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Isolamento e cultura sanduíche de colágeno 3D de hepatócitos de camundongos primários para estudar o papel do citoesqueleto na formação bile canalicular in vitro

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DOI:

10.3791/60507

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20 de dezembro de 2019

 ,  ,  , 
1Laboratory of Integrative Biology, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento de hepatócitos de camundongos de fígados de camundongos adultos usando uma técnica de perfusão de colagem modificada. Também é descrita a cultura de longo prazo dos hepatócitos em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D, bem como imunorotulagem dos componentes citoesqueléticos para estudar a formação canalicular biliar e sua resposta ao tratamento.

Resumo

Hepatócitos são as células centrais do fígado responsável por sua função metabólica. Como tal, eles formam um epitélio exclusivamente polarizado, no qual dois ou mais hepatócitos contribuem com membranas apical para formar uma rede canalicular biliar através da qual a bile é secretada. A polarização hepatocito é essencial para a formação canalicular correta e depende das interações entre o citoesqueleto de hepatocito, contatos celulares e a matriz extracelular. Estudos in vitro sobre o envolvimento do citoesqueleto de hepatocito na formação de canaliculi e sua resposta a situações patológicas são prejudicados pela falta de cultura celular, que se assemelharia à estrutura da rede canaliculi in vivo. Descrito aqui é um protocolo para o isolamento de hepatócitos de camundongos do fígado de rato adulto usando uma técnica de perfusão de colagem modificada. Também descrita é a produção de cultura em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D, que é usado para imunorotulagem de componentes citoesqueléticos para estudar a formação canalicular biliar e sua resposta aos tratamentos in vitro. Mostra-se que as culturas hepatocitos de sanduíche de colágeno 3D respondem a tratamentos com toxinas (etanol) ou citoesqueleto de actina alterando drogas (por exemplo, blebbistatin) e servem como uma ferramenta valiosa para estudos in vitro de formação e função de canaliculi biliares.

Introdução

Hepatócitos, as estruturas celulares centrais do fígado que são responsáveis por suas funções metabólicas, são células epiteliais exclusivamente polarizadas. Sua polarização, aparecendo em mamíferos logo após o nascimento, resulta na formação da rede canalicular biliar e é essencial para a secreção biliar de bile. Membranas apical de hepatócitos formam coletivamente canaliciuli biliares, enquanto membranas basais permanecem em contato com o endotelio dos sinusoides. A perda da polarização hepatocito leva à redistribuição de transportadores biliares e resulta em processos patológicos conectados à retenção biliar no fígado (ou seja, cholestasis).

O estabelecimento e a manutenção da polarização hepatocto e o desenvolvimento de canaliculi biliares implicam mecanismos complexos. Os processos subjacentes dependem da interação coletiva entre o citoesqueleto hepatocito, contatos celulares e interações com a matriz extracelular1. O citoesqueleto hepatocito consiste em todas as três redes de filamento, o citoesqueleto actina, microtúbulos e filamentos intermediários, que fornecem suporte estrutural para a formação canalicular. O papel diferencial dos componentes citoesqueléticos na regeneração e manutenção de redes canaliculares biliares foi previamente ilustrado in vitro em culturas hepatocitos de colágeno-sanduíche 3D2.

Microfilamentos actinas e microtúbulos são importantes durante os estágios iniciais de polarização da membrana hepatócito nos locais da geração canaliculus2. O citoesqueleto de actina estabelece a estrutura e função dos canaliculi biliares, formando microfilamentos associados à membrana e o anel circumferential, apoiando assim a arquitetura canalicular e inserindo o citoesqueleto de actina em junções apertadas e aderem3. O anel de filamentos intermediários de queratina fora do citoesqueleto actina estabiliza ainda mais a estrutura canalicular3.

A importância das proteínas nos complexos juncionais de hepatócitos na organização da arquitetura de canaliculi biliar tem sido bem documentada em vários modelos de camundongos knock-out, que mostram canaliculi distorcidos em camundongos sem proteínas juncionais apertadas e/ou aderentes4,5,6. A exclusão da proteína de junção aderentes α-catenin tem sido mostrado para levar à desorganização do citoesqueleto hepatocito actina, dilatação de lúmens canaliculares biliares, junções apertadas gotejante, e efetivamente a um fenótipo cholestática4. Além disso, estudos in vitro têm mostrado a importância dos componentes de junção aderentes E-cadherin e β-catenina na remodelação do lúmen afalco hepatocelular e tráfico deproteínas 7.

Surpreendentemente, a ablação do citoesqueleto crosslinking proteína plectina, que é o principal organizador de queratina, revelou fenótipos comparáveis aos ligados à actina citoesqueleto8. Isso sugere um papel crítico dos filamentos intermediários de queratina no suporte da estrutura canalicular. Estudos in vitro utilizando sanduíches de colágeno hepatócito 3D também mostraram a importância da proteína kinase ativada por AMP e seu ativador upstream LKB1 na formação de rede canalicular biliar9. Estes resultados foram confirmados então mais por estudos in vivo subseqüentes10,11. Assim, tornou-se claro que estudos in vitro são necessários para promover a compreensão dos processos de sinalização envolvidos no estabelecimento da polarização hepatocito, formação adequada da rede canalicular e secreção biliar.

Um grande desafio no estudo de processos conectados com a formação canalicular biliar e sua resposta a situações patológicas in vitro é o uso de condições de cultura celular que se assemelham à situação in vivo12. Os hepatócitos primários recém-isolados não são polarizados; assim, perdem sua função, morfologia e canaliculi bile funcional em condições de cultura 2D (por exemplo, mudanças na regulação gênica, polarização e desdiferenciação13,14,15). Apesar deste fato, hepatócitos recém-isolados refletem mais de perto a natureza do fígado in vivo, ao contrário das linhas celulares derivadas do fígado16. Mesmo que tenham sido usados no passado, as linhas celulares imortalizadas não exercem a morfologia característica epiteliana dos hepatócitos, e os lúmens canaliculares biliares formados por essas células se assemelham a canaliculi hepáticos mal7. Recentemente, culturas 3D de hepatócitos primários, de camundongos e ratos, tornaram-se uma ferramenta útil para investigar processos envolvidos na formação de rede canalicular biliar in vitro9. Hepatócitos primários cultivados entre duas camadas de colágeno (referido como uma cultura de sanduíche de colágeno 3D) podem repolarizar em vários dias. Por causa das altas demandas técnicas necessárias ao cultivar hepatócitos de camundongos em sanduíches de colágeno 3D, aqui apresentamos um protocolo complexo para isolar, cultivar e imunorótulo hepatócitos de camundongos embutidos em sanduíches de colágeno 3D, a fim de caracterizar o envolvimento de componentes citosqueléticos durante a formação canalicular biliar.

Protocolo

Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com a Diretiva Europeia 2010/63/UE e foram aprovadas pela Comissão Central Checa para o Bem-Estar Animal.

1. Materiais

  1. Animais domésticos em condições específicas livres de patógenos de acordo com as diretrizes da Federação de Associações de Ciência Animal de Laboratório com livre acesso a ração regular e água potável. Animais da casa um ciclo escuro/claro de 12 h/12 h. Para o isolamento e a cultura hepatocitos, use animais de 8 a 12 semanas de idade.
  2. Soluções de ações A e B
    1. Prepare a solução de estoque A e a solução de estoque B de acordo com a Tabela 1 e a Tabela 2,respectivamente, com antecedência. Dissolva todos os componentes em 1 L de H2O destilado (dH2O).
    2. Ajuste o pH das soluções para 7,2 e filtre as soluções através de um filtro de 0,2 μm. Ambas as soluções podem ser armazenadas a 4 °C por até 6 meses.
  3. Solução de ações C
    1. Prepare a solução C no dia do isolamento primário de hepatócitos.
    2. Adicione todos os componentes de acordo com a Tabela 3, preencha um volume total de 50 mL com dH2O e dissolva-se. Ajuste o pH para 7,3.
    3. Aliquot 50 mL da solução em tubos de 50 mL. Use um tubo por animal. Coloque todos os alíquos necessários em um banho de água pré-aquecido (37 °C).
  4. Solução de ações D
    1. Prepare a solução D no dia do isolamento primário de hepatócitos.
    2. Adicione todos os componentes de acordo com a Tabela 4,preencha para um volume total de 30 mL com dH2O, e dissolva. Ajuste o pH para 7,3.
    3. Aliquot 30 mL da solução em tubos de 50 mL. Adicione a colagem I (5 mg/30 mL) na solução D. Use um alíquo por animal. Coloque todos os alíquos em um banho de água pré-aquecido (37 °C).
  5. Solução de ações E
    1. Prepare a solução E no dia do isolamento primário de hepatócitos.
    2. Adicione todos os componentes de acordo com a Tabela 5, preencha um volume total de 50 mL com dH2O e dissolva-se. Ajuste o pH para 7,3.
    3. Aliquot 50 mL da solução em tubos de 50 mL. Adicione albumina V (0,65 g/50 mL) na solução E. Use um alíquo por animal. Coloque todos os alíquos em um banho de água pré-aquecido (37 °C).

2. Preparação de sanduíches de colágeno

  1. Um dia antes do isolamento primário de hepatócitos, prepare a primeira camada do sanduíche de colágeno I.
    NOTA: Trabalhe no gelo e use soluções pré-refrigeradas, pontas, placas e tubos para minimizar a gelação indesejada de colágeno I.
  2. Neutralizar a quantidade necessária de colágeno I (de rabo de rato) de acordo com o protocolo do fabricante. É necessário um volume de 100 μL de colágeno neutralizado (1,5 mg/mL) por amostra experimental (prato de 3,5 cm). Para preparar 1 mL de colágeno neutralizado (1,5 mg/mL), adicione 100 μL de 10x DMEM, 1,5 μL de 1M NaOH e 48,5 μL de dH2O em 500 μL de colágeno (concentração de estoque = 3 mg/mL). Verifique o pH de colágeno neutralizado com papel decisivo (o pH deve ser ~ 7,5).
  3. Disperse 100 μL de solução de colágeno neutralizada uniformemente usando uma ponta pré-refrigerada de 200 μL sobre a superfície de um prato de 3,5 cm montado no gelo.
  4. Incubar durante a noite condições de cultura padrão (incubadora com 5% CO2 a 37 °C). No dia do isolamento primário de hepatócitos, adicione 1 mL de PBS pré-aquecido (37 °C) à primeira camada de colágeno. Deixe o colágeno para reidratar por 2-3 h a 37 °C.

3. Equipamento criado

  1. Prepare todos os equipamentos listados na Tabela de Materiais e configurado como mostrado na Figura 1.

4. Procedimento cirúrgico

  1. Anestesie o camundongo por injeção intramuscular de tiletamina (60 mg/kg de peso corporal), zolazepam (60 mg/kg) e xilazine (4,5 mg/kg). Após diversos minutos, confirme a anestesia apropriada pela pitada do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo do dedo. Se o animal não responder à pitada, prossiga para 4.2.
  2. Coloque o mouse anestesiado em um tapete de dissecação e fita as extremidades inferiores e superiores para corrigir o mouse em uma posição supina. Cotonete o abdômen com 70% de etanol e abra o abdômen com uma incisão em forma de V da área púbica para as pernas dianteiras. Dobre a pele sobre o peito para descobrir a cavidade abdominal. Coloque o esteira dissecando um microscópio dissecando.
  3. Dobre uma agulha de seringa de insulina (30 G) a um ângulo de 45°. Expor a veia cava inferior (IVC), movendo os intestinos e cólon na direção caudal.
  4. Preencha 2,5 mL de solução pré-aquecida (37 °C) C em uma seringa de 2 mL com uma cânula. Certifique-se de que não há bolhas de ar na cânula ou seringa.
  5. Antes da cannulação do IVC, reposicione os lobos do fígado pressionando-os até o diafragma com um cotonete de algodão molhado (PBS). Coloque uma sutura de seda em torno do IVC logo abaixo do fígado (Figura 2A,B).
  6. Injete 10 μL de heparina (5000 U/mL) na veia portal usando uma seringa de insulina com uma agulha de 30 G dobrada em um ângulo de 45° (Figura 2C).
  7. Para cannular o fígado, faça uma pequena incisão com uma tesoura microcirúrgica no IVC diretamente ao lado do fígado (abaixo da sutura; Figura 2D)que é grande o suficiente para inserir a cânula. Fixar a cânula na posição usando suturas e dois nós cirúrgicos (Figura 2E).
  8. Corte a veia portal(Figura 2F)para permitir que os buffers de perfusão fluam para fora do fígado para evitar a expansão do fígado.
  9. Perfundir manualmente o fígado com 1,5 mL de solução pré-aquecida C, pressionando lentamente a seringa conectada à cânula (isso deve levar ~ 15 s). A remoção do sangue do fígado por descoloração do fígado agora pode ser observada.
  10. Pré-preencher uma bomba peristaltic com pré-aquecido (37 °C) solução C. Verifique o aparelho de perfusão e garantir que não há bolhas de ar no sistema.
  11. Desligue cautelosamente a cânula da seringa e conecte-a à tubulação da bomba peristáltica que funciona na taxa de fluxo de 2.5 mL/min. Trabalhe rapidamente mas com cuidado e assegure-se de que a cânula permaneça na posição e que nenhuma bolha entre na tubulação ou na cânula.
  12. Perfuse o fígado com a solução C para 2 min (5 mL da solução C). Alteração para solução D e continuar a perfusão por um adicional de 10 min (25 mL de solução D).
  13. Uma vez que o fígado foi perfundido, removê-lo da cavidade abdominal. O fígado agora será muito frágil e de cor pálida (Figura 3).

5. Isolamento dos hepatócitos primários

  1. Retire o fígado do rato. A cânula ainda estará ligada ao fígado, então use os fórceps para levantar a cânula com o fígado, e cuidadosamente cortar todas as conexões fáscia. Transfira o fígado para um tubo de 50 mL contendo 20 mL de solução pré-aquecida E.
  2. Segure a cânula com o fígado usando fórceps e dissociar o tecido, esfregando o fígado ao redor da parede do tubo para transferir os hepatócitos isolados em buffer. Mantenha as células isoladas no gelo.
    NOTA: Hepatócitos primários isolados são viáveis por várias horas enquanto mantidos no gelo. Os usuários podem repetir etapas 4.1 a 5.2 isolando hepatocytes preliminares de um outro rato doador, se necessário, ou prosiguem à etapa seguinte.
  3. Coloque um filtro de célula de nylon de 70 μm em cima de um tubo de 50 mL e filtre as células isoladas.
  4. Centrífuga do tubo a 50 x g e 4 °C por 5 min. Aspirar o supernatant. Para remover as células mortas e aumentar a porcentagem de células viáveis, resuspender a pelota em 20 mL de 40% percol em DMEM.
  5. Centrífuga do tubo a 50 x g e 4 °C por 5 min. Aspirar o supernatant contendo células mortas e resuspender a pelota em 20 mL de solução E.
  6. Tubos de centrífuga a 50 x g e 4 °C por 5 min. Aspiram o supernatant e resuspendem a pelota em 10 mL da solução E.
  7. Verifique o rendimento primário de hepatócitoe e viabilidade usando coloração azul trypan. Conte o número celular usando uma câmara de contagem de células Neubauer e ajuste a concentração celular para 3,75 x 105 células viáveis/mL. Mantenha as células no gelo.

6. Cultivo de hepatócitos primários em sanduíches de colágeno 3D

  1. Prepare o meio da cultura hepatocito (CmH). Adicione 15 μL de glucagon (1 mg/mL), 15 μL de hidrocortisona (50 mg/mL) e 40 μL de insulina (10 mg/mL) a 50 mL de média completa (DMEM, alta glicose, 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina).
  2. Disperse uniformemente 2 mL (5 x 105 células/mL) de hepatócitos primários viáveis em um prato pré-revestido de 3,5 cm. Incubar as células com 5% CO2 a 37 °C para 3 h. Importante: Distribuir uniformemente as células, inclinando o prato em todas as direções pouco antes de colocar o prato em incubadora.
  3. Prepare o colágeno neutralizado I (100 μL/3.5 cm de prato; ou seja, um volume suficiente para todos os pratos, conforme descrito acima [passo 2.1]). Mantenha o gelo até usar.
  4. Após 3 h, retire cuidadosamente as células médias e não anexadas e adicione 100 μL de colágeno neutralizado I a cada prato de 3,5 cm para formar a camada superior de sanduíche de colágeno nas células. Incubar o sanduíche de colágeno condições padrão de cultura celular (5% CO2 a 37 °C) por 1 h. Após uma incubação de 1 h, adicione cuidadosamente 2 mL de CMH.
  5. Após 24 h de cultura, mude o meio de CmCm para um fresco.
  6. Cultura por 3-8 dias, dependendo da formação de canaliculi biliares. Verifique a cultura todos os dias um microscópio (Figura 4). Mude o CmH a cada dois dias.

7. Imunorotulagem de hepatócitos primários em sanduíches de colágeno 3D

  1. Retire a mídia dos sanduíches de hepatócito, em seguida, lave cuidadosamente com PBS pré-aquecido. Conserte as culturas sanduíche com 1 mL de 4% de paraformaldeído na PBS por 30 min à temperatura ambiente (RT).
  2. Após a fixação, lave os sanduíches 3x por 10 min em 2 mL de PBS + 0,1% Tween 20 (PBS-T).
  3. Permeabilize as células com 1 mL de 0,1 M glicina, 0,2% Triton X-100 em PBS em RT para 1 h. Wash 3x por 10 min em PBS-T.
  4. Perturbe delicadamente a camada superior de colágeno usando uma ponta de carregamento de 10 μL conectada a uma aspiração de vácuo para garantir a penetração de anticorpos suficientes.
  5. Bloco com 1 mL de 5% BSA em PBS-T (ou seja, solução de bloqueio) para 2 h. Incubar com anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio durante a noite em 37 °C. Lave 3x por 15 min em PBS-T.
  6. Após a lavagem, incubar com anticorpo secundário em 37 °C para 5 h. Lave 3x para 15 min em PBS-T seguido pela lavagem de 1x com H2O destilado.
  7. Monte com meios de montagem anti-fade (veja tabela dos materiais)para a microscopia.

Resultados

Os hepatócitos primários do rato foram isolados e semeados em sanduíches de colágeno 3D. Os canaliculi da bile entre duas pilhas adjacentes começaram dar forma dentro de diversas horas após a semeadura. As células formaram aglomerados e auto-organizado em uma rede aproximadamente regular de canaliculi bile dentro de 1 dia (Figura 4). Dentro de 3-6 dias, aglomerados de 5-10 células eram geralmente observados, com hepatócitos totalmente polarizados formando uma rede canalicular (Figura 4).

Tratamento de hepatócitos de camundongos primários em sanduíches de colágeno 3D com toxina (etanol) ou drogas que alteram citoesqueleto (por exemplo, blebbistatin, ácido okadaico) resultou em mudanças no citoesqueleto hepatocito, largura canaliculi, forma e número de canalículos biliares ilustrados pela imunorotulagem com um anticorpo para queratina 8 (a queratina mais abundante em hepatócitos), faloide (visualização de F-actina) e anticorpos para a junção apertada de proteína zonula ocludens-1 (ZO-1; Figura 5).

O tratamento com etanol teve apenas um efeito leve na organização da queratina 8; no entanto, aumentou a tortuosidade (como visto a partir de manchas f-actina) e distribuição de larguras canaliculares biliais (Figura 5). A intensidade do sinal da coloração ZO-1 foi diminuída em canaliculi biliares tratados com etanol em comparação com controles não tratados, sugerindo uma perda de junções apertadas após o tratamento do etanol. A inibição da contratilidade da actomiosina com blebbistatin afetou significativamente a forma e o número de canaliculi biliares. A rede canalicular regular foi reorganizada, em comparação com hepatócitos não tratados, em canaliculi biliares desordenados com um aumento da incidência de canalículos de bile arredondados grossos em vez de finos longos (como visto no histograma das larguras canaliculares).

Além disso, o tratamento com ácido okaárico (OA) inibindo a fosfasases afetou fortemente as propriedades físicas das queratinas, como mostrado anteriormente8,17. A OA muda a solubilidade dos filamentos de queratina; assim, o tratamento resultou em profunda reorganização da malha de queratina, que entrou em colapso em grandes agregados perinucleares. Tanto o F-actin quanto a proteína de junção apertada ZO-1 não foram localizados em nenhuma estrutura específica, sugerindo o desaparecimento quase completo de canaliciulis de bile organizados e uma perda completa da polaridade hepatócito. Os restantes canaliculi biliares foram significativamente reduzidos em comparação com controles não tratados, como visto no histograma de largura canalicular (Figura 5).

Para correlacionar observações microscópicas de mudanças no citoesqueleto hepatocito com a resposta bioquímica hepatocelular ao tratamento, o protocolo também mediu os níveis de alanina aminotransferase (ALT) e transaminase de aspartato (AST) (duas enzimas hepáticas que são comumente usadas como marcadores de lesão hepatocelular) em supernatant dos sanduíches de colágeno 3D (Figura 6)18. O tratamento com etanol elevou significativamente os níveis de ALT e AST, sugerindo lesões hepatocelulares graves. O tratamento com blebbistatin não levou a mudanças consideráveis nos níveis de ALT e AST em comparação com o tratamento de ácido okaárico, o que desencadeou mudanças bioquímicas leves com aumento dos níveis de ALT, mas nenhuma mudança nos níveis de AST. Assim, marcadores bioquímicos de lesão hepatocelular medidoin vitro a partir de hepatocito sonoro correlacionante com as alterações citosqueléticas observadas pela imunomancha.

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Figura 1: Configuração experimental. (A)Mouse fixado em uma posição supina, é colocado um microscópio dissecando antes da cirurgia. Todos os instrumentos cirúrgicos necessários são colocados em uma bandeja. (B) A suíte de perfusão durante a perfusão do fígado de rato mostrando tubos de silicone conectando o reservatório com tampão quente e o mouse perfundido. (C)Representação esquemática de B. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Abertura da cavidade abdominal e da cannulação do IVC. O abdômen é aberto com uma incisão em forma de V da área púbica para as pernas dianteiras. A pele é dobrada sobre o peito para expor e ampliar a cavidade abdominal. Para expor o IVC, os intestinos e os dois pontos são cuidadosamente movidos caudally. (A, B) Antes da cannulação do IVC, os lobos do fígado devem ser reposicionados pressionando-os para cima para o diafragma com um cotonete de algodão pbs-wetted. O IVC é então cuidadosamente separado dos tecidos circundantes, e uma sutura de seda é colocada em torno do IVC nas proximidades do fígado. O painel B representa esquemas da cavidade abdominal mostrados no painel A. Os lobos do fígado, intestino, cava de vena inferior (IVC, vermelho) e suturas são indicados. (C)Heparin é injetado na veia portal (PV, seta) com uma seringa de insulina (30 G agulha dobrada no ângulo de 45°). (D)Para acariciar o fígado, o IVC é inciquecido diretamente ao lado do fígado (abaixo da sutura). (E)A cânula é inserida e fixada com suturas amarrando dois nós cirúrgicos. (F)A veia portal é totalmente cortada para permitir a saída de buffer livre, impedindo a expansão do fígado. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Figura 3: Imagens representativas do fígado antes e depois da perfusão. (A, B) O fígado cannulado foi ressecado e perfundido por 12 min a uma taxa de fluxo de 2,5 mL/min. Note o fígado significativamente descolorido após a perfusão (B) em comparação com o fígado recém-ressecado (A). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Figura 4: cultura de sanduíche de colágeno 3D de hepatócitos de camundongos primários. Imagens representativas de campo brilhante de hepatócitos primários de camundongos cultivados por 1, 2 e 3 dias em condições 3D. Note-se que aglomerados maiores de células altamente organizadas são formados após 3 dias na cultura. Áreas encaixotadas mostram imagens ampliadas de ~3x. Pontas de flechas indicam os canalículos biliares. Barra de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Figura 5: Avaliação da resposta morfológica ao estresse tóxico pela microscopia imunofluorescente. Hepatócitos de camundongos primários cultivados em sanduíches de colágeno 3D foram tratados com toxinas (etanol, blebbistatin, ou ácido okadaico) no dia 3 da cultura. As células fixas foram manchadas para visualizar componentes citoesqueléticos: queratina 8 (verde), F-actina (vermelho) e zonula ocludens-1 (ZO-1, magenta) por imunofluorescência. O tratamento tóxico levou à desorganização de componentes citoesqueléticos visualizados, e reduziu o número e aumentou a tortuosidade dos canalicioses biliares. As larguras canaliculares foram medidas em hepatócitos não tratados e tratados e são descritas como histogramas de distribuição de larguras. Pontas de flechas indicam os canalículos biliares. Barra de escala = 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Figura 6: Análise bioquímica da resposta de sanduíches de colágeno hepatócito 3D a lesões tóxicas in vitro. Alt e AST, marcadores bem estabelecidos de lesão hepatocelular, foram medidos em supernatant de sanduíches de colágeno hepatócito 3D tratados com toxinas (etanol, blebbistatin e ácido okadaico). Alt e AST foram elevados em células tratadas em comparação com as não tratadas. Os dados são relatados como meios aritméticos ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Solução de estoque A (10x)
ReagenteConcentração final (g/litro)
Nacl80
Kcl4
MgSO4·7H2O1.97
Na2HPO4·2H2O0.598
KH 2 PO 4 KH2PO4 0.6

Tabela 1: Solução de estoque Uma receita.

Solução b de ações (10x)
ReagenteConcentração final (g/litro)
Nacl69
Kcl3.6
KH 2 PO 4 KH2PO4 1.30
MgSO4·7H2O2.94
CaCl 2 CaCl2 2.772

Tabela 2: Receita de solução B.

Solução C
Reagente
Solução de estoque A (10x)5 mL 5 mL
NaHCO 3 NahCO3 0,1094 g
EGTA EGTA0,0095 g
dH 2 O DH2Opara 50 mL

Tabela 3: Receita de solução c de estoque.

Solução D
Reagente
Solução de ações A (10x)3 mL 3 mL
NaHCO 3 NahCO3 0,065 g
CaCl 2 CaCl2 0,0125 g
dH 2 O DH2Opara 30 mL

Tabela 4: Receita de solução D de estoque.

Solução E
Reagente
Solução de ações B (10x)5 mL 5 mL
NaHCO 3 NahCO3 0,1 g
Glicose0,045 g
dH 2 O DH2Opara 50 mL

Tabela 5: Receita de solução e de estoque.

Discussão

O uso de culturas hepatocitos primárias de camundongos é importante para que estudos in vitro compreendam melhor os processos de sinalização envolvidos no estabelecimento da polarização hepatocito, formação adequada da estrutura canalicular e secreção biliar. Os desafios em isolamento e cultura de longo prazo de hepatócitos primários de camundongos na cultura 2D impulsionaram a invenção de várias abordagens técnicas com maior efetuez a vida do isolamento e longevidade de células isoladas, cada uma com várias vantagens e Desvantagens. Agora é amplamente aceito que as culturas 2D de hepatócitos primários imitam apenas um número limitado de atributos da biologia hepática por um curto período de tempo. Assim, o cultivo 3D em um arranjo sanduíche de colágeno está substituindo amplamente as condições 2D, particularmente quando focada na função do citoesqueleto na biologia hepática (por exemplo, efeitos tóxicos de drogas ou organização espacial do transporte biliar).

Desde a década de 1980, vários protocolos para o isolamento de hepatócitos de camundongos com várias modificações foram descritos. A abordagem de perfusão de colagem em duas etapas tornou-se amplamente utilizada em muitos laboratórios. A adição de centrifugação gradiente no protocolo de isolamento permite a remoção de células mortas19,20 e aumenta significativamente o número de células viáveis (aqui, rotineiramente para ~93%). Mesmo que esta etapa estenda o tempo de manuseio das células e resulte em números celulares reduzidos21,esta etapa é vista como necessária na cultura sanduíche de colágeno 3D para a formação adequada da rede bile canalicular. Além disso, é mais importante proceder de forma rápida e precisa durante as etapas de perfusão, o que encurta o tempo em que as células são manuseadas.

Outros fatores importantes que aumentam a viabilidade das células e sua capacidade de formar redes canaliculares em 3D é o uso de soluções preparadas na hora e evitar bolhas durante a perfusão. Portanto, as soluções devem ser preparadas no dia do isolamento de hepatócitos de camundongos, e a bomba peristáltica e tubulação devem ser verificadas ao mudar de soluções. Se o protocolo for seguido de perto, o isolamento dos hepatócitos primários deve ser bem sucedido com um alto rendimento de células viáveis.

Outro fator crítico na cultura hepatocito 3D de longo prazo é a fonte inicial de hepatócitos primários que são usados. É importante usar animais de 8 a 12 semanas de idade, que servem como doadores ideais de hepatócitos. O uso de hepatócitos de animais mais velhos não foi tão bem sucedido na cultura de longo prazo, já que esses hepatócitos mudaram sua morfologia com mais freqüência, despolarizaram e deixaram de formar redes canaliculares. Além disso, chapeamento hepatócitos em gel de colágeno devidamente neutralizado formado a partir de solução relativamente altamente concentrada é um passo vital. Na maioria dos protocolos, concentrações de cerca de 1 mg/mL são usadas. Depois de muitas otimizações, uma concentração de 1,5 mg/mL é ideal para o cultivo de hepatócitos de longo prazo e fornece hepatócitos altamente organizados com canalículos biliares formados.

Este protocolo fácil de seguir permite o cultivo a longo prazo de hepatócitos de camundongos primários. Os resultados representativos demonstram um amplo espectro de uso para hepatócitos de camundongos primários cultivados em 3D ao estudar o papel dos componentes citoesqueléticos na formação de canaliculi biliares.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Agência de Subvenções da República Checa (18-02699S); Agência de Subvenção do Ministério da Saúde da República Checa (17-31538A); o Projeto de Pesquisa Institucional da Academia Checa de Ciências (RVO 68378050) e os projetos MEYS CR (LQ1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395, e OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775); Universidade Charles (bolsa pessoal para K.K.), e um programa operacional Praga-Competitividade projeto (CZ.2.16/3.1.00/21547). Reconhecemos o Light Microscopy Core Facility, IMG CAS, Praga, República Checa (projetos MEYS CR apoiados LM2015062 e LO1419) para apoio com a imagem de microscopia apresentada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de cultura tratada com TC de 35 mmCorning430165
tubos de centrífuga de 50 mL, SuperClear, Ultra High PerformanceVWR525-0156
70 µ m filtro de células de nylonBiologix15-1070
Albumina Fração VROTH8076.4
Cânula de Arteriotomia (1mm)Medtronic31001
Cloreto de CálcioSigma-AldrichP5655
Colágeno I. da cauda de rato (3mg/ml)Corning354249
Collagenase (de Clostridium Hystolyticum)Sigma-AldrichC5138
D(+) glicose monohidratadaROTH6780.1
Microscópio de dissecaçãoZeissStemi 508
DMEM, glicose altaSigma-AldrichD6429
EGTAROTH3054.2
FBSGibco10270-106
GlucagonSigma-AldrichG-2044
GlicinaPufferanG 05104
Heparina (5000 U/mL)Zentiva8594739026131
HidrocortisonaSigma-AldrichH0888
InsulinaSeringa de Insulina Sigma-AldrichI9278
(30G)BDMedical 320829
Sulfato de Magnésio HeptahidratadoROTHT888.1
pinça microcirúrgicaFST11252-20
pinça microcirúrgicaFST11251-35
tesoura microcirúrgicaFST15025-10
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148
Penicilina-estreptomicinaSigma-AldrichP4333
PercollSigma-AldrichP1644
Minipuls EvolutionGilsonF110701, F110705
Cloreto de potássioROTH6781.1
Fosfato de potássio monobásicoSigma-AldrichP5655
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fischer ScientificP10144
CentrífugarefrigeradaEppendorf5810 R
Óculos de cobertura redondos, 30 mm, espessura 1,5VWR630-2124
Silk braided blackChirmaxEP 0.5 - ndash; USP 7/0
Cloreto de SódioROTH3957.1
Hidrogenocarbonato de SódioSigma-Aldrich30435
Hidróxido de SódioSigma-Aldrich221465
Hidróxido de SódioSigma-AldrichS8045
Fosfato de Sódio Dibásico Di-hidratadoSigma-Aldrich30435
Seringa 2 mlChiranaCH002L
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Banho-mariaNuveNB 9
Filtros de membrana Whatman nylon, tamanho dos poros 0,2 μ m, diam. 47 mmSigma-AldrichWHA7402004
Whatman Papéis indicadores de pH, pH 6,0-8,1GE Healthcare Life Sciences2629-990
ZoletilVibracVET00083
Bomba peristáltica

Referências

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