ここで提示するプロトコルは、修飾コラゲ素灌流技術を用いた成体マウス肝臓からのマウス肝細胞の単離のためのプロトコルである。また、3Dコラーゲンサンドイッチ設定における肝細胞の長期培養と、胆道形成および治療に対する応答を研究するための細胞骨格成分の免疫標識についても説明する。
肝細胞は、その代謝機能を担当する肝臓の中心的な細胞です。.このように、それらは、2つ以上の肝細胞が胆汁が分泌される胆管ネットワークを形成するために上皮膜を寄与するユニークな偏光上皮を形成する。肝細胞偏光は正しい運河形成に不可欠であり、肝細胞細胞骨格、細胞間接触、および細胞外マトリックスとの相互作用に依存する。カナリキュリ形成における肝細胞細胞骨格の関与とその病理学的状況への応答のインビトロ研究は、生体内のカナリクリネットワーク構造によく似た細胞培養の欠如によって障害を受ける。ここで説明するプロトコルは、修飾コラゲアゲ症灌流技術を用いて成体マウス肝臓からマウス肝細胞を単離するためのプロトコルである。また、胆道の形成とインビトロでの治療に対する応答を研究するために細胞骨格成分の免疫標識に使用される3Dコラーゲンサンドイッチ設定での培養の生産についても説明する。肝細胞3Dコラーゲンサンドイッチ培養は、毒素(エタノール)またはアクチン細胞骨格変化薬(例えば、ブレビスタチン)による治療に反応し、胆汁カナリクリの形成と機能のインビトロ研究のための貴重なツールとして機能することが示されています。
肝細胞は、その代謝機能を担う肝臓の中央細胞構造であり、独特に偏光上皮細胞である。出生直後に哺乳類に出現する偏光は、胆道管ネットワークの形成をもたらし、適切な胆汁分泌に不可欠である。肝細胞のアピカル膜は胆汁カナリクリをまとめて形成するのに対し、基底膜はシヌソイドの内皮と接触したままである。肝細胞偏光の喪失は胆汁トランスポーターの再分配につながり、肝臓における胆汁保持に関連する病理学的プロセス(すなわち、胆汁うっ血症)をもたらす。
肝細胞偏光の確立と維持と胆胆カナリアクリの発達は複雑なメカニズムを伴う。基礎となるプロセスは、肝細胞細胞骨格間の集合的な相互作用、細胞間接触、および細胞外マトリックス1との相互作用に依存する。肝細胞細胞骨格は、3つのフィラメントネットワーク、アクチン細胞骨格、微小管、および中間フィラメントで構成され、運河形成の構造的支持を提供します。胆管ネットワークの再生および維持における細胞骨格成分の微分的役割は、3Dコラーゲンサンドイッチ肝細胞培養におけるインビトロ2において以前に例示されている。
アクチン微小フィラメントおよび微小管は、カナリクルス第2世代の部位における肝細胞膜偏光の初期段階において重要である。アクチン細胞骨格は、胆汁カナリクリの構造および機能を確立し、膜関連マイクロフィラメントおよび円周環を形成し、従って運河構造を支持し、アクチン細胞骨格をタイトで付着した接合部3に挿入する。アクチン細胞骨格外のケラチン中間フィラメントの環は、運河構造3をさらに安定化させる。
胆汁カナリクリアーキテクチャの組織における肝細胞接合複合体におけるタンパク質の重要性は、いくつかのノックアウトマウスモデルにおいて十分に文書化されており、接合タンパク質4、5、6の両方を欠くマウスにおいて歪んだカナリキュリを示す。付着部接合タンパク質α-カテニンの欠失は、肝細胞アクチン細胞骨格の崩壊、胆管内腔の膨張、漏れやすい接合、およびコレスタティック表現型4に効果的に導することが示されている。また、in vitro研究は、肝細胞アピカルルーメンおよびタンパク質密入7の改造においてE-カドヘリンおよびβカテニンを接着する接合成分の重要性を示している。
顕著に、主要なケラチンオーガナイザーである細胞骨格架橋タンパクチンのアブレーションは、アクチン細胞骨格8に関連するものに匹敵する表現型を明らかにした。これは、運河構造の支持におけるケラチン中間フィラメントの重要な役割を示唆している。3D肝細胞コラーゲンサンドイッチを利用したインビトロ研究では、胆道ネットワーク形成におけるAMP活性化プロテインキナーゼおよびその上流活性化剤LKB1の重要性も示されている。これらの知見は、その後の生体内研究10、11によってさらに確認された。従って、肝細胞偏光、適切な管ネットワーク形成、胆汁分泌の確立に関与するシグナル伝達過程の理解を深めるために、インビトロ研究が必要であることが明らかになりました。
胆道形成に関連するプロセスとインビトロの病理学的状況に対する応答を研究する際の大きな課題は、生体内12の状況によく似た細胞培養条件を使用することです。単離されたばかりの原発性肝細胞は偏光しない。したがって、それらは、2D培養条件下で機能性、形態、および機能的胆汁カナリクリ(例えば、遺伝子調節の変化、偏光、および脱分化13、14、15)を失う。この事実にもかかわらず、新鮮に単離された肝細胞は、生体内の肝臓の性質を最も密接に反映し、肝臓由来細胞株16とは異なり。過去に使用されてきたにもかかわらず、不死化細胞株は肝細胞の上皮様特徴的形態を発揮せず、これらの細胞によって形成される胆管管ルーメンは肝臓カナリクリに似ていない7.近年、原発性肝細胞の3D培養は、マウスとラットの両方から、インビトロ9における胆道ネットワーク形成に関与するプロセスを調べるのに有用なツールとなっている。コラーゲンの2層間で培養された原発性肝細胞(3Dコラーゲンサンドイッチ培養と称する)は、数日で再分極化することができる。3Dコラーゲンサンドイッチでマウス肝細胞を培養する際に必要な技術需要が高いため、胆道形成時の細胞骨格成分の関与を特徴付けるために、3Dコラーゲンサンドイッチに埋め込まれたマウス肝細胞を分離、育成、免疫標識する複雑なプロトコルを提示します。
マウス原発性肝細胞培養物の使用は、肝細胞偏光、適切な運河構造形成、胆汁分泌の確立に関与するシグナル伝達プロセスをよりよく理解するために、in vitro研究において重要です。2D培養におけるマウス原発性肝細胞の単離および長期培養における課題は、単離細胞の分離効果と寿命を高め、それぞれにいくつかの利点を有するいくつかの技術的アプローチの発明を推進してきた。欠点。原発性肝細胞の2D培養は、短期間の肝生物学の限られた数の属性のみを模倣することが広く受け入れられている。したがって、コラーゲンサンドイッチ配置における3D培養は、2D条件を広く置き換え、特に肝臓生物学における細胞骨格の機能に着目した場合(例えば、胆汁輸送の有毒な薬物効果または空間的組織)である。
1980年代以降、様々な改変を伴うマウス肝細胞の単離のためのいくつかのプロトコルが記載されている。2段階コラゲラゲアゼ灌流アプローチは、多くの研究室で広く使用されるようになった。分離プロトコルに勾配遠心分離を加えると、死細胞19、20の除去が可能となり、生存細胞の数が大幅に増加する(ここでは、日常的に〜93%)。このステップは、細胞の取り扱い時間を延長し、細胞数21を減少させるが、このステップは、適切な胆管ネットワーク形成のための3Dコラーゲンサンドイッチ培養において必要と見なされる。さらに、灌流工程の間に迅速かつ正確に進むことがより重要であり、細胞の処理時間を短縮します。
細胞の生存率を高め、3Dで運河ネットワークを形成する能力を高める他の重要な要因は、新たに調製された溶液の使用と灌流中の気泡の回避です。したがって、溶液はマウス肝細胞単離の日に調製する必要があり、溶液を変更する際に蠕動ポンプとチューブをチェックする必要があります。プロトコルが密接に従う場合、原発性肝細胞の単離は、生存可能な細胞の高収率で成功する必要があります。
長期3D肝細胞培養におけるもう一つの重要な要因は、使用される原発性肝細胞の初期供給源である。肝細胞の最適なドナーとして機能する生後8~12週の動物を使用することが重要です。これらの肝細胞は形態をより頻繁に変化させ、脱分極し、運河ネットワークを形成しなくなったため、古い動物からの肝細胞の使用は長期培養では成功しなかった。また、比較的濃縮された溶液から形成された適切に中和されたコラーゲンゲル上の肝細胞のめっきは重要なステップである。ほとんどのプロトコルでは、約1mg/mLの濃度が使用されます。多くの最適化の後、1.5 mg/mLの濃度は長期肝細胞の培養に最適であり、形成された胆汁カナリアキュリと高度に組織化された肝細胞を提供する。
このわかりやすいプロトコルは、一次マウス肝細胞の長期培養を可能にします。代表的な結果は、胆汁カナリキュリ形成における細胞骨格成分の役割を研究する際に、3D培養した一次マウス肝細胞に対する広範な使用を実証する。
The authors have nothing to disclose.
この作品はチェコの補助金機関(18-02699S)によってサポートされました。チェコ共和国保健省補助金機関(17-31538A);チェコ科学アカデミー(RVO 68378050)およびMEYS CRプロジェクト(LQ1604 NPU II、 LTC17063、LM2015040、OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395、および OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775;チャールズ大学(英国に個人的な奨学金)、および運営プログラムプラハ競争力プロジェクト(CZ.2.16/3.1.00/21547)。我々は、光顕微鏡の中心施設、IMG CAS、プラハ、チェコ共和国(サポートされたMEYS CRプロジェクトLM2015062およびLO1419)が提示された顕微鏡画像によるサポートを認めます。
35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
EGTA | ROTH | 3054.2 | |
FBS | Gibco | 10270-106 | |
Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
Glycine | Pufferan | G 05104 | |
Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Water bath | Nuve | NB 9 | |
Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
Zoletil | Vibrac | VET00083 |