alinhamento com os pinos de contato.
4. Coloque o shim de 0,5 mm e o separador de 2 mm de polimemetlatocrilato (PMMA) no estágio rotativo, a fim de fornecer uma lacuna controlada entre a atuação e as placas de cobertura.
   NOTA: Opcionalmente, o papel de vime pode ser colocado no bloco de descarte de resíduos antes de citar as gotículas antes do próximo passo. À medida que o ensaio prossegue, o lixo é diretamente absorvido no papel que pode ser removido no final do ensaio.
5. Carregue as gotículas nas almofadas de carregamento propostas (Figura 1).
   1. Aliquot quatro gotículas de 2,5 μL do tampão de execução para as almofadas B-, A-, R-, E-denoted, uma gotícula em cada almofada.
   2. Aliquot 2,5 μL de Luminol:H₂O₂ (1:1, v/v) solução para o bloco denotado D.
   3. Aliquot 2,5 μL de Neutravidin conjugado ao HRP (1 μg/mL) na almofada f-denotada.
   4. Aliquot 2,5 μL de anticorpo secundário biotinylado (1 μg/mL) na almofada denotada por G.
   5. Aliquot 2,5 μL de Microesferas com anticorpo primário conjugado (2,5 mg/mL) vai para o bloco denotado.
   6. Aliquot 2,5 μL da amostra desconhecida na almofada denotada em C.
      NOTA: O padrão de carregamento proposto é apenas um exemplo de layout experimental, no entanto, o padrão de carregamento pode ser alterado para corresponder às necessidades dos usuários, desde que essas mudanças correspondam à sequência definida no software (Arquivo Complementar 1).
6. Coloque a placa de tampa na superfície da plataforma, além da área de recesso redondo, e deslize-a lateralmente para o recesso e em cima da placa de atuação (Figura 2B).
7. Coloque o ímã permanente em cima da placa de tampa e segure-o deslizando as duas travas(Figura 2C).
8. Gire o palco em 180° e inspecione visualmente se as gotículas carregadas ainda estiverem no lugar (Figura 1C).
   NOTA: Deve-se ser capaz de ocular a posição e a forma de gotículas através do estágio transparente e na parte de trás da placa de atuação (Figura 2D). O ensaio está pronto para funcionar se gotículas redondas pudessem ser vistas em cima das almofadas de eletrodos de carregamento. No caso de uma gota ser deslocada, pode-se remover o ímã e a placa de tampa, em seguida, recuperar a gotícula deslocada com uma pipeta limpa e colocá-la novamente na almofada de carregamento.
9. Verifique se a posição de carregamento para cada gotícula corresponde à sequência de atuação programada no software (consulte O Arquivo Complementar 1 para obter detalhes sobre o software).
   NOTA: Para poder verificar visualmente a posição das gotículas, o fotodetector precisa ser desmontado(Figura 2D).
10. Posicione o fotodetector "lata" na ranhura do estágio rotativo.
    NOTA: O sistema de fotodetecção gira em torno de um fotodiode, que tem uma grande área de coleta (10 x 10 mm²) para maximizar a coleta de luz sem óptica adicional, além de um amplificador trans-impedance para minimizar o ruído⁶. No entanto, o sistema é extremamente sensível e pode coletar sinais minuciosos. Para reduzir o nível de ruído, uma série de estratégias baseadas em eletrônicos foram implementadas (por exemplo, o sistema de fotodetecção foi protegido colocando-o em uma gaiola faraday, uma invólucro de metal conhecida como "lata" exibida).
11. Conecte o cabo ao fotodetector de tela "lata".
    NOTA: Uma vez que o chip EWOD esteja alinhado com o fotodetector, a plataforma DMF está completamente montada e agora está pronta para operar.
12. Coloque a tampa sobre a plataforma DMF e inicie a sequência do programa usando a interface de software desenvolvida na Universidade de Hertfordshire.
    NOTA: Software adicional é usado para ler e gravar a luminescência da gotícula como função de tempo em um arquivo CSV (ver Arquivo Suplementar 2).
    1. Certifique-se de que a sequência programada (ver Arquivo Complementar 1) as mensagens imediatas aparecem na interface para informar ao operador que "A gotícula luminol está pronta para coletar as contas magnéticas extraídas" ou "A gotícula de detecção está pronta para ser movida para o local de detecção". Em ambos os casos, a confirmação do operador é necessária para prosseguir com a sequência.

4. Operar no modo visual (Opcional para otimização de protocolos)

NOTA: Se desejar, para visualizar cada operação baseada em gotículas, o ensaio pode ser operado pulando as etapas 3.10-3.12 e substituindo-as pelas seguintes operações.

1. Inicie a sequência do programa usando a interface de software.
   NOTA: O movimento da gota pode ser observado durante a operação no modo visual, o que é útil durante a otimização do protocolo. Em primeiro lugar, para verificar a reprodutibilidade da operação de separação magnética. Por exemplo, se a quantidade de contas utilizadas for muito baixa, a separação magnética não ocorrerá, vice-versa, se a quantidade de contas for muito alta, a gotícula pode ser imobilizada pela pelota de contas. Em segundo lugar, verificar a confiabilidade de um novo ensaio, pois alguma formulação de gotículas pode causar prejuízo de atuação que pode ser detectado por observação.
2. Monte o fotodetector exibido "lata" na fenda do estágio rotativo, quando solicitado.
3. Conecte o cabo ao fotodetector de tela "lata", inserindo os pinos na tomada.
4. Coloque a tampa sobre a plataforma DMF e retome o ensaio.
   NOTA: Use o software adicional para ler e registrar a luminescência da gotícula como função de tempo em um arquivo CSV (ver Arquivo Suplementar 2)

5. Remoção de resíduos líquidos e limpeza do chip

ATENÇÃO: Certifique-se de que o equipamento está desligado e desconectado de fontes de alimentação (computador, principal) antes da limpeza. Use luvas, um jaleco e vidro protetor de óculos (EPI) ao remover amostras biológicas do chip!

1. Para acessar os eletrodos e os solventes usados na placa de atuação, abra a tampa da plataforma DMF e gire o estágio 180°.
2. Desacomode a carcaça do ímã, remova o ímã do estágio rotativo e coloque-o no banco.
3. Retire a placa de tampa, o wafer de silício, da fenda com um par de pinças, enxágue-a com água DI, seque-a com ar comprimido e coloque-a em uma placa de Petri, onde o wafer pode ser armazenado e reutilizado.
4. Use uma micropipette para mover os resíduos líquidos da almofada sem tocar na superfície.
5. Limpe a superfície tirando o líquido da placa de atuação usando papel absorvente (material filtro).
   NOTA: Manter a superfície intacta aumentará a longevidade da placa de atuação, que permite múltiplos usos.
6. Limpe a placa de atuação varrendo suavemente a superfície dos eletrodos com uma gotícula de água DI limpa usando uma pipeta limpa. Em seguida, remova a gotícula com papel de vime (material filtro).
   ATENÇÃO: Descarte os tecidos, papéis, pontas de pipetas e luvas que estão contaminadas com material biológico na lixeira bio-resíduos.
7. Use a placa de atuação para um ensaio diferente ou remova-a da plataforma DMF para armazenamento ou reciclagem.

Results

O impacto da tensão de atuação foi investigado para elucidar quais eram as condições ideais para realizar os ensaios. Uma gota do buffer foi impulsionada em várias tensões de atuação e seu movimento foi registrado. Os achados demonstraram (Figura 3) existia uma correlação entre a tensão média de atuação quadrada raiz (V_rms) e a velocidade média. No entanto, a longevidade de uma placa de atuação foi reduzida quando foram utilizados altos valores para_{V rms.} Com base nesses resultados, 105 V_rms foi escolhido como a tensão de atuação padrão, 120_{V rms} foi encontrado para funcionar melhor para a gotícula H₂O₂/Luminol e 165_{V rms} foi implementado para a extração LUO. Essas tensões foram incluídas na sequência de programação automatizada (Arquivo Complementar 1).

Dois imunoensaios (Figura 4) foram testados com sucesso usando o chip EWOD com a plataforma DMF para quatro patógenos diferentes (Tabela 1). O chip EWOD facilitou o movimento consecutivo das gotículas das plataformas de carregamento para a região de mistura e, finalmente, para os resíduos. Havia dois LUOs básicos que se repetiram ao longo do protocolo para completar a ELISA. O primeiro foi a extração LUO; brevemente descrito aqui, a gota contendo as contas suspensas foi levada ao local de separação no meio da zona de mistura, o ímã foi ativado automaticamente para se aproximar do chip e para agrupar as contas magnéticas em uma pelota(Figura 5). Em seguida, a gotícula foi movida em direção à almofada de resíduos, deixando as contas na placa de atuação, concluindo assim a extração LUO. A mistura foi a próxima chave luo a acontecer no chip EWOD. A amostra de analyte com uma concentração desconhecida de patógenos foi movida para as contas por eletrowetting. Em seguida, as contas foram resuspensas movendo a gotícula com as contas desajeitadas sobre a área de mistura (10 almofadas no total). Estes dois LUOs foram essenciais, pois facilitaram um processamento de amostras miniaturizada, rápida e reprodutível com detecção consecutiva dos patógenos em 6 a 10 min. A figura 6 mostra a sequência completa de LUOs a partir de um imunoensaio realizado com o chip EWOD.

Para atender aos níveis desejados de automação, variações no protocolo poderiam ser introduzidas. Por exemplo, as contas foram separadas da gotícula de antígeno esgotada, que foi então transferida para a lixeira, repetindo a extração básica LUO. Nesta fase, o protocolo poderia ramificar-se dependendo se o anticorpo de detecção já estava conjugado com o HRP, utilizando efetivamente oito LUOs no total para a detecção dos diferentes antígenos (Figura 7A-C). Nesses casos, a gota com o anticorpo de detecção foi trazida para as contas e depois misturada por atuação. Alternativamente, ligar o anticorpo de detecção ao conjugado Neutravidin-HRP poderia ser realizado sequencialmente em situ no chip EWOD, como foi demonstrado para a quantificação de E. coli (Figura 7D). Ambos os protocolos, o ELISA de oito e dez passos,produziu detecção reprodutível de antígenos.

Os tempos de incubação e as concentrações conjugadas foram variados para encontrar experimentalmente as condições ideais para o ensaio (Figura 7A). Verificou-se que o tempo de incubação de 160 s e concentração conjugada de 2 μg/mL atingiu a melhor relação sinal/ruído com um aumento de 36% da força do sinal e praticamente nenhuma alteração nos níveis de ruído de fundo. Todos os números e dados utilizados na seção de resultados representativos foram modificados de um trabalho anterior⁶.

Anticorpo primário / captura	Anticorpo de detecção	Antígeno
Álbum de soro anti-humano [15C7] (anti-HSA, Abcam ab10241)	Peroxidase de Rabanete de Cavalo (HRP) marcou anti-HSA [1A9] (Abcam ab24438)	Álbum de Soro Humano (HSA, Abcam)
Policlonal anti-BG rb	Biotinylated Rb anti-BG policlonal	B. globigii (BG) esporos
RB anti-E.coli MRE 162 policlonal	Biotinylated Rb anti-E.coli 162 MRE policlonal	E. coli MRE 162
Policlonal anti-MS2 de cabra	Policlonal anti-MS2 biotinylated rb	Vírus bacteriófago MS2

Tabela 1: Antígenos e anticorpos testados com este protocolo. Quatro tipos de antígenos patógenos foram usados para demonstrar as capacidades do chip EWOD com a plataforma DMF.

Figura 1: Design da placa EWOD. (a)Notação esquemática da placa de atuação EWOD com conectores (quadrados, Topo) que estão ligados (linhas) aos eletrodos (quadrados, Fundo). Cada bloco é atribuído a um número e pode ser endereçado a partir do código de software (Arquivo Complementar 1). As almofadas de eletrodos de carregamento são marcadas por setas e denotadas por uma letra maiúscula acima ou abaixo de cada bloco. Um recurso-chave para a plataforma DMF é a zona de mistura composta por dez almofadas (nº 31, 32, 33, 36, 37, 42, 43, 44, 46, 47). Como guia visual, a zona de mistura é marcada com um retângulo vermelho. (b)Micrografedo do design de microgrid das almofadas. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 2: Componentes e estágios-chave para o conjunto do sistema microfluido digital (DMF). (A) Corrija a placa de atuação EWOD, coloque o shim no estágio rotativo e carregue as gotículas. (B) Posicione a placa de tampa. (C) Monte a caixa de ímãs, aperte as travas e gire o estágio 180°. (D) O ímã automatizado está apontando para baixo. Inspecione a posição e a forma das gotículas, verifique se os pinos da placa de circuito impresso (PCB) estão alinhados com os contatos do chip EWOD, conecte o fotodetector e coloque-o no slot do fotodetector. Depois de conectar a eletrônica de controle a um computador, o sistema está pronto para executar o ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 3: Uso repetitivo das placas de atuação e o impacto na tensão de atuação. A velocidade média de uma gotícula do buffer de corrida é traçada em função da tensão de atuação (círculos azuis) e o desvio padrão de três medidas independentes (N = 3). Aqui o número de ensaios por placa (barras cinzas) indica deterioração aprimorada da superfície em tensões mais altas. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 4: Diagrama dos imunoensaios testados com EWOD. Cada círculo neste diagrama representa um volume de 2,5 μL carregado no chip EWOD. O primeiro protocolo (do lado esquerdo) mostra oito LUOs usando conjugado anticorpo pré-misturado; enquanto, enquanto, o segundo protocolo abrange dez LUOs, adicionando separadamente o anticorpo de detecção biotinylated, extração de contas e vinculação consecutiva da conjugada Neutravidin-HRP. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 5: Extração de tala magnética. Este processo é dividido em (a-c) atuando a gotícula com as contas magnéticas suspensas para o local de separação magnética no meio da zona de mistura (almofada nº 33), (d, e) o ímã está se movendo em posição focando as contas, (f, g, h) contas são mantidas no lugar pela força magnética enquanto a gotícula é acionada pela EWOD em direção à almofada de resíduo (nº 41). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 6: Sequência completa de imunoensaios usando EWOD, mostrando os reagentes, carregamento de amostras e operações de unidade de laboratório. Cada linha contém uma sequência de imagens de amostra das operações características em uma gotícula. As operações são divididas em colunas. A mistura não é realizada para as contas em suspensão, apresentada por uma linha preta quebrada. As direções de gotículas são indicadas por setas azuis, as contas são destacadas em uma das imagens por uma seta laranja. A caixa cinza (canto inferior direito) separa as duas imagens que representam movimento e posição na área de detecção, o círculo de linha quebrada destaca a área de detecção. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figura 7: Curvas de calibração de imunoensaios realizados no chip EWOD com a plataforma DMF. Como relatado anteriormente⁶ as tensões de saída (mV) versus concentrações são mostradas para: (A) Albumina de soro humano, que é usado para estudar o efeito da concentração de anticorpos conjugados [C] e o tempo de incubação, t_inc, medido a partir da mistura das contas com analyte conhecido até a extração LUO, (B) B. atrophaeus (BG) esporos mostrando a reprodutibilidade do imunoensaio, (C) bacteriophage imunoensaio, e (D) protocolo ten-LuOs para resultados E. coli. Abreviaturas: unidades de formação de colônias (cfu), unidades de formação de placas (pfu), número de experimentos independentes (N), operação de unidade de laboratório (LUO). Figura modificada a partir da publicação anterior⁶. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Arquivo Suplementar 1: Sequência completa para executar a plataforma DMF para ensaio ELISA automatizado com Neutravidin-HRP como conjugado. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: A GUI para a medição da quimioriedade e um exemplo de uma medição com o software são mostrados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O protocolo de imunoensaio EWOD é flexível e pode incluir um número diversificado de operações de unidade de laboratório (por exemplo, capturar antígeno, mistura, incubação, extração de contas, lavagem) dependendo do tipo de reagente, estabilidade e requisitos de uso definidos pelo protocolo de ensaio. Como prova de princípio, no artigo atual, dois protocolos de imunoensaio são considerados mostrando a implementação de oito ou dez LUOs (Figura 4) com o chip EWOD descrito. Tal miniaturização merece do microlitro, volumes discretos de reagentes/analyte que aumentam a eficácia da ELISA, reduzindo tanto o consumo de reagentes, o tempo exigido por operação, essencialmente, o tempo experimental total (6 a 10 min). Além disso, o ensaio é automatizado com manipulação cronometrada das gotículas que diminui variações e melhora a precisão do imunoensaio¹⁷. Em seu formato atual, o experimento envolve o manuseio manual de gotículas no início de cada ensaio, o que é um ponto para uma discussão mais aprofundada na próxima seção.

Um passo crítico no método DMF atual é dispensar as gotículas na superfície do chip EWOD. Normalmente, uma micropipette com uma dica descartável é usada para medir o volume exato e carregá-la. No entanto, pode se tornar desafiador imobilizar a gotícula na superfície hidrofóbica da placa de atuação devido às interações entre a gotícula e a superfície carregada da ponta descartável. Como resultado, a gotícula pode disparar seguindo a superfície externa da ponta em vez de permanecer na placa. Para evitar isso, a micropipette deve ser mantida em posição vertical, perpendicular à superfície do chip, sem tocá-la, então a gotícula pode ser dispensada na almofada de carregamento, trazendo-a em contato com a superfície. Se a gota ficar com a ponta da pipeta, devolvê-la à solução de ações, trocar a ponta e redepositar uma gota fresca. Em um desenvolvimento adicional do atual sistema de prova de conceito, a entrega automática de gotículas pode ser prevista.

Outro passo crítico, antes de executar o ensaio, é fechar a tampa do conjunto da placa paralela. Como dito anteriormente no protocolo, a tampa deve ser deslizada em cima da placa de atuação. A superfície hidrofóbica da tampa evita a distorção e o deslocamento das gotículas sentadas na placa de atuação. Para garantir o movimento suave da gotícula, é altamente recomendável usar placa de atuação imaculada, carregamento correto das gotículas e montagem de chip. A reutilização das placas de atuação é possível; no entanto, o número de ciclos depende das tensões de atuação(Figura 3) e do depoimento analyte/reagente na superfície, também conhecido como biofouling. A plataforma apresentada utilizou chip EWOD estampado cromado, que poderia ser reutilizado de forma confiável para medições consecutivas até quatro vezes na tensão operacional de 120 V e limpeza de placas intermediárias após cada experimento. As placas foram recicladas, para reduzir o custo por experimento, descontaminando (escovando a superfície com agente de limpeza não diluído antes de enxaguar completamente) o revestimento fluoropolímero amorfo biofado(Tabela de Materiais)revestimento e revestimento de giro um fresco em cima da placa. No entanto, a reciclagem de placas de atuação requer manuseio manual, reagentes caros (fluoropolímeros amorfos (Tabela de Materiais))e equipamentos especializados (spin-coater). Chips EWOD alternativos são investigados com sucesso com substratos econômicos, como papel^19,filmes de acetato ou placas de circuito impresso (PCBs)^20,21. Tais materiais descartáveis podem facilitar o uso confiável e acessível da plataforma DMF e podem fornecer meios para evitar a questão da biofouling.

A biofouling é a principal limitação do EWOD para aplicações biológicas^22,23. Estudos anteriores sobre dmf identificaram dois mecanismos que contribuem para a biofouling, ou seja, adsorção passiva devido a interações hidrofóbicas, e uma adsorção eletrostática se manifestando quando um campo elétrico é aplicado²⁴. Os achados do artigo atual são consistentes com essa teoria, pois foi documentado que a reutilização da placa de atuação diminui em altas tensões de atuação. Uma possível explicação é que as proteínas adsorb prontamente em superfícies revestidas de Fluoropolímero (semelhante saque-like) e agregam mais rápido em falta em comparação com superfícies intocadas²⁴. Como consequência, ensaios relacionados à proteína no DMF são difíceis de quantificar e podem experimentar perda de anestesia, contaminação cruzada e precisão reduzida¹⁷. O pior cenário é quando uma quantidade crítica de adsorjos proteicos, tornando assim o dispositivo inútil. Para minimizar a biofalta, várias abordagens têm sido investigadas desde a minimização do tempo de residência da gotícula no chip, passando por revestimentos^23,até aditivos (ou seja, surfactantes ou ácido plurônico) nas gotículas carregadas de biomaterial^6,22. Portanto, um aspecto importante do ensaio imunoensaio no EWOD é escolher estratégias anti-biofouling compatíveis com o protocolo específico em questão.

A plataforma automatizada DMF foi projetada para realizar um único teste ELISA de sanduíche por corrida, usando volumes de microlitros para reagentes e analyte. Quando é necessário, os kits convencionais de sanduíche ELISA existem com base em placas pré-revestidas de 96 poços ou 384 poços que, em combinação com equipamentos de laboratório auxiliar, resultam em maior rendimento por corrida; com base apenas no preço dos reagentes, o custo aproximado por ensaio/bem é de 6,04 USD (580 USD/96) e 0,33 USD (2×580 USD/384), respectivamente. Isso torna os métodos convencionais da ELISA ideais para um grande número de amostras processadas tipicamente por pessoal técnico treinado em instalações de laboratório centralizadas. No entanto, em locais remotos, a análise detalhada de custos da ELISA para monitoramento ambiental mostrou que quando os custos de capital (ou seja, custos operacionais laboratoriais, custos recorrentes, transporte amostral, suprimentos e pessoal) foram incluídos o preço real por ELISA foi de 60 USD dos quais 34 USD foram para suprimentos por amostra²⁵. Em contraste, a plataforma DMF proposta é portátil, requer treinamento mínimo para operar e com contas pré-revestidas podem fornecer análise de amostra a resposta em minutos. Assim, a tecnologia apresentada pode ser implantada em locais de ponto de necessidade e complementar análises de outra forma disponíveis em laboratórios centralizados.

Na seção de resultados representativos, a plataforma automatizada de imunoensaio dMF foi utilizada para detecção direta de patógenos para aplicação de defesa. Outras aplicações possíveis para a plataforma DMF abrangem, mas não se limitam a, biodiagnóstico, monitoramento contínuo e amostragem automatizada. Potencialmente, o DMF poderia impactar diversos setores do ponto de atendimento à saúde personalizada, bem como monitoramento ambiental controlado para a proteção de pacientes da Infecção Adquirida Hospitalar Aerotransportada, ao sistema de monitoramento de culturas para agricultura e produção de alimentos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido etanossulfônico, HEPES	Sigma-Aldrich	H9897
Albumina sérica anti-humana [15C7]	Abcam	ab10241
Albumina sérica anti-humana [1A9] (HRP)	Abcam	ab24438
B. atrophaeus (BG) esporos	Dstl, Reino Unido	N/a
Rb biotinilado anti-BG policlonal	Dstl, Reino Unido	N/ a
Rb biotinilado anti-E. coli MRE 162 Dstl policlonal	, Reino Unido	N/a
Rb biotinilado anti-MS2 policlonal	Dstl, Reino Unido	N/a
Bloqueador de caseína	Thermo Scientific	TFS 37582
Serra de corte em cubos/corte CNC	MTI Corp, EUA	SYJ-400
Cytop	AGC, Japão	CTL-809M	Fluoropolímeros amorfos. Este é um revestimento de dois componentes.
E. coli MRE 162	Dstl, Reino Unido	N/a
Cabra anti-MS2 policlonal	Dstl, Reino Unido	N/a
Fotodiodo Hamamatsu	Hamamatsu, Japão	S9270
Ácido clorídrico (32%)	Sigma-Aldrich	W530574
Serviço de fabricação de máscaras	Compugraphics, Escócia, Reino Unido	N/a
MS2 virus	Dstl, Reino Unido	N/A
Parylene-C, DPX-C	Sistema de Revestimento Especial, EUA	Nº CAS: 28804-46-8
Kit Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP	Thermo Scientific	88828	Contém todos os tampões e reagentes necessários para a imobilização enzimática. Armazene a 4 ° C.
Rb anti-BG policlonal	Dstl, Reino Unido	N/a
Rb anti-E. coli MRE 162 policlonal	Dstl, Reino Unido	N/a
Proteína de albumina sérica humana recombinante, HAS	Abcam	ab201876
SCS Sistema de Deposição de Parileno	Sistema de Revestimento Especial, EUA	2010
Bolacha de silício, 4'', tipo p, < 100>, 1– 10 e ômega; cm	Pi Kem Ltd	N/a
Spin Coater	SÜ SS MicroTec AG, Alemanha
SuperSignal ELISA Femto Substrato de Sensibilidade Máxima	Thermo Scientific	37075	Contém 50 mL de soluções de Luminol/Intensificador e Peróxido Estável. Armazene a 4 ° C.
Tween 80	Thermo Scientific	28328	O fabricante é a Solução Detergente Surfact-Amps.